专利名称：检测混合物中塞隆骨成分的方法及所用引物的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及应用分子生物学技术检测混合物特别是药材中塞隆骨成分的方法，具体地涉及检测药材、或者以塞隆骨或替代品入药的中药制剂中塞隆骨成分的方法，以及该方法中所用到的特异性引物。
背景技术：
塞隆，学名高原鼢鼠(Myospalax Baileyi)，哺乳动物啮齿目仓鼠科，为青藏高原特有哺乳类害畜。塞隆干燥全骨骼，属于国家级一类动物新药材，具有祛风散寒除湿、通经止痛、补益肝肾的功能，能够有效替代豹骨，填补了禁止豹骨入药后的中药医治空缺。但目前对于塞隆骨的鉴别主要采用传统形态学方法，依赖鉴别人员经验，主观性高，因此需要一种能够准确、有效的鉴别方法。另一方面，脊椎动物线粒体基因组大小为161Λ左右，呈闭合环状结构，在细胞中呈多拷贝形式存在于线粒体中(依细胞类型不同而异)。动物线粒体基因在进化上保守，且遵循严格的母系遗传特性，因此被广泛用于起源进化分析和物种鉴定。在含塞隆骨成分的混合物例如药材、或者以塞隆骨入药的中药制剂等的生产加工过程中，塞隆骨中的部分DNA通常能够保留于其中，因此，混合物中的塞隆骨成分可以从其携带的DNA检测中获得鉴定。然而，在混合物特别是药材、中药制剂中塞隆骨成分鉴定的研究技术上，由于混合物中塞隆骨DNA含量很低，并且含有多种抑制PCR反应的成分，因此，如何能够有效提取其中的DNA是分子生物学技术鉴定塞隆骨成分的一个关键；同时，含塞隆骨的混合物特别是中药制剂中通常还具有较多的其它动植物物种，如何设计塞隆物种特异性引物也成为鉴定技术的另一关键。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种利用分子生物学技术检测混合物特别是药材、中药制剂中塞隆骨成分的方法，以准确、有效地鉴别混合物中是否含有塞隆骨成分。本发明的另一目的在于提供一种用于分子生物学技术检测混合物特别是药材、中药制剂中塞隆骨成分的方法中的特异性引物。本发明的另一目的在于提供了一种用于分子生物学技术检测混合物特别是需要鉴别是否为塞隆骨的药材、或者以塞隆骨或替代品入药的中药制剂中塞隆骨成分的试剂盒，其中包含本发明所述的引物。为达上述目的，一方面，本发明提供了一种利用分子生物学技术检测混合物中塞隆骨成分的方法，该方法主要包括从待测混合物中提取总DNA ；以所提取的总DNA为模板，利用特异性引物进行聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)扩增；
对扩增结果进行分析判断。如前所述，通常，含塞隆骨的混合物特别是药材、或者以塞隆骨入药的中药制剂中，塞隆骨成分含量很低，并还含有较多的其它动植物物种，还可能含有多种抑制PCR反应的成分，在此情况下，设计塞隆物种特异性引物是本发明的分子生物学检测技术的关键之
ο根据本发明的具体实施方案，本案发明人从塞隆骨中提取了总DNA，根据NCBI中公布的塞隆线粒体DNA与核DNA序列设计引物，经扩增、测序，提交blastn比对、分析等， 设计了本发明的塞隆物种特异性引物。所设计的塞隆物种特异性引物为选自如下SEQ ID Nos. 1和2(本发明中亦将该引物对命名为Z1F/R)、SEQ ID Nos. 3和4(本发明中亦将该引物对命名为Z2F/R)、以及SEQ ID Nos. 5和6 (本发明中亦将该引物对命名为Z4F/R)中的一对、两对或三对引物Z1F/R 5' -CTAGGGGTCTGTTTAGG-3，(SEQ ID NO 1)5，-TGATTCATCCGTAGTTG-3，(SEQ ID NO 2)Z2F/R 5' -TTTGCCGAGACGTCAAC-3，(SEQ ID NO 3)5，-TTCCTCGGCCTACATGA-3，(SEQ ID NO 4)Z4F/R 5' -TGACCCAAACTAATAATTAC-3，(SEQ ID NO 5)5，-TACCTCAGGTGTACTAGGA-3，(SEQ ID NO :6)。