专利名称：与血清中刀豆素A特异结合的组织蛋白酶D酶原ConA-pCD及应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属生物技术应用领域，具体涉及一种从血清中分离纯化得到的与刀豆素A 特异结合的组织蛋白酶D酶原ConA-pCD及其在制备血清学诊断肝癌试剂中的应用。
背景技术：
肝癌是世界上六大常见的恶性肿瘤之一，每年全世界约有50 100万的新发病例。初次确诊的肝癌患者中，仅有10 30%的病例适合治愈性治疗(如采用外科手术、射频消融术及原位肝脏移植术)。不仅如此，肝癌病人预后极差，5年生存率低于5%。影响肝癌病人长期存活的主要原因之一是大多数肝癌患者确诊时已发展至中晚期，而中晚期肝癌的治疗效果极差。显然，提高肝癌治疗效果、降低肝癌死亡率的关键在于早期诊断和治疗。因而，对肝癌易患人群(慢性肝硬化患者、乙肝及丙肝病毒携带者)进行随访、定期筛查，是检出早期肝癌的有效手段。目前肝癌高危人群筛查的主要手段是对高危人群定期(每6个月)进行B超影像学和血清学甲胎蛋白(a-fetoprotein，AFP)的检测。然而，B超影像扫描诊断肝癌的临床应用价值有限，包括高度依赖于操作者的专业技能、检出病灶的最小直经为3cm并且难以辨别增生结节的良恶性；而其它的影像学技术，如多层螺旋CT、钆贝葡胺增强MRI，由于诊断肝癌时费用昂贵、检查费时，不适于常规高危人群筛查。尽管血清AFP检测已广泛应用于高危人群普查，但其诊断肝癌的敏感性和特异性分别为39-65%、76-94%，尤其在早期肝癌诊断中其敏感性更低(30-40%)，而不适于肝癌高危人群监测。近年来的研究发现了许多新的肝癌血清学诊断标志物，如甲胎异质体(AFP-L3)、异常凝血酶(DCP)、高尔基体蛋白(GP73)、 碱性磷酸酶肝同工酶、肝癌特异性Y谷氨酰转肽酶等，因而有学者提议这些新的标志物单独应用或与AFP联用，对肝癌易患的高危人群进行监测。然而，这些肝癌相关的新型标志物的敏感性和特异性仍不理想，如AFP-L3和DCP诊断肝癌的敏感性和特异性分别为61-75%、 90%,但AFP-L3与肝癌高度恶性和低分化密切相关，DCP对早期肝癌(< 2cm)诊断的敏感性仅为56. 5%，阻碍了它们用于肝癌高危人群监测。因此，亟需研发、鉴定肝癌诊断的新型血清标志物。蛋白质糖基化修饰是最常见的蛋白质翻译后的修饰之一，人体内约有50%的蛋白发生了糖基化修饰。糖蛋白的寡糖侧链赋予了蛋白质分子重要的生理功能，如蛋白构像、蛋白的运输及分类、稳定性及活性、亚细胞定位、蛋白质分子间及细胞间相互作用、识别等功能；并且还参与了许多疾病的病理过程，如蛋白质分子糖基化程度及寡糖侧链结构的变异是肿瘤及其它多种疾病形成与进展过程中的基本特性之一。蛋白质的异常糖基化见于人类多种肿瘤，并与癌细胞的侵袭、转移过程密切相关。因此，许多目前临床应用的肿瘤诊断标志物或治疗靶点多为糖蛋白，如CA125 (卵巢癌)、PSA (前列腺癌)、Her2/neU(乳腺癌)、CEA (结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌及肺癌)等。根据寡糖侧链共价结合的氨基酸残基不同，可将糖蛋白分为N -连接糖蛋白(与天冬酰胺残基酰胺氮相连)和O -连接糖蛋白(与丝氨酸、苏氨酸或羟赖氨酸残基的羟基共价结合)。N -连接糖蛋白寡糖链分支增多及复杂化与肝癌的发生发展密切相关，如肝癌患者血清中触珠蛋白(haptoglobin，HP) β链的三天线型寡糖侧链增多，而肝硬化患者则以双天线型寡糖侧链为主；高度恶性肝癌的AFP寡糖侧链易发生岩藻糖基化，即AFP-L3产生；岩藻糖基化的GP73异质体诊断肝癌的敏感性提高；肝癌患者血清中α 1-酸性糖蛋白 (AAG)常发生异常岩藻糖基化修饰。日本和美国先后将AFP-L3增加为肝癌诊断的血清学标志物之一，充分证实蛋白质N-连接糖基化的变异与肝癌的发生和演进过程密切相关。发明内容
本发明目的在于提供一种从血清中分离纯化、与刀豆素A (Concanavalin，ConA) 特异结合的组织蛋白酶D酶原(ConA-pro-cath印sin D, ConA-pCD)及其在医学领域的应用。
