具有启动子活性的多核苷酸的利记博彩app

专利名称：：具有启动子活性的多核苷酸的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及具有启动子活性的多核苷酸。具体而言，本发明涉及在真菌宿主细胞中具有启动子活性的多核苷酸。本发明亦涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及使用本发明的多核苷酸产生多肽的方法。
背景技术：
：在真菌宿主细胞，特别是丝状真菌宿主细胞如曲霉属(Aspergillus)细胞中异源蛋白的重组产生，可对于以商业上重要的量产生所述蛋白提供更理想的媒介。异源蛋白的重组产生一般通过下述实现构建表达盒，其中编码所述蛋白的DNA置于启动子的表达调控下，所述启动子是从受调节的基因切出的，且适于宿主细胞。将所述表达盒导入宿主细胞。然后，通过在表达盒上所包含的启动子的正常功能所需的诱导条件下培养经转化的宿主细胞来实现异源蛋白的产生。蛋白的重组表达的改善一般需要新的调节序列的可用性，所述调节序列适于在宿主细胞中调控所述蛋白的表达。所述调节序列可为合适的启动子序列，其能够直接转录可操作地连接于所述启动子序列的基因。前导序列可操作地连接于编码所述多肽的核苷酸序列的5’端。用于丝状真菌宿主细胞的启动子序列可从来源于米曲霉(Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶和构巢曲霉(Aspergillusnidulans)丙糖磷酸异构酶的基因获得。本发明的一个目的是提供用于在真菌宿主细胞中使用的新启动子，并进一步提供用于在真菌宿主细胞中使用所述新启动子产生多肽的改善的方法。
发明内容在第一个方面，本发明涉及具有启动子活性的分离的多核苷酸，其选自下组(a)多核苷酸，其包含具有启动子活性的核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:1的核苷酸序列具有至少60%，更优选至少65%，更优选至少70%，更优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，且最优选至少95%序列同一性；和(b)多核苷酸，其具有启动子活性，其在至少低严格条件，更优选至少中等严格条件，甚至更优选至少中等-高严格条件，最优选至少高严格条件，且甚至最优选至少非常高严格条件下与SEQIDNO:1的核苷酸序列或其全长互补链杂交。在一个进一步的方面，本发明涉及核酸构建体，表达载体和/或宿主细胞，其包含本发明的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地连接于编码序列，其中本发明的核苷酸序列在天然形式不与该编码序列连接。最后，本发明涉及产生所需多肽的方法，其包括(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含本发明的核苷酸，所述核苷酸可操作地连接于编码所需多肽的编码序列；和(b)回收所述多肽。定义序列同一性参数“序列同一性”描述两个核苷酸序列之间的相关性。就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2OOO,见上文)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，见上文)来测定。使用的可选参数为缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下(同样的脱氧核糖核苷酸X100)/(比对长度一比对中缺口的总数)比对的长度优选为至少10个核苷酸，优选至少25个核苷酸，更优选至少50个核苷酸，且最优选至少100个核苷酸。亚序列术语“亚序列(subsequence)”在本文中定义为意指从SEQIDNO:1的核苷酸序列或其同源序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的核苷酸序列；其中所述亚序列具有启动子活性。在一个方面，亚序列含有SEQIDNO:1的核苷酸序列或其同源序列的至少10个核苷酸，更优选至少25个核苷酸，更优选至少50个核苷酸，更优选至少100个核苷酸，甚至更优选至少200个核苷酸，且最优选至少个核苷酸。等位变体(allelicvariant):术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(多核苷酸的功能无变化)或其可对多核苷酸的功能具有影响。具有启动子活性的多核苷酸的等位变体是由基因的等位变体获得的多核苷酸。分离的多核苷酸术语“分离的多核苷酸”在本文中指从来源分离的多核苷酸。在一个方面，所述变体如通过琼脂糖凝胶电泳测定的，为至少1%纯，优选至少5%纯，更优选至少10%纯，更优选至少20%纯，更优选至少40%纯，更优选至少60%纯，更优选至少80%纯，且最优选至少90%纯。编码序列当用于本文中术语“编码序列”意指直接指定其蛋白产物氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或其他起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的核苷酸序列。核酸构建体如用于本文中术语“核酸构建体”指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或受修饰以本来不存在于(nototherwiseexist)自然界中的方式含有核酸的区段，或是合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。调控序列(controlsequence):在本文中术语“调控序列”定义为包括对多核苷酸表达是必需的所有成分。各个调控序列对于编码待表达的多肽的核苷酸序列可以是天然的或异源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或异源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。可操作地连接术语“可操作地连接”在本文中表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导该多肽的编码序列的表达。表达术语“表达”包括涉及产生多肽的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。表达载体术语“表达载体”在本文中定义为线性的或环状的DNA分子，其包含具有本发明的启动子序列的多核苷酸和编码多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。宿主细胞“宿主细胞”用于本文中包括任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。发明详述具有启动子活性的多核苷酸对于本发明，具有启动子活性旨在意指由宿主细胞识别、用于可操作连接于所述具有启动子活性的多核苷酸的多核苷酸的表达的核苷酸序列。具有启动子序列的多核苷酸可为启动子可为在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。本发明的具有启动子活性的多核苷酸可获得自任何属的微生物。