如前所述，通常含塞隆骨的混合物特别是药材、或者以塞隆骨入药的中药制剂中塞隆骨DNA成分的含量是很低的，如何能够有效提取其中的DNA，是本发明检测塞隆骨成分技术的另一个关键。根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，所述从待测混合物中提取总DNA的过程包括以下步骤待测混合物经煮沸法处理20 40分钟；加入CTAB提取缓冲液60°C 70°C消化2 4小时；用酚仿法抽提；加入异丙醇沉淀富集DNA ；利用PCR纯化试剂盒进行纯化，得到所提取的总DNA。根据本发明的具体实施方案，本发明的上述方法特别适合于对以塞隆骨入药的药材混合物或中药制剂中塞隆骨总DNA进行提取，即使药材混合物或中药制剂中塞隆骨成分含量含量低至0. 5wt% (除特别注明外，本发明中所述含量与比例均为重量含量与比例)， 或是药材或中药制剂中含有其他多种动植物成分(例如，同仁堂再造丸，含有五十八味药； 等)，也能有效提取其中的DNA。根据本发明的具体实施方案，上述从待测混合物中提取总 DNA的过程中所述煮沸法处理待测混合物样品主要是破碎细胞，具体操作时可根据需要向待测混合物中加入适量的水(通常，每3 5g总固含量的待测样品加IOml水)，煮沸通常是可以在常压下进行(100°C左右)，煮沸时间20 40分钟，优选30分钟 40分钟。所述向煮沸后的待测样品中加入CTAB提取缓冲液进行消化处理，主要是破坏混合物中的多糖多酚类物质。根据本发明的优选具体实施方案，所用CTAB提取缓冲液的组成为3% CTAB，IOOmM Tris-HCl pH8. 0,20mM EDTA pH8. 0,2. 5M NaCl。最优选的消化处理条件为等体积混合，65 °C，3小时。
所述酚仿法抽提主要是去除混合物中蛋白质、色素等溶于有机物的杂质。酚仿法抽提的具体操作可以按照所属领域的常规操作进行。根据本发明的优选实施方案，本发明中所述酚仿法抽提的操作为经CTAB缓冲液消化后的样品冷却至室温后加入等体积苯酚/ 氯仿/异戊醇05 24 1)，混勻，12000rpm离心20分钟，取上清；再加入等体积氯仿/ 异戊醇(24 1)，混勻，12000rpm离心20分钟，取上清。本发明中，向上述经酚仿法抽提得到的上清中加入异丙醇主要是沉淀富集DNA。根据本发明的优选实施方案，具体操作为加入等体积预冷的异丙醇，混勻，4°C 12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75%酒精洗涤。为便于后续纯化步骤，可将洗涤后的提取物用适量双蒸水溶解。所述利用PCR纯化试剂盒进行纯化的步骤主要是去除DNA中残留的色素等水溶性杂质。PCR纯化试剂盒可以采用所属领域常用的商购产品，具体操作可以按照纯化试剂盒的说明书进行。根据本发明的具体实施方案，当待测混合物中含有较多多糖类物质时，在提取总 DNA的过程中，在经酚仿法抽提得到的上清中，还可加入LiCl过夜处理，以去除残留多糖类物质，之后再加入异丙醇沉淀富集DNA。此外，对于利用PCR纯化试剂盒所纯化得到的总 DNA，还可进行琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取情况。在本发明的一具体实施方案中，所述的待测混合物为以塞隆骨或其替代品(例如豹骨或其他物种伪品)入药的中药制剂或混合药材，其中除塞隆骨或其替代品外，还含有其他多种动植物成分，例如，再造丸含有五十八味药等；再如，塞隆风湿胶囊中应以塞隆骨入药，但有些不法厂商会以其它物种伪品替代塞隆骨；本发明的方法是用于检测该中药制剂或混合药材中是否是真正以塞隆骨入药。