专利名称：5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因的分离的利记博彩app
5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因的分离技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种来源于深海海洋微生物基因组的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因的分离鉴定，其编码基因为AroA，通过遗传转化的方法，将该基因转入宿主细胞中，使宿主细胞获得耐受草甘膦的能力。本发明涉及该基因的核苷酸序列和氨基酸序列。技术背景
N-膦酰甲基甘氨酸，即草甘膦(glyphosate)，是大家熟知的一种内吸传导型的广谱灭生性除草剂，具有对人和牲畜低毒，在土壤中残留量低，使杂草难以产生抗性等特点，基于这些特点，草甘膦在全世界范围内得到广泛的应用。
草甘膦能够抑制植物或微生物体中芳香族氨基酸合成过程中的一种重要的酶的活性，即5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)，这种酶催化莽草酸途径(shikimatepathway)的倒数第二步，将磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的酰基部分转移到莽草酸三磷酸(shikimate-3-phophate)的第5位轻基形成5_烯醇式莽草酸_3_磷酸(EPSP)和无机磷。由于草甘膦与PEP具有相类似的结构，可形成EPSP合成酶d-P 草甘膦复合物，阻遏PEP与酶的结合，阻断芳香族氨基酸的合成途径，影响了植物的正常代谢，从而杀死绝大多数的植物，杂草和农作物都不例外。因此，为了能够在农作物生长的过程中选择性地除去杂草，农作物就必需获得抗草甘膦的能力(Dill 2005 ；Sun, Li et al.2006)。
目前研究的草甘膦抗性基因AroA主要分为两类(He，Yang et al.2001)。I类AroA基因主要来源于植物或微生物，天然对草甘膦敏感，经改造后能够对一定浓度的草甘膦产生耐受性，但对底物PEP的亲和力会受到影响；11类AroA基因主要来源于根癌农杆菌CP4(Agrobacterium tumefaciens CP4),枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)和假单胞菌属PG.2982 (Pesudomonas sp.)等，对底物PEP有高亲和力，且天然对草甘膦不敏感，这类基因已在生产实践中得到应用(参见美国专利453590，4769061，5094945)。这两类基因序列的氨基酸相同性低于30%。
目前，在生产实践中应用的草甘膦抗性基因主要是上述的II类AroA基因，对I类AroA基因的研究相对较少，且目前发现的I类AroA基因大多天然对草甘膦敏感，此类研究主要选材于陆地微生物，而对草甘膦抗性较高的AroA基因大多被发掘并申请专利保护，给我国的实际应用造成很大的局限性。为解决这一局限性，本发明选取新的菌种资源，即海洋微生物，此类微生物基因组与陆地微生物基因组存在很大的差异，得到AroA基因与其他同类基因存在很大差异。发明内容
本发明的目的是提供一种来自深 海海洋微生物基因组的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因的分离鉴定，通过遗传转化方法，将该基因转入宿主细胞中，使宿主细胞获得耐受草甘膦的能力。
本发明分离克隆的草甘膦抗性基因AroA来自于中国国家海洋局第三研究所筛选得到一株天然深海细菌Janibacter limosus 1C00094(原始菌株1C00094来自中国海洋微生物菌种保藏管理中心，中国国家海洋局第三研究所，福建，厦门，菌株来源地址:WWW.mccc.0rg.cn),该菌株能在含有150mM草甘膦的平板上生长。申请人通过鸟枪法(Osoegawa, Woon et al.1998)构建上述细菌 Janibacter Iimosus 基因组文库，在含 20mM草甘膦的 M9 培养基(配方=Na2HPO4 6.8g/L，KH2PO4 3.0g/L, NaCl 0.5g/L，NH4Cl 1.0g/L,MgSO4 7H20 0.4929g/L，CaCl2 0.lllg/L，葡萄糖 4.0g/L,补充双蒸水至 1L，灭菌前调 pH至7.4，在115°C下高压蒸汽灭菌lOmin，备用)上筛得到一株草甘膦抗性菌株，进一步提高草甘膦浓度到IOOmM,该菌株仍能生长。