专利名称：一种从细菌中分离纯化大质粒的方法
技术领域：
一种从细菌中分离纯化大质粒的方法，属于生物化学与分子生物学技术领域。可用于细菌大质粒的提取和鉴定。
背景技术：
质粒是染色体外可以进行自我复制的遗传元件，大小范围从11Λ至2001Λ以上不等，广泛存在于各类生物体的细胞中，尤其在细菌中更为常见，编码细菌生存非必须的某些生物学性状，如性菌毛、细菌素、毒素和耐药性等，一般不整合到细菌染色体上。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因，是分子生物学重组DNA技术中重要的工具。分离提取细菌中的质粒是研究和改造质粒的第一步，对于大小在101Λ以内的小质粒通常采用碱裂解法提取质粒DNA，其基本原理为当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子由于较小能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；染色体DNA由于较大不容易复性而与蛋白质一起呈絮状，离心时可沉淀下来。因此对于细菌中的大质粒，由于其大小和染色体相比差别没有小质粒那么大，所以传统的碱裂解法用于提取细菌中的大质粒并不奏效。
发明内容
为了克服传统的碱裂解法不能用于提取细菌大质粒的不足，本发明提供了一种简单实用的从细菌中分离纯化大质粒的方法。该方法利用脉冲场凝胶电泳技术结合胶回收法能有效的提取细菌中的大质粒DNA。本发明所采用的技术方案是
(1)培养细菌挑取单个菌落接种于細1 LB液体培养基，37°C振荡(250rpm)过夜培养后离心(4000rpm, IOmin, 4°C)，收集菌体。(2)制作胶块用 PIV 缓冲液(IOmM Tris, IM NaCl, PH7. 6)洗涤后，取 Iml PIV 缓冲液重悬细菌，与Iml 2%的低熔点琼脂糖凝胶混勻(温度保持在50°C)，灌入胶块浇制槽中制作细菌胶块。(3)消化蛋白将胶块放入新鲜溶菌液Lysis buffer (6mM Tris，0. IM EDTA， IM NaCl,0. 5% Brij-58,0. 2%脱氧胆酸钠，0· 5% SDS, RNaseA 20μ g/ml，溶菌酶 lmg/ml) 中37°C轻摇过夜，ES缓冲液(0. 5M EDTA ,1% SDS)洗涤模块后用ESP缓冲液(含蛋白酶 KlOO μ g/ml的ES) 50°C过夜消化已去除蛋白质。(4)电泳分离用 TE 缓冲液(IOmM Tris-HCl, ImM EDTA, PH8. 0)洗涤上述经 ESP 缓冲液消化过夜的胶块，最后胶块上脉冲场凝胶电泳仪进行电泳，电泳条件为电压6V/ cm，角度120°，起始转换时间范围l_10s，最后转换时间范围为20_60s，电泳时间范围为 6-24h,电泳液缓冲液为0. 5XTBE，温度保持在14°C。电泳后经EB染色以观察大质粒和染色体的分离情况。(5)切胶回收①用手术刀切取含目的大质粒DNA的琼脂糖凝胶块并称重，先加入3倍胶重的溶胶液 QXl，再加入2倍胶重的双蒸水。②振荡30秒使QIAEX II颗粒重悬。如果胶块中的DNA总量不超过2 μ g，则向样品溶胶液中加入10μ 1的QIAEX II颗粒，然后50°C保温lOmin，每两分钟振荡一次使颗粒重悬，让胶块充分熔化释放出DNA结合到QIAEX II颗粒上。此时混合物的颜色应为黄色，如果是橙色或紫色的话，应加入PH 5.0 3M的乙酸钠溶液调节其颜色至黄色，同时再继续保温至少5min。③13000rpm离心30秒，小心地吸取上清，弃之。④加入QXl缓冲液500 μ 1，振荡重悬颗粒，洗涤颗粒，13000rpm离心30秒，小心地
