专利名称：新城疫病毒高粘膜免疫水平弱毒疫苗株ndv/lx及反向遗传构建系统的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术和免疫学技术，筛选一株能同时在消化道和呼吸道产生高水平粘膜免疫的基因I型新城疫病毒弱毒株NDV/LX，用于制造疫苗。
背景技术：
新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)是严重危害世界养禽业的重要传染性病原体之一，可以感染多种禽类，常导致养禽业产生巨大的经济损失 [Alexander, D. J. 2001.GordonMemorial Lecture.Newcastle disease. Br Poult Sci 42:5-22.]。该病毒属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)的成员[Mayo, M.A. 2002. Virus taxonomy-Houston 2002. Arch Virol 147:1071—1076·]。 新城疫病毒有囊膜，基因组为单股、负链、不分节段的RNA病毒，基因组结构模式为 3' -NP-P-M-F-HN-L-5'，依次编码6种结构蛋白核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白 (M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)和大分子蛋白(L)即核蛋白(NP)，P，M， F, HN和L蛋白。根据对鸡的毒力，NDV毒株可以为强毒(Velogenic)、中等毒力(mesogenic) 和弱毒(Lentogen)。已开展广泛的试验来阐明病毒致病性的分子决定因素[Huang Ζ, KrishnamurthyS，Panda A,Samal SK. Newcastle disease virus V protein is associated with viral pathogenesis andfunctions as an alpha interferon antagonist. Journal of virology 2003 Aug ；77 (16) :8676-85.]。大部分研究是关于F和HN蛋白对致病性的作用，研究结果一致认为F蛋白裂解位点处的氨基酸序列是病毒毒力的主要决定因素[Seal BS. Nucleotide and predicted amino acid sequence analysisof the fusion protein and hemagglutinin-neuraminidase protein genes among Newcastle diseasevirus isolates. Phylogenetic relationships among the Paramyxovirinae based on attachmentglycoprotein sequences. Funct Integr Genomics 20040ct ；4 (4) :246-57.]。 NDV毒力差异的分子基础主要决定于FO蛋白的蛋白酶裂解位点的氨基酸序列，强毒的裂解位点有聚碱性氨基酸序列，其模式基序为112GR/K-R-Q-K/R-R-F117 ；弱毒的裂解位点则缺少聚碱性氨基酸序列，其模式基序为112-E/G-R/K-Q-E/G-R-L117。自1拟6年发现新城疫(ND)以来，ND已发生了四次大的流行，而且每一次流行都有不同基因型的毒株出现，尤其是90年代之后出现了新的基因VII型NDV，给我国的养禽业造成了巨大的经济损失。在控制疫病的过程中，使用疫苗是最有效最经济的方法，新城疫的疫苗已使用了几十年，由于ND疫苗的广泛使用，此病已基本上得到了较好的控制，但是临床上非典型ND的发生十分普遍，ND仍然成为威胁养禽业的主要疾病之一，也就是说，常规的疫苗对于NDV强毒的攻击并不能提供理想的保护。从近十年来的ND流行特点来看，临床上所分离到的NDV毒株大多数属于基因VII型[Liu, X. F.，H. Q. Wan，Χ. X. Ni，Y. Τ. Wu, and W. B. Liu. Pathotypical and genotypical characterization of strain of Newcastledisease isolatedfrom outbreaks in chicken and goose flocks in some regions of China during 1985-2001. ArchivesofVirology, 2003,148 (7) : 1387-1403.]，而常规的 ND 疫苗株的基因型主要为I和II型(如V4、La Sota等)，因此，在遗传距离上当前NDV分离株与常规ND疫苗株相差较远。在我国，ND已成为地方流行性疾病，很难扑灭和根除，对商业鸡群进行疫苗免疫是防控新城疫最重要的措施之一。ND疫苗有活疫苗和灭活疫苗之分，活疫苗使用方便，价格便宜，并能产生坚强的免疫力。ND活疫苗不仅能刺激产生体液免疫和细胞免疫，而且能诱导产生呼吸道和消化道粘膜免疫[Senne, D. A.，D. J. King, and D. R. Kapczynski. 2004. Control ofNewcastle disease by vaccination. Dev Biol (Basel) 119 :165-170.]。因为呼吸道和消化道粘膜是NDV感染宿主的门户，所以坚强的粘膜免疫在免疫保护中起着十分重要的作用[Erf, G. F. 2004. Cell-mediated immunity in poultry. Poultry science 83 :580-590.]。大多数商业化NDV弱毒疫苗都能诱导产生针对NDV的特异抗体，但是血清中产生的NDV特异抗体并不足以保护动物抵抗NDV强毒的侵袭感染[Reynolds，D. L.， and A. D. Maraqa. 2000. Protective immunityagainst Newcastle disease the role of antibodies specific to Newcastle disease virus polypeptides. Avian Dis 44: 138-144.])