测序结果显示，本发明分离克隆的基因为AroA基因，申请人将该基因命名为AroAxlim。。将AroApim。基因转化到大肠杆菌AroA基因缺陷型菌株(转化过程参见实施例1中转化的步骤)，得到的重组菌株，申请人将高菌株命名为重组大肠杆菌(Escherichia coli)LZD001,该菌株于2011年12月31日送交湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCCN0:M2011493。经功能互补实验验证，该重组菌株LZDOOl能在含IOOmM草甘膦的M9液体培养基中生长。酶学测定结果表明，草甘膦抗性基因AroApim。在pH 8.0时活性最高，为该基因转入植物中在偏碱性条件下能正常发挥作用提供了条件。草甘膦抗性基因Ar0^linro对其天然底物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的Km值为90.7 PM，对莽草酸-3磷酸(S3P)的Km值为138 PM，对草甘膦的半抑制常数IC5tl值为3.115mM，最大反应速度(Vmax)为0.226mmolmin 1Ing、
将上述草甘膦抗性基因AroAj.lim。重组到pGEX_6P_l质粒表达载体(购自美国GEHealthcare公司)并位于GST标签后，可以在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)(购自Invitrogen公司)中进行异源表达，表达出的含GST标签的融合蛋白(命名为GST-EPSPS)大小为71.lkDa，去掉GST标签后的目的蛋白(EPSPS)大小为45.1kDa0
本发明分离克隆的草甘膦抗性基因AroAxlinro的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:I所示。序列分析结果表明，草甘膦抗性基因AroAxlim。序列全长为1299bp，它编码432个氨基酸(编码区位序列表SEQ ID NO:1的第l_1296bp)，将其氨基酸序列与GeneBank上各种AroA氨基酸序列比较,结果显示，AroAj limo基因序列与从Janibacter spp.HTCC2649菌株(GenBank:EAP99947.1)基因 组序列中预测到的AroA基因序列的核苷酸序列同源性最高值仅为67% (http://blast, ncb1.nlm.nih.gov)。根据草甘膦抗性基因AroAxlinro序列的特点申请人将其归类为I型，是发现的一种新基因。将该基因转化到大肠杆菌AroA基因缺陷型菌株(转化过程参见实施例1中转化的步骤)，得到的重组菌株命名为重组大肠杆菌(Escherichia coli) LZD001，该菌株于2011年12月31日送交湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO:M2011493。
序列表SEQ ID NO:1是本发明分离的草甘膦抗性基因AroAxlinw的核苷酸序列，序列全长为1299bp,第l-1299bp处为编码区。
序列表SEQ ID NO:2是本发明分离的草甘膦抗性基因AroAxlinw的氨基酸序列，编码432个氨基酸。
图1:本发明技术流程图。
图2:Janibacter limosus 基因组 DNA 的酶解过程。
图中 1.Janibacter limosus 基因组 DNA ;2_7.分别为 5min, lOmin, 15min, 20min,25min,30min的酶解产物；8.DNAMarker ；9.酶解后得到的所需要的片段(4_9kb)。
图3:用大肠杆菌DE3(BL21)表达的EPSPS蛋白的SDS-PAGE分析。
图中1.proteins Marker ;2.空载体pGEX_6P_l 未诱导上清；3.空载体pGEX_6P_l诱导上清；
4.pGEX-6p-1-AroAj limo 未诱导上清；5.pGEX-6p-1-AroAj limo 未诱导沉淀；
6.pGEX-6p-1-AroAj limo 诱导上清；7.pGEX-6p-1-AroAj limo 未诱导沉淀。
图4:从构建的基因组文库筛选得到的含目的基因的阳性重组克隆子:pUCl 18-1nsert fraction 图谱。
图5:含 AroAj.limo 基因的重组质粒 pGEX_6p-1-AroAj.limo 的图谱。
图6:含大肠杆菌AroA基因的重组质粒pGEX-6p-l-AroAE。coli的图谱。
图7:蛋白质浓度测定标准曲线图。