吸取上清，弃之。此步以洗去残留的凝胶。⑤加入500μ 1 缓冲液 TE (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，ΡΗ8. 0)，振荡重悬颗粒，洗涤颗粒，13000rpm离心30秒，小心地吸取上清，弃之。此步以洗去残留的盐分。⑥室温干燥10-15分钟，直到颗粒变白，加入pH 8.5 IOmM Tris-HCl缓冲液 20μ1以溶解大质粒DNA，取2μ1进行普通琼脂糖凝胶电泳以鉴定所提取的质粒DNA的纯度，其余于_20°C保存备用。本发明的有益效果本发明利用脉冲场凝胶电泳技术结合胶回收法能有效的分离纯化细菌中的大质粒DNA，克服了传统的碱裂解法不能用于提取细菌大质粒的弊端。本发明弥补了传统碱裂解法在提取细菌质粒上的不足，实现了细菌中大质粒的有效提取。对研究细菌中大质粒的生物学特性和功能，以及改造和开发利用细菌中的大质粒，都具有极其重要的作用。
图1.脉冲场凝胶电泳分离伤寒沙门菌GIFU10007大质粒pBSSBl的电泳图谱； 图2.从伤寒沙门菌GIFU10007中提取的大质粒pBSSBl的电泳鉴定图。
具体实施例方式下述实施例中所涉及的线性质粒pBSSBl (Baker S, Hardy J, Sanderson KE, Quail Μ, Goodhead I， Kingsley RA, Parkhill J, Stocker B, Dougan G (2007) A novel linear plasmid mediates flagellar variation in Salmonella Typhi. PLoS Pathog 3: e59.)、伤寒沙门菌GIFU10007(Zhang H, Sheng X，Xu S et al (2009) Global transcriptional response of Salmonella enterica serovar Typhi to anti-z66 antiserum. FEMS Microbiol Lett四8:51-55)保存于江苏大学基础医学与医学技术学院检验医学研究所。实施例以分离纯化伤寒沙门菌一线性质粒pBSSBl (27kb)为例说明 具体过程为
(1)培养细菌挑取伤寒沙门菌GIFU10007 (S. Typhi)的单个菌落接种于細1 LB液体培养基中，37°C振荡(250rpm)过夜培养后离心(4000rpm，lOmin, 4°C)，收集菌体。(2)制作胶块用 PIV 缓冲液(IOmM Tris, IM NaCl, PH7. 6)洗涤后，取 Iml PIV 缓冲液重悬细菌，与Iml 2%的低熔点琼脂糖凝胶混勻(温度保持在50°C)，灌入胶块浇制槽中制作伤寒沙门菌胶块。(3)消化蛋白将伤寒沙门菌胶块放入新鲜溶菌液Lysis buffer (6mM Tris, 0. IM EDTA , IM NaCl，0. 5% Brij_58，0. 2%脱氧胆酸钠，0· 5% SDS，RNaseA 20yg/ml，溶菌酶lmg/ml)中37°C轻摇过夜，ES缓冲液(0. 5M EDTA ,1% SDS)洗涤模块后用ESP缓冲液 (含蛋白酶1(10(^8/1111的ES) 50°C过夜消化已去除蛋白质。(4)电泳分离用TE缓冲液洗涤上述经ESP缓冲液消化过夜的胶块，最后胶块上脉冲场凝胶电泳仪进行电泳，电泳条件为电压6V/cm，角度120°，起始转换时间ls，最后转换时间35s，电泳时间18h，电泳液缓冲液为0. 5XTBE，温度保持在14°C。电泳后经EB染色， 大质粒和染色体的分离情况如图1所示，成功将伤寒沙门菌中的271Λ线性大质粒pBSSBl 和细菌染色体实现了分离。(5)切胶回收
①用手术刀切取图1中的大质粒PBSSBl的琼脂糖凝胶块并称重得200mg，先加入 600mg的溶胶液QXl，再加入400mg的双蒸水。②振荡30秒使QIAEX II颗粒重悬，随即向样品溶胶液中加入10 μ 1的QIAEX II颗粒，然后50°C保温lOmin，每两分钟振荡一次使颗粒重悬，让胶块充分熔化释放出DNA结合到QIAEX II颗粒上，此时混合物的颜色为黄色。③13000rpm离心30秒，小心地吸取上清，弃之。④加入QXl缓冲液500 μ 1，振荡重悬颗粒，洗涤颗粒，13000rpm离心30秒，小心地