在该具体实施方案中，为有效提取其中的总 DNA，是按照以下操作进行将待测混合物样品粉碎，加适量水(通常每3 5g总固含量的待测样品加IOml水)，常压煮沸30分钟 40分钟；向煮沸处理后的待测样品中加入等体积 CTAB 提取缓冲液(3% CTAB，IOOmM Tris-HCl pH8. 0,20mM EDTA pH8. 0，2. 5MNaCl)，65°C 消化处理3小时；之后冷却至室温，加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇05 24 1)，混勻， 12000rpm离心20分钟，取上清；再加入等体积氯仿/异戊醇(24 1)，混勻，12000rpm离心20分钟，取上清；加入1/4体积IOM LiCl，混合后4°C过夜；然后样品在4°C 12000rpm离心30分钟，取上清加入等体积预冷的异丙醇，混勻后4°C 12000rpm离心20分钟，弃上清；用 75 %酒精洗涤沉淀三遍后取适量双蒸水溶解，溶解的DNA经PCR纯化试剂盒纯化，得到提取的总DNA(具体可采用康为世纪PCR产物纯化试剂盒50T，货号CW0521，在其说明书指导的操作基础上，可适当增加去杂质缓冲液洗涤体积及次数，以达到更好的纯化效果)。纯化后的DNA可用0. 7%琼脂糖凝胶电泳检测提取情况。按照本发明的该提取方法，即使待测混合物中塞隆骨成分含量低至0. 5%左右，也能有效提取其DNA，用于后续PCR扩增。根据本发明的具体实施方案，本发明的分子生物学技术检测混合物特别是药材、 中药制剂等中塞隆骨成分的方法中，所述PCR扩增反应条件如下反应体系为15 μ 1，其中 10 XPCR缓冲液 1 5. 5 μ 1，dNTPs (2. 5mM) 0. 5 1. 8 μ 1， 上下游引物(10 μ Μ)各 0. 5 1. 5 μ 1，Taq DNA 聚合酶(5υ/μ 1)0. 2 1. 2 μ 1，DNA 模板 (50ng/y 1)0. 8 3μ 1，无菌超纯水补至15μ 1 ；扩增条件95°C预变性5min ；95°C变性30s，48 68°C退火30s，72°C延伸30s，共
535 40个循环；最后72°C延伸7 lOmin。本发明中，是以所述的引物对分别以所提取的DNA为模板进行PCR扩增，S卩，单重 PCR扩增。所述PCR扩增反应条件中，优选的退火温度为57°C 63°C。更优选地，其中，所述引物对SEQ ID Nos. 1和2的最佳退火温度为57°C，所述引物对SEQ ID Nos. 3和4的最佳退火温度为63°C，所述引物对SEQ ID Nos. 5和6的最佳退火温度为57°C。根据本发明的具体实施方案，本发明的分子生物学技术检测混合物特别是药材、 中药制剂中塞隆骨成分的方法中，所述对扩增结果进行分析判断主要是进行定性分析，定性分析方法可以是本领域普通技术人员已知的，例如，该分析过程可包括用凝胶电泳显示所述扩增的产物，根据是否扩增出目的片段，以定性检测待测混合物中是否存在相应的塞隆骨成分。本发明中，所述的待测混合物可以是指含有或可能含有塞隆骨成分的任何混合物，包括药材、中药制剂等。具体地，当需要鉴别某一药材是否为塞隆骨时，或者需要鉴别某一中药制剂是以塞隆骨或是其他物种的替代品入药时，本发明的检测方法特别适用。可以理解，本发明的方法所适用的待测混合物中并不含有塞隆物种除塞隆骨外的其它组织成分，或者已通过其它方法排除含有塞隆的其它组织成分，即，本发明的方法是特别针对以塞隆骨入药或以塞隆骨的替代品入药的中药制剂进行检测，判别其中是否含有塞隆骨成分。