图8:无机磷(KH2PO4)标准曲线图。
图9:酶反应最适温度测定曲线。
图10:酶反应最适pH测定曲线。
图11 =Km(PEP)的测定。
图12:Km (S3P)的测定。
图13:半抑制剂量IC5tl值的测定。
图14:生长曲线，即含有AroAxlim。基因的大肠杆菌AroA缺陷型菌株的草甘膦抗性验证。
具体实施方式
实施例1 5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因的分离、克隆
(I)基因组文库的构建及测序，获得抗性基因
从中国国家海洋局第三研究所筛选得到的一株天然深海海洋细菌中选定原始的对草甘勝抗性为150mM的Janibacter limosus 1C00094菌株(又称泥两面神菌1C00094)(原始菌株来自中国海洋微生物菌种保藏管理中心，即中国国家海洋局第三研究所，中国福建厦门，WWW.mccc.0rg.cn),按照以下的步骤和方法构建该菌株的基因组文库:提取深海海洋细菌Janibacter limosus即泥两面神菌1C00094菌株基因组DNA (具体方法见后述)，部分酶解(酶切位点为Sau3A I)获得所需要的片段(4-9kb)，再与pUC118载体(购自宝生物工程大连有限公司，该载体自带酶切位点BamH I)进行连接，然后转入大肠杆菌(E.coli)DH5a高效感受态细胞。参见下面的具体过程。
通过加有20mM草甘膦的M9培养基筛选得到能生长的克隆子，送往南京金斯瑞生物科技有限公司测序，将测序结果与NCBI BLAST数据库(http://blast, ncb1.nlm.nih.gov)比对后得到目的基因AroA的序列,其编码的氣基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所不。基因组DNA的提取方法:从划线平板上挑取上述深海海洋细菌Janibacterlimosus菌株的单菌落，用装有IOOml 2216液体培养基(培养深海细菌Janibacterlimosus (泥两面神菌1C00094)的专用培养基:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，牛肉浸粉lg/L，乙酸钠 lg/L，硝酸铵 0.2g/L，NaCl 19.45g/L，MgCl2、MgS04、CaCl2 2 3g/L，KCl 0.55g/L,NaHCO3 0.16g/L,补充双蒸水至1L,灭菌前调pH至7.6,在121°C下高压蒸汽灭菌30min,备用)的三角瓶于37°C过夜培养；用2ml离心管收集菌体2次，弃去培养基，加入200 U LlXTE缓冲液(配方:10mM Tris-HCl，lmM乙二胺四乙酸(EDTA)，加双蒸水至1L，备用)重悬菌体，加入30-50 u L溶菌酶(浓度为50mg/mL)，于37°C放置30min，每隔5分钟混匀一次。加入300 ii L 裂解液(配方:50mM Tris-HCl，2.5% NaAc，2% 乙二胺四乙酸钠(EDTA)，30%十二烷基磺酸钠(SDS)，8%柠檬酸钠，20%十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，补足双蒸水至1L，备用)，颠倒混匀；加入150 u L5MNaCl，放入70°C水浴锅，IOmin0然后放入_20°C冰箱，IOmin0加入苯酚、氯仿/异戊醇(体积比为24: I)各350 yL，在涡旋振荡器上震荡30s后，离心IOmin后，吸取上清液。加入氯仿/异戊醇(与上清等体积)，混匀后，离心lOmin，充分除去苯酚，吸取上清；加入上述上清2/3体积的异丙醇，混匀后放-20°C冰箱lOmin，后离心lOmin，弃上清。加入浓度为70%的乙醇700iiL，离心7min，弃上清。置于37°C下烘干后，每管加入30 L双蒸水溶解。
部分酶解:将提取质量较好的Janibacter limosus基因组DNA进行部分酶解，回收4-9kb大小的片段。所述的酶解体系为30ii L:3ii L 10XHbuffer,luL Sau3A I (稀释160倍)(购自宝生物工程大连有限公司)，26 y L基因组DNA。先预酶切:体系加好后每5分钟取L，加入I ii L loading buffer终止反应，依次取样直到取完。点样电泳检测后，确定最佳酶解时间为25min。再大量酶解:按照预酶解的最佳时间，将反应体系扩大到300 y L，酶解后电泳，回收大小为4-9kb的片段。结果如图2所示。