为实现上述目的，本发明采取如下技术方案一种与血清中刀豆素A特异结合的组织蛋白酶D酶原ConA-pCD，由下述方法制得①刀豆素A亲和层析柱的制备在层析柱内加入100 1000μ 刀豆素A琼脂糖凝胶，离心后弃去流出液，然后加入1 5 ml含0. 1% (v/v) Triton X_100的糖蛋白结合缓冲液，旋转摇床孵育5 15 min，离心后弃去流出液，再加入1 5 ml糖蛋白结合缓冲液， 旋转摇床孵育5 15 min，离心后弃去流出液，备用；所述糖蛋白结合缓冲液组成为30 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 1 5 mM CaCl2, 1 5 mM MnCl2, pH 6. 0 7. 2 (pH 可用盐酸进行调节)；②取血清，离心后取20 100μ1上清并加入糖蛋白结合缓冲液至终体积为0.5 5 ml，然后转入上述制备好的刀豆素A亲和层析柱内，旋转摇床于室温孵育至少2 h或于4°C 孵育10 12 h;然后离心弃去流出液，加入0.5 2 ml含200 400 mM甲基-a-D吡喃甘露糖苷的糖蛋白结合缓冲液，即刀豆素A结合糖蛋白的洗脱液；旋转摇床孵育5 15 min,，离心并收集洗脱液，洗脱2 6次；③在上述收集的洗脱液中加入-20°C的丙酮至丙酮体积终浓度为80%，-20°C放置10 12h，离心弃上清，室温干燥后即得。
较好的，所述与血清中刀豆素A特异结合的组织蛋白酶D酶原ConA-p⑶由下述方法制得①制备刀豆素A亲和层析柱在层析柱内加入100μ1刀豆素A琼脂糖凝胶，离心后弃去流出液，然后加入2 ml含0. 1% (v/v) Triton X-100的糖蛋白结合缓冲液，旋转摇床孵育10 min，离心后弃去流出液，再加入2 ml糖蛋白结合缓冲液，旋转摇床孵育10 min，离心后弃去流出液，备用；所述糖蛋白结合缓冲液组成为30 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, pH 7. 2 ；②取血清，离心后取20μ 上清并加入糖蛋白结合缓冲液至终体积为1 ml，然后转入上述制备好的刀豆素A亲和层析柱内，旋转摇床于室温孵育2 h或于4°C孵育10 12 h;然后离心弃去流出液，加入1 ml含200 mM甲基-a-D吡喃甘露糖苷的糖蛋白结合缓冲液，即刀豆素A结合糖蛋白的洗脱液；旋转摇床孵育lOmin，，离心并收集洗脱液，洗脱4次；③在上述收集的洗脱液中加入-20°C的丙酮至丙酮体积终浓度为80%，-20°C放置10 12h，离心弃上清，室温干燥20min后即得。
步骤③所得产物可用蛋白裂解液溶解后，采用Western blot和光密度半定量方法检测ConA-p⑶的血清含量，血清中ConA-p⑶水平可用于诊断肝癌。为比较不同批次 Western blot结果，每批次^festern blot均检测从肝癌组织中提取的ConA_pCD( 10 ug刀豆素A结合糖蛋白)含量。蛋白裂解液的用量一般为25 200 μι。常用的蛋白裂解液配方有以下两种① 8Μ尿素，2% CHAPS (3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐)，15mM DTT (二硫苏糖 II),Proteinase inhibitor cocktail (蛋白酶抑制剂混合液，购自 Roche);② 50 mM Tris (pH7. 4),150 mM NaCl,0. 1% SDS,50 mM DTT,1 mM PMSF0血清ConA-P⑶可由下述方法得到纯度较高的成品