根据本发明的具体实施方案，本发明的分子生物学技术检测混合物特别是药材、 中药制剂中塞隆骨成分的方法还包括将待测混合物样品的扩增结果与从塞隆骨中提取DNA进行PCR扩增的结果进行对照，分析判断所测混合物中是否存在塞隆骨成分。从塞隆骨中提取DNA的具体操作可以按照生物技术领域从单一物种中提取DNA的常规操作进行。根据本发明的具体实施方案，本发明的分子生物学技术检测混合物特别是药材、 中药制剂中塞隆骨成分的方法中，是以引物对SEQ ID Nos. 1和2、SEQ ID Nos. 3和4、以及 SEQ ID Nos. 5和6分别进行PCR扩增，如果扩增出一个、二个或三个相应的目的片段，则初步判断所测混合物中存在塞隆骨成分。特别是以引物对SEQ ID Nos. 1和2、SEQ ID Nos. 3 和4、以及SEQ ID Nos. 5和6分别进行PCR扩增，均能扩增相应的目的片段，则所测混合物中存在塞隆骨成分。另一方面，本发明还提供了用于实现本发明所述检测混合物中塞隆骨成分的方法的引物，该引物包括选自:SEQ ID Nos. 1和2、SEQ ID Nos. 3和4、以及SEQ ID Nos. 5和6 中的一对、两对或三对引物。本发明的上述引物对，在检测混合物特别是需要鉴别是否为塞隆骨的药材、以塞隆骨或替代品入药的中药制剂中是否存在塞隆骨成分中具有应用前景，能够特异性检测待测混合物中是否含有塞隆骨成分，并且，检测灵敏度高，当混合物中包含的塞隆骨成分含量为0.5% (质量百分比)时，也能有效提取并特异性地检测出来。另一方面，本发明还提供了一种检测混合物中塞隆骨成分的试剂盒，该试剂盒中包含本发明所述的引物，优选还可进一步包括相应的PCR缓冲液、dNIPs、DNA聚合酶等。具体地，其中所述的引物是本发明所述的引物对SEQ ID Nos. 1和2、SEQ ID Nos. 3和4、以及 SEQ ID Nos. 5和6中的一对、两对或三对引物。有益效果
综上所述，本发明从含塞隆骨成分的混合物中提取了总DNA，设计了塞隆物种特异性引物，分别以所述塞隆物种特异性引物PCR扩增含有塞隆骨或伪品成分的混合物DNA。 本发明所设计的扩增引物以及扩增方法具有较高的特异性，且检测灵敏度高，可单独作为一种快速检测方法应用于对含有塞隆骨或伪品成分的混合物特别是药材、中药制剂进行检测，准确地定性检测混合物中塞隆骨成分的存在情况。
图1显示按照本发明实施例1的方法从不同药材中提取总DNA的琼脂糖电泳检测结果。图中，M为IOObp DNA Ladder，泳道1 山羊角粉，泳道2 羚羊角粉，泳道3 塞隆骨， 泳道4:豹骨。图2显示从一些半成品或成品中药制剂中提取总DNA的琼脂糖电泳检测结果。其中，泳道1代表同仁堂再造丸半成药(豹骨方)；泳道2代表同仁堂再造丸成药(豹骨方)； 泳道3代表同仁堂再造丸半成药(塞隆骨方)；泳道4代表同仁堂再造丸成药(塞隆骨方)； 泳道5代表羚羊清肺丸半成药(羚羊角方)；泳道6代表羚羊清肺丸成药(羚羊角方)；泳道7代表羚羊清肺丸半成药(山羊角方)；泳道8代表羚羊清肺丸成药(山羊角方)；M为 DL2000。图3显示利用通用引物对SEQ ID Nos. 7和8 (12SF/R)以从塞隆骨中提取的DNA 为模板进行PCR扩增的产物测序结果。图中，上方序列是塞隆(Myospalax baileyi)序列， 下方序列是以金钱豹(Panthera pardus)序列做对照。图4显示利用通用引物对SEQ ID Nos. 9和10 (cytbF/R)以从豹骨中提取的DNA 为模板进行PCR扩增的产物测序结果。图中，上方序列是塞隆(Myospalax baileyi)序列， 下方序列是以金钱豹(Panthera pardus)序列做对照。图5显示依据塞隆物种特异分子标记(SNP)特征设计用于塞隆物种检测的特异引物结果。其中，上方序列为塞隆物种序列，下方序列为豹序列，方框内所标示部分为所设计的引物部分。图6为用塞隆物种特异性引物PCR扩增不同混合物样品DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中，泳道1为再造丸(豹骨方)，泳道2为塞隆风湿胶囊(豹骨方)，泳道3为再造丸(塞隆骨方)，泳道4为塞隆风湿胶囊(塞隆骨方)，泳道5为豹骨药材，泳道6为塞隆骨药材，泳道7为空白对照。