酶连:10iiL 酶连体系含 T4DNA Iigase (购自 Transgene 公司)I ii L ;5XT4DNAligase buffer 2 y L ;酶切后的基因组 DNA 片段 0.3pmol ；pUC118 (BamHI/EcoRI)载体(购自宝生物工程大连有限公司)0.03pmol ;补足双蒸水至IOii L，于4°C下过夜酶连。
转化:取酶连产物I UL与50 ii L大肠杆菌感受态细胞DH5a(购自Invitrogen公司)混合，加入到预冷的Imm电转杯(购自BioRad公司)中，用2.1KV电压电击；然后迅速加入600 u L液体LB培养基，于37°C复苏40min ;涂布在含有100 U g/mL氨苄青霉素(Ampicillin,购自北京Transgene公司)的LB平板上,37°C过夜。挑取转化子,接种到液体LB培养基于37°C震荡培养，抽取质粒并进行电泳验证。
质粒的提取:从划线平板上挑取单菌落，用装有5mL含IOOii g/mLAmpicillin的LB液体培养基的试管内，37°C震荡培养过夜。用1.5mL离心管收集菌体，12000rpm离心Imin,弃上清,加入200ii L溶液1(配方:50mM葡萄糖,25mM Tris *HC1,补足双蒸水至1L,调pH至8.0，备用，IOmM EDAT,调pH至8.0)重悬菌体；混匀，加入400mL溶液II (配方:0.2MNaOH, I % SDS，加水补足至1L，备用)，轻轻颠倒混匀，放置时间不超过5min。加入300mL溶液III (配方:3M KAc,用冰乙酸调至pH4.8,备用)，颠倒混勻。于12000rpm离心IOmin,取上清，加入上清2/3体积的异丙醇，于12000rpm 4°C低温离心IOmin ;弃上清,沉淀用70%乙醇洗涤后，于12000rpm 4 °C低温离心lOmin。弃上清，沉淀用30 y L去离子水溶解。取5uL电泳检测。
序列分析:以pUC118通用引物M13(由南京金斯瑞测序公司提供，正向引物F:5’ TGTAAAACGACGGCCAGT-3’;反向引物 R:5’ CAGGAAACAGCTATGACC-3’ )为测序引物，以重组质粒(pUCl 18-1nsert fraction)为模板，由南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
(2) AroAxlim。基因的克隆
根据测序结果，经NCBI BLAST比对得到AroAxlim。基因的序列，设计扩增引物，在引物5’端添加BamHI酶切位点，在3’端添加酶切位点EcoRI，所述的引物对的DNA序列如下所示:
正向引物(5，-AroAj.limo-BamHI):5，-CGCGGATCCATGACCAGTCCTGATTGGCATGC-3，，下划线部分为酶切位点；
反向引物(3，-AroAjlinro-EcoRI):5’ -CCGGAATTCTCAGCCCTCCGACGCCTCG-3’,下划线部分为酶切位点。由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
以按上述抽提的上述深海细菌即泥两面神菌基因组DNA为模板，PCR扩增EPSPS。PCR反应体系如下:
5 X TransStart FastPfu buffer (购自北京 Transgene 公司) IOuL;
dNTP (10ml,购自北京 Transgene 公司)I ii L ;
泥两名神菌基因组DNAIuL;
正向引物(5，-AroAxlim。-BamHI,IOuM)IuL;
反向引物(3’-AroAxlim。-EcoRI,IOuM)IuL;
TransStartFastPfu DNAPolymerase (购自北京 Transgene 公司)I U L ;
加双蒸水至50iiL;
PCR反应条件:94°C预变性 2min ;94°C变性 20s，55°C退火 20s，72°C延伸 50s ;30 个循环；72°C延伸10min,4°C保存5min结束。
酶解PCR产物和质粒载体pGEX-6p_l构建:将获得的PCR产物用限制性内切酶BamHI/EcoRI (购自宝生物工程大连有限公司)，酶解体系:100 y L中含82 y L PCR产物或PGEX-6P-1质粒(生物学试验中常用的质粒,本发明购自美国GE Healthcare公司，该质粒提取方法同实施例1) ；10u L IOXH Buffer ； 4u L BamHI ；4u L EcoRI ;于371:放置过夜。重组质粒pGEX-ep-l-AroAph。的具体构建过程如图1所示,构建好的重组质粒如图5所示。