就本发明而言，用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”，应意指所述具有启动子活性的多核苷酸可从所述来源分离，或可通过其中插入了来自该来源的多核苷酸的菌株来分离。本发明的具有启动子活性的多核苷酸包含或组成为(consistof)与SEQIDNO:1具有至少60%序列同一性，优选至少70%序列同一性，更优选至少80%序列同一性，更优选至少90%序列同一性，甚至更优选至少95%序列同一性，仍更优选至少97%序列同一性，且最优选至少98%序列同一'丨生的多核苷酸。与SEQIDNO:1具有序列同一性的多核苷酸和SEQIDNO:1之间的比对长度为优选至少10个核苷酸，更优选至少25个核苷酸，甚至更优选至少50个核苷酸，且最优选至少100个核苷酸。本发明的一个特别优选的启动子是具有SEQIDNO:1的启动子及其等位变体。该启动子可从见于黑曲霉(Aspergillusniger)的推定的烧基硫酸酯酶基因分离。本发明的具有启动子活性的多核苷酸可获得自真菌，如酵母如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓄霉属(Yarrowia)；或更优选获得自丝状真菌如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟腊菌属(Ceriporiopsis)、毛_壳属(Chaetomidium)、金抱子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、德抱属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、把齿菌属(Irpex)、蘑燕属(Lentinula)、Leptospaeria、梨抱菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孑L菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂糟菌属(Schizophyllum)、柱顶抱属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚燕属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)。在另一个优选的方面，本发明的具有启动子活性的多核苷酸获得自解纤维枝顶抱霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘抱曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、热带金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、租金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、ChrysosporiumqueenslandicumΛChrysosporiumzonatum、杆抱状德抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、库威德抱(Fusariumcrookwellense)、大刀德抱(Fusariumculmorum)、禾本科德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariu`mgraminum)、异抱德抱(Fusariumheterosporum)、合欢木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉红德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、肤色德抱(Fusariumsarcochroum)、拟分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圆德抱(Fusariumtorulosum)、拟丝抱德抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusariumvenenatum)、灰腐质霉(Humicolagrisea)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)、白把齿菌(Irpexlacteus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糖脉抱菌(Neurosporacrassa)、绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、无色梭抱壳(Thielaviaachromatica)、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭抱壳(Thielaviaaustraleinsis)、Thielaviafimet1、小抱梭抱壳(Thielaviamicrospora)、卵抱梭抱壳(Thielaviaovispora)、Thielaviaperuviana、瘤抱梭抱壳(Thielaviaspededonium)、毛梭抱壳(Thielaviasetosa)、Thielaviasubthermophila、土生梭抱霉(Thielaviaterrestris)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(TrichodermaIongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或绿色木霉(Trichodermaviride)。在另一个优选的方面，所述具有启动子活性的多核苷酸获得自黑曲霉或米曲霉。在一个最优选的方面，本发明具有启动子活性的多核苷酸获得自黑曲霉。可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfectandimperfectstates),和其它分类学的等同物(equivalent),例如无性型(anamorph),而无论它们已知的种名。本领域技术人员会容易地识别适合的等同物的身份。这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。此外可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定和获得所述具有启动子活性的多核苷酸。用于从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选此种微生物的基因组来得到所述多核苷酸。一旦检测到具有启动子活性的多核苷酸，就能够使用本领域普通技术人员公知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等，1989，见上文)。用于分离或克隆具有启动子活性的多核苷酸的技术是本领域内已知的，并包括但不限于从基因组DNA分离和多种启动子捕获技术。可例如通过使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)来实现从这种基因组DNA克隆本发明的多核苷酸。参见，例如，Innis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork。可以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligatedactivatedtranscription；LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以从曲霉属菌株，或其它或相关生物体克隆多核苷酸，并且因此可为例如本发明的具有启动子活性的多核苷酸的等位基因变体或种变体(speciesvariant)。本发明亦涉及具有启动子活性的分离的多核苷酸，其包含或组成为与SEQIDNO:1的序列具有优选至少60%，更优选至少65%，更优选至少70%，更优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，和甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性程度的核苷酸序列。本发明亦涉及本发明的具有启动子活性的分离的多核苷酸，其在非常低严格条件，优选低严格条件，更优选中等严格条件，更优选中等-高严格条件，甚至更优选高严格条件，且最优选非常高严格条件下与以下杂交(1)SEQIDN0:1的序列，(ii)(i)的全长互补链；或其等位变体和亚序列(Sambrook等，1989,见上文)，如本文中所定义。本发明亦涉及具有启动子活性的分离的多核苷酸，其通过以下获得(a)将DNA群体在非常低、低、中等、中等-高、高或非常高严格条件下与以下杂交(i)SEQIDN0:1的成熟多肽编码序列，(ii)(i)的全长互补链；和(b)分离具有启动子活性的杂交的多核苷酸。核酸构建体本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，所述分离的多核苷酸与一个或多个(几个)调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。可以用许多方式操作本发明的具有启动子活性的多核苷酸以提供多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸的序列插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域熟知的。调控序列也可以是合适的转录终止子序列，即由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYCl)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等，1992，见上文描述。调控序列还可以是合适的前导序列，即对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’-末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得酿酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与核苷酸序列的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,MolecularCellularBiologyl5:5983-5990描述。调控序列还可以是信号肽编码序列，其编码与多肽的氨基末端相连的信号肽，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码分泌多肽的编码序列片段一起天然地连接在翻译阅读框中。可供选择的是，编码序列5’端可含有对于所述编码序列外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径(即，分泌至培养基中)的任何信号肽编码序列可在本发明中使用。对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉(Humicolainsolens)纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V和疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)脂肪酶。对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等，1992，见上文描述。同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GALl系统。在丝状真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(withheavymetal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，本发明的具有启动子的核苷酸序列将与调节序列可操作地连接。表达载体本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸，所需多肽的编码序列和转录和翻译终止信号。本文所述的多种核酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代核苷酸序列。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达编码序列的载体中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体来使用本发明的多核苷酸序列。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达调控序列以及本发明的具有启动子活性的多核苷酸可操作地连接。重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外,可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(totalDNA),或可以使用转座子(transposon)。本发明的载体优选地含有一个或多个(几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophytoauxotrophs)等。用于酵母宿主细胞的合适标记为ADE2，HIS3,LEU2,LYS2,MET3,TRP1，和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷_5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺昔酸转移酶)和trpC(邻氛基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉(Aspergillusnidulans)或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。本发明的载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或允许载体在细胞中独立于基因组的自主复制。为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够数量的核酸，如100至10，000碱基对，优选400至10，000碱基对，并且最优选800至10，000碱基对，其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator),其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsResearchl5:9163-9175；W000/24883)。