(I)ConA结合糖蛋白洗脱液的超滤收集上述步骤②所得的ConA结合糖蛋白洗脱液， 加入到截留值为3 kDa的超滤管中(Millipore)，12，000 g离心至截留量为0.2 ml时，加入 2 ml免疫沉淀裂解液，继续离心至终体积为0.2 ml，加入免疫沉淀裂解液重复上述置换过程至终体积为1 ml ；所述免疫沉淀裂解液的配方为50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% NP40, Proteinase inhibitor cocktail (Roche), pH 7.2。(2) ρ⑶免疫亲和层析柱的制备吸取20μ1悬浮的蛋白G琼脂糖凝胶(Ρ4691， Sigma)加入到Eppendorf试管中，再加入1 ml免疫沉淀裂解液，混勻后于室温旋转摇床孵育10 min, 13，000 rpm离心2 min,弃上清；重复洗涤2次；加入0. 2ml免疫沉淀裂解液悬浮蛋白G琼脂糖凝胶，再加入20 ug抗组织蛋白酶D (Cath印sin D, CD)抗体(sc-6486， Santa Cruz Biotechnology)，混勻后于旋转摇床室温孵育2 h (或4°C孵育12 16 h);如上洗涤3次后备用；
(3)ConA-p⑶的纯化将上述步骤(1)所得产物加入步骤(2)所得的ρ⑶免疫亲和层析柱内，混勻后旋转摇床室温孵育2 h (或4°C孵育12 16 h);如上洗涤蛋白G琼脂糖凝胶5次，再加入100 μ 蛋白洗脱液，混勻后于室温旋转摇床孵育10 min, 13，000 rpm 离心2 min收集上清；洗脱4次，合并洗脱液后加入10% (ν/ν)的中和液；所述蛋白洗脱液的配方为0. 1 M甘氨酸，pH 2. 5 ；中和液配方为0. 5 M Tris-HCl, pH 8. 0。ConA-p⑶的检测将步骤(3)所得产物按照步骤(1)的方法超滤浓缩后即制得纯度较高的ConA-p⑶，将其进行电泳试验发现肝癌患者血清中ConA-p⑶呈pH为4. 5 6. O 的一系列同一分子量、不同等电点的异质体，其中pH为4. 5 5. 5的4个ConA-p⑶异质体在肝癌患者血清中升高尤其显著，结果见图6。本发明应用凝集素亲和层析技术从肝癌组织、癌旁非癌及正常肝组织中分离纯化的N-连接糖蛋白，经二维电泳图谱分析，发现ρ⑶异质体在肝癌组织明显升高;Western blot方法检测肝癌、癌旁非癌及正常肝组织中pCD表达，发现肝癌组织中的pCD表达显著升高；肝癌细胞系的条件培养基中分泌型的P⑶表达水平显著高于肝永生化细胞；Western blot方法分析肝细胞系分泌上清与肝组织中ConA-p⑶中表达特征，发现肝癌细胞系的分泌上清和肝癌组织中ConA-p⑶的表达显著高于肝永生化细胞及非肝癌组织；应用ConA 亲和层析和免疫亲和层析技术纯化从肝癌和临床资料匹配的慢性肝病患者对照混合血清中纯化ConA-p⑶，然后二维电泳检测肝癌血清中ConA-p⑶呈pH为4. 5 6. O的一系列同一分子量、不同等电点的异质体，其中pH为4. 5 5. 5的4个ConA-p⑶异质体在肝癌患者血清中升高尤其显著；应用亲和层析技术，从血清中分离纯化ConA结合糖蛋白，Western blot半定量分析比较原发性肝癌与临床病理资料匹配的慢性肝病患者对照血清中ConA-p⑶水平的差异，发现肝癌患者血清ConA-p⑶显著增高(升高了 4. 3倍)，ROC (Receiver operating characteristicConA_pCDi#l|i月干―白勺_胃个生禾口·异性分别为85%、80%。
结果证实PCD糖蛋白异质体糖链结构变异与肝癌发生发展密切相关，血清 ConA-pCD在肝癌患者血清中明显升高，是一种潜在的、具有临床应用前景的新型肝癌诊断的血清标志物。
图1正常肝组织(N)和原发性肝癌组织(HCC)高甘露糖型糖蛋白二维电泳银染图谱，图中标识的数字为差异表达的糖蛋白斑点，椭圆型区域内为差异表达的PCD所在区域；图2为ρ⑶在正常肝组织(3例)、癌旁非癌组织和肝癌组织(8对)中的表达，其中6例癌组织表达的PCD显著高于癌旁非癌组织和正常肝组织；箭头指示为pCD和CD中间体所在的条带；图3为肝癌细胞系(H印;3B，Huh7, PLC5, SNU449, SNU473)条件培养基中分泌型pCD 表达明显高于肝永生化细胞系(L02)；图4为ConA-⑶和ConA-p⑶在6对癌旁非肝癌组织和肝癌组织中的表达，ConA-⑶的高表达见于全部(6/6)的肝癌组织，ConA-p⑶高表达见于5 (5/6)例肝癌组织；图5为肝癌细胞系SNU449和SNU473条件培养基中分泌型ConA-p⑶表达显著高于肝永生化细胞L02 ；图6应用ConA亲和层析和免疫亲和层析技术纯化从肝癌和临床资料匹配的慢性肝病患者混合血清中纯化ConA-p⑶，二维电泳方法检测发现肝癌患者血清中ConA-p⑶呈pH 为4. 