酶切产物的回收使用胶回收试剂盒(购自AxyGen公司)，按照该试剂盒的说明书回收电泳产物。具体过程是:在紫外灯下将目的条带切下后置于1.5mL的离心管中，每IOOmg加入300 ii L的DE-A缓冲液(该试剂盒自带)，于70°C水浴锅温浴lOmin，直到凝胶全部融化。再加入1/2 倍DE-A缓冲液(该试剂盒自带)体积的DE-B缓冲液(该试剂盒自带)，将溶胶液加入到2mL吸附管12000rpm，4°C离心lmin，加入500uLWl缓冲液(该试剂盒自带)离心洗脱lmin,再加入700uLW2缓冲液(该试剂盒自带)离心洗脱lmin,将缓冲液弃去后再离心Imin尽可能除去乙醇，加入50ii L双蒸水洗脱收集DNA。电泳结果如图2所/Jn o
克隆酶连:IOii L连接体系中含有:
经上述过程构建好的含BamHI/EcoRI双酶切位点的pGEX_6P_l质粒载体0.03nmol ;经 BamHI/EcoRI 双酶切的目的基因 0.2InmoI ;T4DNAligase (购自 Transgene 公司)liiL ;5XT4DNAligase buffer 2yL;加双蒸水补至 10 y L，于 4°C 酶连过夜。
将AroA1.limo基因(其核苷酸序列见SEQ ID NO:1所示)插入到pGEX-6P_l载体，将验证正确的阳性克隆子提取重组质粒，命名为pGEX-6p-l-AroAnim。，其大小为6280bp (见图5)。
实施例2 EPSPS蛋白的表达、纯化与分析
(I)目的蛋白EPSPS的表达
将重组质粒pGEX-ep-l-AroAi；^。转化到表达宿主细胞大肠杆菌E.coliBL21 (DE3)。验证阳性克隆，将鉴定正确的阳性克隆子过夜活化，以体积比I %的接种量转接至IL含100 ii g/mLAmpicillin的LB液体培养基中，于37°C培养2_3h，直至OD6tltl达到0.6左右，加入诱导剂异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度至0.5mM,于22°C，180rpm下培养25h。离心收集菌体,然后用Hepes缓冲液(配方:50mM 4_轻乙基哌嗪乙磺酸(Hepes),2mM 二硫苏糖醇(DTT)，调pH至7.0，补足双蒸水至1L，备用)将菌体洗涤一遍，再用50mLHepes缓冲液悬浮后用高压细胞破碎仪(购自GEANiro Soari公司型号:NS10012K)破碎细胞。将细胞破碎液于4°C、12000rpm下离心30min，收集上清。用SDS-PAGE法检测获得的上清是否含有目的蛋白。
SDS-PAGE 配方如下:
浓缩胶(5%聚丙烯酰胺)，配方如下:
H2O1.4mL ；
30% Acr-Bis (29: I) 0.33mL ；
IM Tris-HCl, pH6.8 0.02mL ；
10% SDS0.02mL ；
10% 过硫酸铵0.02mL;
四甲基乙二铵(TEMED)0.002mL。
分离胶(12%聚丙烯酰胺)，配方如下:
H2O2.45mL ；
30% Acr-Bis (29: I)3mL ；
IM Tris-HCl, pH8.82.5mL ；
10% SDS0.075mL ；
10% 过硫酸铵0.075mL;
四甲基乙二铵(TEMED)0.003mL。
取80iiL细胞破碎液，加20iiL5X蛋白上样缓冲液(6mL lmol/L Tris-HCl,pH8.8), 20mL10 % SDS, 50mL50 % 甘油，5mL P -巯基乙醇，ImLl %溴酌 蓝，加双蒸水至IOOmL,备用)，沸水浴5min，然后点样10 y L电泳检测，SDS-PAGE电泳检测结果见图3。图3表明，目的蛋白EPSPS在大肠杆菌中得到正确表达，含GST标签和目的蛋白的融合蛋白，申请人将此融合蛋白命名为GST-EPSPS，其大小约为71.lkDa，去掉GST标签后的目的蛋白EPSPS为45.lkDa，符合预测结果。
(2)目的蛋白EPSPS的纯化
本发明利用还原型谷胱甘肽(GST)亲和纯化系统纯化重组蛋白(Nilsson，Stahl et al.1997)，具体操作步骤(所有操作均在4°C下进行)如下:取2ml柱材料GSHSepharose 4B (购自Amersham-Pharmacia公司)于层析柱中，用50mL Hepes缓冲液洗脱平衡；将细胞破碎液的上清以1.0ml/min的流速过柱；用300mLHepes缓冲液洗脱没有结合的杂蛋白，流速控制在1.0mL/min以下。再取IOy L浓度为10unit/iiL的3C蛋白酶(购自Merck公司)与ImL Hepes缓冲液混勻,加入层析柱混勻后放4°C酶解12小时。收集上一步骤中经酶解后含目的蛋白EPSPS的Hepes缓冲液至1.5ml的离心管中，再加等体积的甘油混合后分装，置于-80°C保存(Rippert and Matringe 2002)。