吸取上清，弃之。此步以洗去残留的凝胶。⑤加入500μ 1 缓冲液 TE (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，ΡΗ8. 0)，振荡重悬颗粒，洗涤颗粒，13000rpm离心30秒，小心地吸取上清，弃之。此步以洗去残留的盐分。⑥室温干燥10分钟，颗粒变白，然后加入pH 8.5 IOmM Tris-HCl缓冲液20μ1溶解大质粒PBSSB1，取2μ1进行普通琼脂糖凝胶电泳，其余于-20°C保存备用。如图2所示， 本实施例成功提取了高纯度的大小为27 kb的线性大质粒pBSSBl。最后，需要指出的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以通过改变脉冲电泳的条件以分离纯化细菌中各种大小不同的大质粒。 依据本发明的构想对上述实施方式进行的各种有效的变形，均应认为在本发明的保护范围之内。
权利要求
1. 一种从细菌中分离纯化大质粒的方法，其特征在于步骤为(1)培养细菌挑取单个菌落接种于細1LB液体培养基，37°C振荡过夜培养后离心，收集菌体；(2)制作胶块用PIV缓冲液(IOmMTris, IM NaCl, PH7. 6)洗涤后，取Iml PIV缓冲液重悬细菌，与Iml 2%的低熔点琼脂糖凝胶混勻，温度保持在50°C，灌入胶块浇制槽中制作细菌胶块；(3)消化蛋白将胶块放入新鲜溶菌液Lysisbuffer中37°C轻摇过夜，ES缓冲液洗涤模块后用ESP缓冲液50°C过夜消化已去除蛋白质；所述Lysis buffer的成分为6mM Tris, 0. IM EDTA，IM NaCl，0. 5% Brij_58，0. 2%脱氧胆酸钠，0. 5% SDS，RNaseA 20yg/ml，溶菌酶lmg/ml ；所述ESP缓冲液是含蛋白酶KlOO μ g/ml的ES缓冲液；(4)电泳分离用TE缓冲液充分洗涤上述经ESP缓冲液消化过夜的胶块，最后胶块上脉冲场凝胶电泳仪进行电泳，电泳条件为电压6V/cm，角度120°，起始转换时间范围 Ι-lOs，最后转换时间范围为20-60s，电泳时间范围为6-Mh，电泳液缓冲液为0. 5XTBEJj^ 度保持在14°C ；电泳后经EB染色以观察大质粒和染色体的分离情况；(5)切胶回收:①用手术刀切取含目的大质粒DNA的琼脂糖凝胶块并称重，先加入3倍胶重的溶胶液 QXl，再加入2倍胶重的双蒸水；②振荡30秒使QIAEXII颗粒重悬，如果胶块中的DNA总量不超过2 μ g，则向样品溶胶液中加入10μ 1的QIAEX II颗粒，然后50°C保温lOmin，每两分钟振荡一次使颗粒重悬，让胶块充分熔化释放出DNA结合到QIAEX II颗粒上；此时混合物的颜色应为黄色，如果是橙色或紫色的话，应加入PH 5.0 3M的乙酸钠溶液调节其颜色至黄色，同时再继续保温至少 5min ；③13000rpm离心30秒，小心地吸取上清，弃之；④加入QXl缓冲液500μ 1，振荡重悬颗粒，洗涤颗粒，13000rpm离心30秒，小心地吸取上清，弃之，此步以洗去残留的凝胶；⑤加入500μ 1缓冲液ΤΕ，振荡重悬颗粒，洗涤颗粒，13000rpm离心30秒，小心地吸取上清，弃之，此步以洗去残留的盐分；⑥室温干燥10-15分钟，直到颗粒变白，加入pH8.5 IOmM Tris-HCl缓冲液20 μ 1以溶解大质粒DNA，取2 μ 1进行普通琼脂糖凝胶电泳以鉴定所提取的质粒DNA的纯度，其余于-20°C保存备用。
全文摘要
一种从细菌中分离纯化大质粒的方法，属于生物化学与分子生物学技术领域。本发明首先将细菌包埋在低熔点琼脂糖凝胶中，然后在胶内用溶菌酶对细菌进行破菌，用蛋白酶消化胶内细菌的蛋白，再利用脉冲场凝胶电泳对细菌的DNA进行分离，最后通过胶回收获得细菌中的大质粒DNA。通过本发明分离纯化获得的大质粒DNA具有纯度高、结构完整等特点。本发明对于研究细菌中大质粒的生物学特性和功能，以及改造和开发利用细菌中的大质粒，都具有极其重要的作用。
文档编号C12N15/10GK102533730SQ20121000677
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月11日 优先权日2012年1月11日
发明者倪斌, 张海方, 徐顺高, 杜鸿, 生秀梅, 许化溪, 黄新祥 申请人:江苏大学