5 6. O的一系列同一分子量、不同等电点的异质体，其中pH为4. 5 5. 5的4个 ConA-p⑶异质体在肝癌患者血清中升高尤其显著；图7为Western blot检测肝癌和慢性肝病患者混合血清、一对肝癌(3318)及非癌对照(5561)血清中ConA-p⑶，肝癌血清中ConA-p⑶明显高于非肝癌血清(A)；而相应标本的血清中ρ⑶和⑶在肝癌血清中的表达明显降低(B)；图8为Wfestern blot检测肝癌血清(6 10)和非癌对照(2 5)血清中ConA-pCD的表达，4例肝癌血清中可见ConA-p⑶表达明显增高，第1道组间对照为半定量分析的参考标准；图9为35例肝癌和35例非肝癌对照血清中ConA-p⑶的分布的散点图； 图10箱式图显示35例肝癌和35例临床资料匹配的慢性肝病患者血清中ConA-p⑶中位数、25百分位、75百分位、最大及最小值分布情况；图11为ROC曲线显示AUC (曲线下面积)为0. 8825时ConA-p⑶的敏感性和特异性分别为 85%、80%。
具体实施方式
以下通过优选实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的保护范围并不局限于此。实施例1
一种与血清中刀豆素A特异结合的组织蛋白酶D酶原ConA-pCD，其由下述方法制得 ①刀豆素A亲和层析柱的制备在Poly-Pr印层析柱内加入100 μ 刀豆素A琼脂糖凝胶 (购自Vector Laboratory), 500 rpm离心2 min后弃去流出液，然后加入2 ml含0. 1%(ν/ ν) Triton X-100的糖蛋白结合缓冲液，旋转摇床孵育10 min，离心后弃去流出液，再加入2 ml糖蛋白结合缓冲液，旋转摇床孵育10 min, 500 rpm离心2 min后弃去流出液，备用；所述糖蛋白结合缓冲液组成为30 mM Bis-Tris, 150mM NaCl, ImM CaCl2, ImM MnCl2, pH 7. 2 ；
②取20μ 血清，13，000 rpm离心后取20 μ 上清并加入糖蛋白结合缓冲液至终体积为lml，接着转入上述制备好的刀豆素A亲和层析柱内，旋转摇床于25°C孵育2 h ；500 rpm 离心2 min后弃去流出液，加入1 ml含200 mM甲基-α-D吡喃甘露糖苷的糖蛋白结合缓冲液，即刀豆素A结合糖蛋白的洗脱液，旋转摇床孵育10 min, ,500 rpm离心2 min并收集洗脱液，洗脱4次；
③合并收集的4次洗脱液，并加入_20°C的丙酮至丙酮体积终浓度为80%，-20°C过夜， 15，OOOg离心15 min弃上清，室温干燥20min即得。步骤③所得产物可用100 μ 蛋白裂解液溶解后，采用Western blot和光密度半定量方法检测ConA-p⑶的血清表达量。蛋白裂解液组成8M尿素，2% CHAPS, 15mM DTT, Proteinase inhibitor cocktail。具体试验结果如下
1)应用免疫沉淀技术分别从肝癌患者和慢性肝病患者的混合血清(由20例肝癌血清和临床资料匹配的非肝癌对照血清制备)、一对肝癌(3318)及非癌对照血清中免疫沉淀血清总⑶和ρ⑶，Western blot技术检测结果表明血清总⑶和ρ⑶水平在肝癌患者中降低 (见图7B);然而，应用ConA亲和层析技术分离纯化血清中的与ConA结合的高甘露糖型糖蛋白后，再用Western blot技术检测，发现ConA-pCD在肝癌患者血清中显著升高(图7A)。2)采用ConA亲和层析和免疫亲和层析技术从肝癌及慢性肝病患者的混合血清中(由20例肝癌患者血清和临床资料匹配的慢性肝病患者血清制备)纯化ConA-p⑶，二维电泳方法检测发现=ConA-P⑶呈pH为4. 5 6. 0的一系列同一分子量、不同等电点的异质体，其中PH为4. 5 5. 5的4个ConA-p⑶异质体在肝癌患者的血清中升高尤其显著，而偏碱性的P⑶差异不明显。3 )应用ConA亲和层析技术分离纯化35例肝癌和35例非癌对照血清中的与 ConA结合的高甘露糖型糖蛋白，再用Western blot技术检测、图像软件半定量分析表明 ConA-p⑶光密度均值在肝癌血清中升高了 4. 3倍(见图8、9和10)；统计学分析表明R0C 曲线显示AUC (曲线下面积)为0. 8825时ConA-p⑶的敏感性和特异性分别为85%、80% (见图 11)。上述结果证实血清ConA-p⑶是一种潜在的、具有临床应用前景的新型肝癌诊断的血清标志物。