分离AMAl基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于W000/24883中的方法完成。可以将包含本发明的具有启动子活性的多核苷酸的多于一个拷贝的核酸构建体插入宿主细胞以增加所需基因产物的产生。核酸构建体拷贝数的增加可通过如下方法获得将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectableagent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，且由此含有本发明的具有启动子活性的多核苷酸的额外拷贝的细胞。用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等，1989，见上文)。宿主细胞本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸可操作地连接于一个或多个(几个)调控序列，所述调控序列指导所需多肽的产生。将包含本发明多核苷酸的构建体或载体导入宿主细胞，使构建体或载体如前所述作为染色体整合体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”包括亲本细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。宿主细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。宿主细胞可以是在多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。在一个优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等,于AinsworthandBisbyjsDictionaryofTheFungi,第8版，1995，CABInternational,UniversityPress，Cambridge，UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，见上，171页中所引用)，和所有有丝分裂抱子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等，1995，见上文)。在一个更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenousyeast)(内抱霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenousyeast)和属于半知菌类(FungiImperfecti)(芽抱纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport，R.R.编，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)中所述。在一个甚至更加优选的方面，酵母宿主细胞是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓄霉属(Yarrowia)细胞。在最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、诺地酵母(Saccharomycesnorbensis)、卵形酵母(Saccharomycesoviformis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(KluyveromycesIactis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是解脂西洋蓍霉(YarrowiaIipolytica)细胞。在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等，1995，见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。在一个甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟錯菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、德抱属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨抱菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉抱菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂糟菌属(Schizophyllum)、踩节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。在最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)或米曲霉(Aspergillusoryzae)细胞。在另一个最优选方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、库威德抱(Fusariumcrookwellense)、大刀德抱(Fusariumculmorum)、禾本科德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、异抱德抱(Fusariumheterosporum)、合欢木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉红德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、肤色德抱(Fusariumsarcochroum)、拟分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圆德抱(Fusariumtorulosum)、拟丝抱德抱(Fusariumtrichothecioides)或镶片镰孢(Fusariumvenenatum)细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑剌烟管菌(Bjerkanderaadusta)、干拟錯菌(Ceriporiopsisaneirina)、干拟錯菌、Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、虫拟錯菌(Ceriporiopsissubvermispora)、嗜角质金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、热带金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、租金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporiumzonatum、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糖脉抱菌(Neurosporacrassa)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、福射射脉菌(Phlebiaradiata)、剌序侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭抱霉(Thielaviaterrestris)、长域毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或绿色木霉(Trichodermaviride)细胞。