具体实施例方式为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件；实施例中所用到的各种化学试剂均可商购获得，各试剂除标注外，均购自北京化学试剂公司；所用引物委托hvitrogen公司合成。实施例1再造丸(塞隆方)中塞隆骨成分鉴定
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1、塞隆骨总DNA的提取该提取步骤可以按照所属领域的常规操作进行。本实施例的具体操作如下塞隆骨用研钵研磨成小块，先经EDTA脱钙(10% EDTA溶液(pH7. 0) 48小时后方可用于DNA提取。样品(脱钙后塞隆骨，初始重)中加入Iml裂解液A(10mM Tris-HCl ρΗ8. 0， 0. IMEDTA pH8. 0,0. 5% SDS,200y g/ml 蛋白酶 K)，55°C消化过夜。消化样品 12000rpm 离心 15min取上清进行酚仿抽提。之后用2倍体积无水乙醇沉淀DNA，再用75%乙醇洗沉淀两遍，适量50 μ 1双蒸水溶解。样品DNA经PCR纯化试剂盒(康为世纪PCR产物纯化试剂盒 50Τ，货号CW0521，具体操作按照说明书进行)纯化，得DNA提取样品。经0.7%琼脂糖凝胶电泳检测，结果请参见图1所示。另，按照上述方法以豹骨为原料提取得到DNA。此外还分别以山羊角、羚羊角为原料，按照传统方法，均分别提取得到DNA。各原料所提取的DNA的琼脂糖凝胶电泳检测请参见图1所示。2、再造丸(塞隆方)中总DNA的提取选用3批次(10丸/批次)同仁堂再造丸成药(塞隆骨方)为待测样品。每份样品取所述再造丸(塞隆骨方)成药(五十八味)4g(约1丸)，其中塞隆骨成分约占0.5% (质量百分比)。将药丸切碎，用IOml双蒸水充分溶解后，100°C水浴30分钟，冰浴10分钟冷却，4°C 12000rpm离心20分钟，取上清；加入等体积(IOml) CTAB提取缓冲液(3% CTAB, IOOmM Tris-HCl pH8. 0,20mM EDTA ρΗ8·0，2·5Μ NaCl)，65°C水浴 3 小时；样品冷却至室温后加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇05 24 1)，缓慢颠倒混勻，12000rpm离心20分钟， 取上清；加入等体积氯仿/异戊醇04 1)，缓慢颠倒混勻，12000rpm离心20分钟，取上清；加入1/4体积IOM LiCl，缓慢颠倒混合后4°C过夜；样品4°C 12000rpm离心30分钟，取上清加入等体积预冷的异丙醇，缓慢混勻后4°C 12000rpm离心20分钟，弃上清；用75%酒精洗涤沉淀三遍后取适量双蒸水溶解。溶解的DNA经PCR纯化试剂盒(康为世纪PCR产物纯化试剂盒50T，货号CW0521，按照说明书的操作进行，并增加去杂质缓冲液洗涤体积至 350 μ 1、洗涤次数增为2次纯化，得到纯化的DNA。纯化的DNA经0. 7%琼脂糖凝胶电泳检测提取情况，结果请参见图2 (3批次共30例样品提取结果电泳图基本类似，图中仅示意性给出其中一例情况)。