权利要求
1.一种与血清中刀豆素A特异结合的组织蛋白酶D酶原ConA-P⑶，其特征在于，由下述方法制得①制备刀豆素A亲和层析柱在层析柱内加入100 1000μ 刀豆素A琼脂糖凝胶， 离心弃去流出液，然后加入1 5 ml含0. 1% Triton X-100的糖蛋白结合缓冲液，旋转摇床孵育5 15 min，离心弃去流出液，再加入1 5 ml糖蛋白结合缓冲液，旋转摇床孵育 5 15min，离心弃去流出液，备用；所述糖蛋白结合缓冲液组成为30 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 1 5 mM CaCl2, 1 5 mM MnCl2, pH 6· 0 了· 2 ；②取血清，离心后取20 100μ 上清并加入糖蛋白结合缓冲液至终体积为0. 5 5 ml，然后转入上述制备好的刀豆素A亲和层析柱内，旋转摇床于室温孵育至少2 h或于4°C 孵育10 12 h;然后离心弃去流出液，加入0.5 2 ml含200 400 mM甲基-a-D吡喃甘露糖苷的糖蛋白结合缓冲液，即刀豆素A结合糖蛋白的洗脱液；旋转摇床孵育5 15 min,，离心并收集洗脱液，洗脱2 6次；③在上述收集的洗脱液中加入-20°C的丙酮至丙酮体积终浓度为80%，-20°C放置10 12h，离心弃上清，室温干燥后即得。
2.如权利要求1所述与血清中刀豆素A特异结合的组织蛋白酶D酶原ConA-p⑶，其特征在于，所述步骤①为在Poly-Pr印层析柱内加入100 μ 刀豆素A琼脂糖凝胶，离心弃去流出液，然后加入2 ml含0. l%Triton X-100的糖蛋白结合缓冲液，旋转摇床孵育lOmin， 离心弃去流出液，再加入2ml糖蛋白结合缓冲液，旋转摇床孵育lOmin，离心弃去流出液， 备用；所述糖蛋白结合缓冲液组成为30 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, pH 7. 2。
3.如权利要求1所述与血清中刀豆素A特异结合的组织蛋白酶D酶原ConA-p⑶，其特征在于，所述步骤②为取血清，离心后取20 μ 上清并加入糖蛋白结合缓冲液至终体积为 1 ml，然后转入上述制备好的刀豆素A亲和层析柱内，旋转摇床于室温孵育2 h或于4°C孵育10 12 h;然后离心弃去流出液；加入1 ml含200 mM甲基-α-D吡喃甘露糖苷的糖蛋白结合缓冲液，即刀豆素A结合糖蛋白的洗脱液；旋转摇床孵育10 min，，离心并收集洗脱液，洗脱4次。
全文摘要
本发明涉及一种与血清中刀豆素A特异结合的组织蛋白酶D酶原ConA-pCD，其由下述方法制得①制备刀豆素A亲和层析柱，备用；②取血清，离心后取上清并加入糖蛋白结合缓冲液至终体积为0.5～5ml，然后转入上述制备好的刀豆素A亲和层析柱内，旋转摇床于室温孵育至少2h；然后离心弃流出液，加入含甲基-α-D吡喃甘露糖苷的糖蛋白结合缓冲液，旋转摇床孵育，离心并收集洗脱液；③在洗脱液中加入丙酮至终浓度为80%，-20℃过夜，离心弃上清，室温干燥后用蛋白裂解液溶解即可检测ConA-pCD。结果证实血清ConA-pCD是一种潜在的、具有临床应用前景的新型肝癌诊断的血清标志物。
文档编号C12N9/64GK102492680SQ20111045447
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者刘峰涛, 刘瑞敏, 张军, 晁玮霞, 李涛, 杨永杰, 林波, 约翰逊·菲利普, 马远方, 齐义军 申请人:河南大学