可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP238023和Yelton等，1984，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA81:1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等，1989，Gene78:147-156和W096/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母Becker和Guarente，于Abelson，J.N.和Simon,M.1.编，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volumel94,ppl82_187，AcademicPress,Inc.，NewYork；Ito等，1983，JournalofBacteriologyl53:163;和Hinnen等，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920。产生方法在本发明的产生方法中，在适合于从本发明的具有启动子活性的多核苷酸提供转录活性的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许本发明的具有启动子活性的多核苷酸的转录活性的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果包含本发明的具有启动子活性的多核苷酸的核酸构建体设计用于表达所需的多肽，且该多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。此种多肽可使用本领域已知方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。本发明进一步通过下述实施例描述，其不应视为对本发明的范围的限制。实施例用作缓冲液和底物的化学品为至少试剂级的商品。材料和方法方法分子克隆技术描述于Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.(1989)Molecularcloning:alaboratorymanual(第2版)ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork。酶用于DNA操作的酶(例如限制性内切核酸酶，连接酶等)可从NewEnglandBiolabs,Inc.获得,并可根据生产商的指示使用。培养基和试剂用作缓冲液和底物的化学品为分析级的商品。Cove-N(tf)平板组成为342.3g的鹿糖,20ml的Cove盐溶液，3g的NaNO3,和30g的NobleAgar,加水至I升。Cove-N平板组成为30g的鹿糖,20ml的Cove盐溶液,3g的NaNO3,和30g的NobleAgar，加水至I升。COVE盐溶液组成为26gKCl，26gMgSO4·7Η20，76gKH2PO4和50mlCove痕量金属，加水至I升。COVE的痕量金属溶液组成为O.04gNaB4O7·IOH2O,O.4g的CuSO4·5H20,1.2g的FeSO4·7Η20，1.Og的MnSO4·Η20，0·8g的中性淀粉酶IIMoO2·2Η20，和10.Og的ZnSO4·7Η20，加水至I升。Cove-N顶层琼脂糖(topagarose)组成为342.3g的鹿糖,20ml的COVE盐溶液，3g的NaNO3，和IOg的低熔点琼脂糖，加水至I升。淀粉葡糖苷酶痕量金属溶液组成为6.8gZnCl2·7H20，2.5gCuSO4·5H20，O.24gNiCl2·6H20,13.9gFeSO4·7H20,13.5gMnSO4·H2O和3g柠檬酸，加水至I升。YPG组成为4g的酵母提取物，Ig的KH2PO4,0.5g的MgSO4·7H20和15g的葡萄糖(ρΗ6·0)，加水至I升。STC缓冲液组成为O.8Μ的山梨糖醇，25mM的Tris(pH8)，和25mM的CaCl2，加水至I升°STPC缓冲液组成为STC缓冲液中的40%PEG4000。MLC组成为40g葡萄糖，50g大豆粉，4g/朽1檬酸(pH5.O),加水至I升。MSS组成为70g蔗糖，IOOg大豆粉(ρΗ6·O)，加水至I升。MU-1组成为260g的麦芽糊精，3g的MgSO4·7Η20，5g的KH2PO4,6g的K2SO4,淀粉葡糖苷酶痕量金属溶液O.5ml和尿素2g(pH4.5)，加水至I升。购买的材料(大肠杆菌，质粒和试剂盒)将大肠杆菌DH5_alpha(Toyobo)用于质粒构建和扩增。将商业性质粒/载体TOPOCloningKit(Invitrogen)和pBluescriptIISK_(Stratagene#212206)用于克隆PCR片段。扩增的质粒用Q.1ager)PlasmidKit(Qiagen)回收。连接用DNALigationKit(Takara)或T4DNA连接酶(BoehringerMannheim)进行。聚合酶链式反应(PCR)用ExpandPCR系统(BoehringerMannheim)进行。将QIAquickGelExtractionKit(Qiagen)用于从琼脂糖凝胶纯化PCR片段和提取DNA片段。菌株将构巢曲霉菌株NRRL1092用作硝酸还原酶基因终止子的供体。表达宿主菌株黑曲霉QMJi016-14_l由Novozymes分离，且为从土壤分离的黑曲霉NN049184的衍生物。QMJiO16-14-1经遗传修饰以破坏ku70、oah和pyrG的表达。表达宿主菌株黑曲霉NN059180(pyrG-)由Novozymes分离并为从土壤分离的黑曲霉NN049184的衍生物。NN059180经遗传修饰以破坏淀粉葡糖苷酶活性的表达。黑曲霉NN059180中的中性蛋白酶I基因由大肠杆菌潮霉素B磷酸转移酶基因打断。米曲霉Bech2描述于TO00/39322实施例1。描述于TO2006/069289的米曲霉菌株#13-1由Novozymes分离。描述于W02006/069289的米曲霉IF04177由Novozymes分离，并可从InstituteforFermentation,Osaka(IFO)CultureCollectionofMicroorganisms,17-85，Juso-honmachi,2-chome，Yodogawa-ku,0saka532_8686,Japan获得。质粒表达盒质粒pJaL790(描述于专利公开W02005070962)表达盒质粒pHUda440(描述于专利公开W02006/069289)表达盒质粒pCBPhycutiprepro(描述于专利公开W02008/017646)pJaL574描述于W007045248中的实施例9黑曲霉的转化曲霉属菌种的转化可使用一般的用于酵母转化的方法实现。