另，分别以同仁堂再造丸半成药(塞隆骨方)(3批次，10丸/批次，每丸为一例样品，约4g)、再造丸半成药(豹骨方)(3批次，10丸/批次，每丸为一例样品，约4g)、再造丸成药(豹骨方)(3批次，10丸/批次，每丸为一例样品，约4g)、羚羊清肺丸成药(山羊角方)(3批次，5丸/批次，每丸为一例样品，约4g)、羚羊清肺丸半成药(山羊角方)(3批次， 5丸/批次，每丸为一例样品，约4g)、羚羊清肺丸成药(羚羊角方)(3批次，5丸/批次，每丸为一例样品，约4g)、羚羊清肺丸半成药(羚羊角方)(3批次，5丸/批次，每丸为一例样品，约4g)为待测样品，按照上述方法，均分别提取得到了总DNA，各种待测样品的琼脂糖凝胶电泳检测请参见图2所示(同样的，由于每种样品的多例提取结果电泳图基本类似，图中仅示意性给出其中一例情况)。本发明中，所述的“塞隆骨方”是指该中药中确实是以塞隆骨入药(例如，所述的再造丸(塞隆骨方)是指该再造丸中确实是以塞隆骨入药)；所述的“豹骨方”是指与相应的塞隆骨方的中药相比，差异主要在于其中是以豹骨入药而非以塞隆骨入药，其它组分基本相同；所述再造丸中并不含除塞隆骨之外的其它塞隆组织成分；所述的“羚羊角方”是指该中药中是以羚羊角入药；所述的“山羊角方”是指与相应的羚羊角方的中药相比，差异主要在于其中是以山羊角入药而非以羚羊角入药，其它组分基本相同；所述羚羊清肺丸中并不含有塞隆或是豹组织成分。3、物种特异性引物及PCR反应条件(1)塞隆特异性引物的设计根据NCBI上提供的塞隆线粒体基因组部分序列(CYTB :EF530744,12SrRNA AF387079)及相近物种(鼹鼠等)线粒体全序列(鼹鼠NC_005035、田鼠NC_008064、小鼠 NC_006915)，通过 DNAstar 在 12SrRNA、cytb 区域设计通用引物 12SF/R、cytbF/R。引物信息见表1所示，利用所述引物对SEQ ID Nos. 7和8、SEQ ID Nos. 9和10分别对前述“1、 塞隆骨总DNA的提取”过程中提取得到的纯化的DNA为模版，进行PCR扩增(反应体系为 15μ 1，其中 IOXPCR 缓冲液(商业化产品，内含 Tris-HCl pH8. 5 lOOmM、KCl 500mM、 MgC1215mM) 1. 5 μ 1，dNTPs (2. 5mM) 1. 5 μ 1，上下游引物(10 μ Μ)各 0· 5 μ 1，Taq DNA 聚合酶 (5U/y 1)0. 3μ 1，DNA模板(50ng/μ 1) 1 μ 1，无菌超纯水补至15 μ 1。扩增条件:95°C预变性 5min ；95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s，40 个循环；72°C延伸 IOmin)，扩增产物经 DNA 测序(测序结果分别参见图 3、图 4 所示)，提交 blastn(http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)在线比对，分析，获得塞隆物种特异分子标记(SNP)，利用塞隆序列中存在的SNP，设计本发明的用于塞隆物种检测的特异引物，引物设计结果参见图5所示，其中，上方序列为塞隆序列，下方序列为豹序列，方框内所标示部分为所设计的引物部分。表1用于塞隆12SrRNA、Cytb区扩增的引物信息
权利要求
1.一种检测混合物中塞隆骨成分的方法，该方法主要包括 从待测混合物中提取总DNA ；以所提取的总DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增；所述特异性引物为选自SEQ ID Nos. 1和2、SEQ ID Nos. 3和4、以及SEQ ID Nos. 5和6中的一对、两对或三对引物； 对上述扩增结果进行分析判断。