。研究表明以呼吸道和肠道分泌性IgA抗体为代表的粘膜免疫在保护免疫鸡群抵抗 ND 的感染中起到重要作用[Barbour，Ε. K.，Μ. Kallas，and Μ. Τ. Farran. 2001. Immune response to Newcastle disease virus in broilers :a useful model for the assessment ofdetoxification of ervil seeds. Rev Sci Tech 20 :785-790.]。粘膜中分泌性IgA抗体的产生与疫苗株病毒在粘膜上皮细胞中的复制密切相关。但是不同的疫苗病毒在肠道和呼吸道中刺激粘膜产生免疫应答的能力有很大的差异。例如常用的疫苗株La Sota是嗜呼吸道型病毒能刺激产生较高水平的呼吸道粘膜免疫，但刺激产生肠道粘膜免疫的能力很差。相反常用疫苗株QV4是嗜肠道病毒，具有较强诱导粘膜免疫的能力，但是诱导呼吸道粘膜免疫的能力差[Brown，C. C.，D. J. King, and B. S. Seal. 1999. Comparison of pathology-based techniques for detection ofviscerotropic velogenic Newcastle disease virus in chickens. J Comp Pathol 120:383-389·]。而从美国火鸡肠道中分离的VG/GA毒株，能在呼吸道和消化道中很好的复制，同时诱导产生坚强的呼吸道和消化道粘膜免疫应答，因此它具有比单诱导肠道粘膜免疫的疫苗株QV4和单诱导呼吸道粘膜免疫的疫苗株 La Sota 更大的优越性[Perozo，F.，P. Villegas, R. Dolz, C. L. Afonso, and L.B.Purvis. 2008. The VG/GA strain of Newcastle disease virus :mucosal immunity, protection against lethal challenge and molecular analysis. Avian Pathol 37 237-245.]。NDV/LX株是我们从健康鸡群中分离到的一株NDV弱毒。初步研究表明，NDV/LX具有良好的免疫原性，能在呼吸道和消化道很好的复制，诱导产生高滴度的特异抗体和粘膜免疫应答。NDV/LX病毒的ICPI值为0. 12，MDT为1 IOh,按照OIE标准测得HA效价10. 51og2。 攻毒用毒株为基因VII型强毒分离株JS-5-05-GO分离自发病鸭群，其F和HN基因序列号分别为EU044798、EU044816，其ICPI和MDT分别是1. 91和46小时，HA效价平均为81og
发明内容
本发明的第一个目的在于发明一种新城疫病毒高粘膜免疫水平弱毒疫苗株NDV/ LX及反向遗传构建系统，从而解决当前所用疫苗株不能同时在消化道和呼吸道产生黏膜免疫的问题。本发明基因I型弱毒疫苗株NDV/LX，于2010年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO :3843.本发明中NDV/LX株是我们从健康家禽群中分离到一批NDV弱毒。将这些毒株分别以IO6EID50免疫SPF鸡，在免疫后1、4、7、11、15、21天，每组扑杀3只鸡，获取鸡气管和小肠冲洗物以及胆汁。试验的对照组分别为常用疫苗株La Sota、QV4免疫组和PBS免疫空白对照组。经过黏膜抗体水平比较，获得具有良好的免疫原性的NDV/LX株，能在呼吸道和消化道很好的复制，诱导产生高滴度的特异抗体和粘膜免疫应答。本发明的第二个目的在于测定基因I型弱毒疫苗株NDV/LX全基因组序列，其全基因组序列如SEQ ID NO. 37所示。NDV/LX毒株既能在肠道上皮细胞又能在呼吸道上皮细胞中复制的原因仍然是未知的。据报道L蛋白、F蛋白或HN蛋白等结构蛋白的变化是组织嗜性和毒力的主要决定因素。HN和F蛋白可能决定病毒的独特吸附和融合，这将使嗜肠道的病毒能优先进入小肠细胞；而L蛋白的变异将允许嗜肠道毒株在小肠高水平复制，却抑制呼吸道型毒株在小肠的复制。对该毒株进行全基因组测序和反向遗传构建，分析该毒株既能在肠道上皮细胞又能在呼吸道上皮细胞中复制的分子机制，通过反向遗传构建全长克隆使对其基因组修饰成为可能。本发明的第三个目的在于构建基因I型弱毒疫苗株NDV/LX的全长克隆。本发明的构建方法如下1)基因I型新城疫病毒株NDV/LX株的筛选，对从健康家禽肠道分离到一批新城疫病毒弱毒株进行生物学特性和免疫原性分析，测定血清中抗新城疫病毒的效价以及消化道和呼吸道粘膜免疫水平。2) NDV/LX株基因组序列测定，新城疫病毒NDV/LX株由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室构建、保存。设计7对引物扩增基因组序列，引物如下
权利要求
1.一种新城疫病毒弱毒疫苗株NDV/LX，它的保藏号为CGMCC NO :3843。
2.权利要求所述新城疫病毒弱毒疫苗株NDV/LX的全基因组序列，如SEQID NO. 37所
全文摘要
本发明涉及分子生物学技术和免疫学技术，公开了一株新城疫病毒弱毒株NDV/LX及它的全基因组序列。所述新城疫病毒弱毒疫苗株NDV/LX的保藏号为CGMCC NO3843；全基因组序列如SEQIDNO.37所示。研究表明，NDV/LX具有良好的免疫原性，能在呼吸道和消化道很好的复制，诱导产生高滴度的特异抗体和粘膜免疫应答。以常用疫苗株LaSota和QV4为对照，系统研究了NDV/LX株感染SPF鸡后在呼吸道和肠道的分布、全身体液免疫和局部粘膜免疫以及免疫鸡对流行强毒的保护效力。
文档编号C12N15/45GK102559607SQ20121000068
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月4日 优先权日2012年1月4日
发明者刘慧谋, 刘文博, 刘晓文, 刘秀梵, 王晓泉, 胡顺林 申请人:扬州大学