对于本发明的优选步骤如下所述。将黑曲霉宿主菌株接种至补充IOmM尿苷的IOOml的YPG培养基，并在32°C以80rpm温育16小时。收集沉淀，并用O.6MKCl洗涤，并重悬于含有20mg每ml的最终浓度的商业性β-葡聚糖酶产品(GLUCANEX,NovozymesA/S,Bagsvail'd.,Denmark)的20ml0.6MKCl。将悬液在32°C以80rpm温育直至形成原生质体，然后用STC缓冲液洗涤两次。将原生质体用血细胞计数器计数，并重悬，并调整于STC:STPC:DMS0为8:2:0.1溶液中至2.5xl07个原生质体/ml的终浓度。将大约4μg的质粒DNA添加至100μI的原生质体悬液，轻柔的混合，并在冰上温育30分钟。添加一ml的SPTC，并将原生质体悬液在37°C温育30分钟。在添加IOml的50°CCove-N顶层琼脂糖之后，将反应倾至Cove-N(tf)琼脂平板上，并将平板在32°C温育5日。PCR扩增权利要求1.一种有启动子活性的分离的多核苷酸，其选自下组(a)多核苷酸，其包含具有启动子活性的核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQIDNO:1的核苷酸序列具有至少60%，更优选至少65%，更优选至少70%，更优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，且最优选至少95%序列同一性；和(b)多核苷酸，其具有启动子活性，其在至少低严格条件，更优选至少中等严格条件，甚至更优选至少中等-高严格条件，最优选至少高严格条件，且甚至最优选至少非常高严格条件下与SEQIDNO:1的核苷酸序列或其全长互补链杂交。2.权利要求1的多核苷酸，其包含或组成为SEQIDNO:1的核苷酸序列，或其具有启动子活性的片段。3.—种核酸构建体，其包含权利要求1的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个(几个)调控序列，所述调控序列指导所需的多肽在表达宿主中的产生。4.一种重组表达载体，其包含权利要求3的核酸构建体。5.—种重组宿主细胞，其包含权利要求3的核酸构建体。6.—种产生所需多肽的方法，其包括(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养包含权利要求3的核酸构建体的宿主细胞；和(b)回收所述多肽。7.权利要求6的方法，其中所述宿主细胞是丝状真菌。8.权利要求7的方法，其中所述丝状真菌选自下组枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟錯菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、德抱属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨抱菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉抱菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂糟菌属(Schizophyllum)、踩节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)和木霉属(Trichoderma)。9.权利要求7的方法，其中所述丝状真菌选自下组泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、杆抱状德抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、库威德抱(Fusariumcrookwellense)、大刀德抱(FusariumcuImorum)、禾本科德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、异抱德抱(Fusariumheterosporum)、合欢木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉红德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、肤色德抱(Fusariumsarcochroum)、拟分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圆德抱(Fusariumtorulosum)、拟丝抱德抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusariumvenenatum)、黑剌烟管霉(Bjerkanderaadusta)、干拟錯菌(Ceriporiopsisaneirina)、干拟錯菌、Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、虫拟錯菌(Ceriporiopsissubvermispora)、嗜角质金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、热带金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、ChrysosporiumηορβΛ^^抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、ChrysosporiumqueenslandicumΛChrysosporiumzonatum、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糖脉抱菌(Neurosporacrassa)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、福射射脉菌(Phlebiaradiata)、剌序侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭抱霉(Thielaviaterrestris)、长域毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(TrichodermaIongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)和绿色木霉(Trichodermaviride)。10.权利要求6-9任一项的方法，其中所述多肽是酶。11.权利要求10的方法，其中所述酶选自下组蛋白酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、肌醇六磷酸酶、氧化酶、氧还酶和果胶酶。全文摘要本发明涉及具有启动子活性的分离的多核苷酸，和所述分离的多核苷酸用于产生多肽的用途。本发明亦涉及包含多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及使用具有启动子活性的多肽产生所需多肽的方法。文档编号C12N15/80GK103068988SQ201180041010公开日2013年4月24日申请日期2011年6月23日优先权日2010年6月25日发明者寺本宽,宇田川裕晃申请人:诺维信公司