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述从待测混合物中提取总DNA的过程包括如下步骤待测混合物经煮沸法处理20 40分钟； 加入CTAB提取缓冲液60V 70°C消化2 4小时； 用酚仿法抽提； 加入异丙醇沉淀富集DNA;利用PCR纯化试剂盒进行纯化，得到所提取的总DNA。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述PCR扩增反应条件如下反应体系为15 μ 1，其中10XPCR缓冲液1 5. 5 μ l,dNTPs (2. 5mM)0. 5 1. 8μ 1，上下游引物(10 μ Μ)各 0. 5 1. 5 μ l，Taq DNA 聚合酶(5U/μ 1)0. 2 1. 2 μ 1，DNA 模板(50ng/ μ 1)0. 8 3μ 1，无菌超纯水补至15μ 1 ；扩增条件95°C预变性5min ；95°C变性30s，48 68°C退火30s, 72°C延伸30s，35 40 个循环；最后72°C延伸7 IOmin ；优选地，所述SEQ ID Nos. 1和2的退火温度为57°C，所述SEQ ID Nos. 3和4的退火温度为57°C，所述SEQ ID Nos. 5和6的退火温度为57°C。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述对上述扩增结果进行分析判断的过程包括用凝胶电泳显示所述扩增的产物。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述待测混合物为需要鉴别是否为塞隆骨的药材、或者以塞隆骨或替代品入药的中药制剂。
6.根据权利要求1所述的方法，该方法还包括将待测混合物样品的扩增结果与从塞隆骨中提取DNA进行PCR扩增的结果进行对照， 分析判断所测混合物中是否存在塞隆骨成分。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其中，以SEQID Nos. 1和2、SEQ ID Nos. 3和4、 以及SEQ ID Nos. 5和6分别进行PCR扩增，扩增出一个、二个或三个相应的目的片段，则所测混合物中存在塞隆骨成分。
8.用于实现权利要求1 7任一项所述检测混合物中塞隆骨成分的方法的引物，该引物包括选自SEQ ID Nos. 1和2、SEQ ID Nos. 3和4、以及SEQ ID Nos. 5和6中的一对、两对或三对引物。
9.权利要求8所述的引物在检测混合物中是否存在塞隆骨成分中的应用；优选地，所述待测混合物为需要鉴别是否为塞隆骨的药材、或者以塞隆骨或替代品入药的中药制剂。
10.一种检测混合物中塞隆骨成分的试剂盒，该试剂盒包含权利要求8所述的引物，优选还进一步包括PCR缓冲液、dNTPs和DNA聚合酶。
全文摘要
本发明提供了一种检测混合物中塞隆骨成分的方法及所用引物，所述的方法主要包括从待测混合物中提取总DNA；以所提取的总DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增；所述特异性引物为选自SEQ ID Nos.1和2、SEQ ID Nos.3和4、以及SEQ ID Nos.5和6中的一对、两对或三对引物；对扩增结果进行分析判断。本发明进一步提供了包含上述引物的检测混合物特别是需要鉴别是否为塞隆骨的药材、或者以塞隆骨或替代品入药的中药制剂中塞隆骨成分的试剂盒。本发明的引物具有较高的特异性和灵敏性。
文档编号C12N15/11GK102424846SQ20111043965
公开日2012年4月25日 申请日期2011年12月23日 优先权日2011年12月23日
发明者刘名, 姚璐, 张晓兰, 张薇, 曹梦, 杜菁, 王海, 解素花 申请人:北京中研同仁堂医药研发有限公司, 北京同仁堂科技发展股份有限公司, 北京同仁堂股份有限公司