(3)目的蛋白EPSPS的浓度定量测定
采用定量Bradford法(Bradford 1976)测定纯化的目的蛋白EPSPS的浓度。具体步骤如下:用Bradford蛋白定量试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)测定目的蛋白EPSPS的浓度，按照试剂盒的说明书操作。具体步骤为:取20 u Llmg/mL蛋白标准品牛血清蛋白(购自上海生工生物工程技术有限责任公司)加Ifepes缓冲液稀释至lOOyL，使终浓度为0.2mg/mL。取稀释后的标准品按0，1，2，4，6，8，10，15 y L分别加到96孔板中，力口Hepes缓冲液补足到20 u L，每孔蛋白含量分别为0.0,0.2,0.4,0.8,1.2,1.6, 2.0mg/mL。每组设计3个平行试验。每孔加入200 V- L Bradford Reagent (Bradford蛋白定量试剂盒自带)，混勻，室温放置5min后用预热的酶标仪(Thermo Scientific公司)测定0D595值,绘制标准曲线，得到如图7所示的蛋白质浓度测定标准曲线，计算样品的蛋白浓度。
(4)目的蛋白EPSPS的活性测定
目的蛋白EPSPS活性测定参照文献(Lanzetta, Alvarez et al.1979)报道的无机磷的测定方法。具体步骤如下:
无机磷标准曲线的制作:配制IOmM的无机磷标准溶液(称取0.2282gK2HPO4 *3H20,用Ifepes缓冲液溶解定容至IOOmL)，取30mL标准溶液用Ifepes缓冲液稀释10倍，分别取0、5、10、20、30、40 (ii L)于I 5mL离心管中，每管无机磷浓度分别为0、0.1、0.2、0.4,0.8mM ;分别加入适量Ifepes缓冲液补足至50 y L，于28V反应3min后加入0.8mL MAT溶液(现配现用:0.045%孔雀石绿75mL，4.2%钥酸铵用IOmL浓盐酸溶解后定容至25mL，混合后过滤，加入200 ii L Tritonx-100,备用)，室温放置lmin后加入0.1mL 34%朽1檬酸钠溶液，放置30min后取200 ii L于96孔板中测定OD66tl值。设计三个实验组(Jin，Lu etal.2007) 0以无机磷浓度为横坐标，以OD66tl为纵坐标作图得到无机磷标准曲线图(见图8)。
最适温度测定:反应体系同上述pH测定体系。体系加好后于不同温度(0、10、20、30、40、50、60°C)下反应3min，加入0.8mL MAT溶液，lmin后加入0.lmL34%柠檬酸钠溶液，室温放置30min后，取200 ii L于96孔板中，用预热的酶标仪测定OD66tl值(对照组不加莽草酸三磷酸(S3P)，设计3个实验组)。以温度为横坐标，以相对活性为纵坐标作图，得到如图9所示的最适温度测定曲 线。
最适pH测定:50 V- L反应体系:lmM莽草酸三磷酸，ImM磷酸烯醇式丙酮酸(PEP),加入IuL纯化的EPSPS蛋白，加不同pH(3、4、5、6、7、8、9、10、ll) W Hepes缓冲液补足到50 u L0 28°C反应4min，加入800iiLMAT溶液，Imin后加入100iiL34%柠檬酸钠(SC)溶液，室温放置30min后，取200 ii L于96孔板中，用预热的酶标仪测定OD66tl值。对照组不加莽草酸三磷酸，设计3个实验组。以pH值为横坐标，以相对活性为纵坐标作图，得到如图10所示的最适PH测定曲线。
Km(PEP)测定:将体系中莽草酸三磷酸(S3P)的浓度固定为ImM，在不同PEP浓度(0、0.02、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mM)下按上述50 y L反应体系测定酶反应速度(Sun,Chen et al.2005)，以PEP浓度为横坐标，以反应速度V(U/mg)为纵坐标作图，得到如图11所示的Km(PEP)的测定结果。
Km(S3P)测定:将体系中磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的浓度固定为ImM，在不同莽草酸三磷酸(S3P)浓度(0,0.02,0.05,0.1,0.2,0.4,0.8、1.0mM)下按上述50 y L反应体系测定酶反应速度，以S3P浓度为横坐标，以反应速度V (U/mg)为纵坐标作图，得到如图12所示的Km(S3P)的测定结果。
半抑制剂量(IC5tl)测定:在上述反应体系中添加不同浓度(10_5、10_4、10_3、10_2、10' 10°、101、100、IOOOmM)的草甘膦，所得数据以草甘膦浓度为横坐标，采用对数坐标，以反应速度V(U/mg)为纵坐标作图，得到如图13所示的半抑制剂量IC5tl值的测定结果。
实施例3:遗传转化实验(功能互补验证)
将重组质粒pGEX-6p-l-Ar0AT.lim。转化到AroA基因缺陷型大肠杆菌感受态细胞(转化过程参见上述实施例1中转化过程。该菌株不含AroA基因，能够排除一般大肠杆菌中带有的AroA基因的干扰)(Vaithanomsat and Brown 2007),分别转接到含0mM、50mM、IOOmM草甘膦的M9液体培养基中，测定生长曲线。
(I)设定对照
引物的设计与合成。根据GENEBANK公布的大肠杆菌E.coli K_12 AroA基因(命名为AroAE.Mli)核苷酸序列(登录号:NP_415428.1)，设计合成如下引物对:
正向引物(5，-AroAE.col1-BamHI):
5，-CGCGGATCCATGGAATCCCTGACGTTACAACCCATCGCTCGTG-3 ’，下划线部分为 BamHI酶切位点；
反向引物(3’-AroAE.col1-XhoI):
5’ -CCGCTCGAGTCAGGCTGCCTGGCTAATCCGCGCCAGCT-3’，下划线部分为 XhoI 酶切位点。该引物对由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
构建pGEX-6p-l-AroAE.coli重组质粒，具体步骤和构建方法同上述实施例2中pGEX-6p-l-AroAj limo重组质粒的构建，pGEX-6p-1-AroAe coli重组质粒图谱如图6所示。
(2)生长曲线的测定
将构建好的重组质粒pGEX-6p-1-AroA1.limo和pGEX-6p-l-AroAE.coli分别转化到感受态细胞大肠杆菌AroA缺陷型菌株AB2829，将转化子分别接种到含有含0mM、50mM、IOOmM草甘膦的M9液体培养基中(含100 ii g/mL Ampicillin)，于37°C震荡培养40h。每组设计三个平行实验，每IOh取200 ii L培养液测定细胞浓度，即OD6tltl值。以培养时间为横坐标，以OD6tltl值为纵坐标作图，得到的生长曲线如图14所示。
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权利要求
1.一种5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所述。
2.—种5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因，其编码的蛋白质的序列如序列表SEQ IDNO:2所述。
3.一株包含表达5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因重组质粒的大肠杆菌LZD001，保藏在中国典型 培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2011493。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种抗草甘膦基因5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因的分离鉴定，所述的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所述，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO2所述。5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因是从深海细菌Janibacter limosus菌株的基因组文库中克隆得到，包含该基因质粒的重组大肠杆菌LZD001保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NOM2011493。经过生物学实验验证，证明该基因对草甘膦具有一定的耐受性。
文档编号C12N9/12GK103194465SQ20121000689
公开日2013年7月10日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者刘子铎, 赵艳, 林拥军, 邵宗泽 申请人:华中农业大学