专利名称：一种利用细菌发酵生产透明质酸钠的生产工艺的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及透明质酸钠的微生物发酵技术领域，尤其是涉及一种利用细菌发酵生产透明质酸钠的生产工艺。
背景技术：
透明质酸是一种广泛存在于动物结缔组织和某些微生物荚膜中，具有独特分子结构和理化性质的大分子酸性粘多糖，因其很高的粘弹性和极强的保水性，可以起到诸如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质、水、电解质扩散及运转，促进创伤愈合以及改善皮肤营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老等作用，目前已被广泛应用于临床医学、制药及化妆品工业。早期透明质酸是以动物组织如人脐带、鸡冠、牛眼玻璃体等为原料，经提取、除杂、沉淀和分级分离后制得的，这种方法因原材料来源有限，分离纯化复杂、成本高昂而逐渐被微生物发酵法所代替。后者具有产量不受动物原料资源限制，成本较低，分离纯化工艺简捷，易于规模化生产等优点。但是野生的透明质酸生产菌株普遍产量较低，由此造成的高成本问题使其不适用于规模化生产，为此，我们综合采用了多种诱变选育方法对一株野生菌进行了优选，最终得到了一株高产菌，其产量最高可达10g/L，由此大大降低了生产成本。后续的分离纯化工艺较之采用离子交换等方法来说大为简捷，提高了分离效率，最高收率可达 80%。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种通过对菌体的改造使其在优化后的条件下高表达量的发酵生产透明质酸，并运用过滤、吸附、络合等分离纯化技术将目的产物与发酵液分离，最终制成满足市场需求的合格产品。使用本发明生产透明质酸钠可大幅度提高生物表达量，有效的降低生产成本，从而取得较好的市场收益的利用细菌发酵生产透明质酸钠的生产工艺。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:一种利用细菌发酵生产透明质酸钠的生产工艺，包括以下步骤:(1)以马链球菌兽疫亚种为出发菌，经过亚硝基胍诱变及原生质体紫外诱变，选育得到不产β-溶血素及透明质酸酶且产透明质酸能力大大提高的遗传特性稳定的突变株，将其在斜面种子培养基上于32 38°C的温度培养18 24h后，接种至一级种子培养基中；(2)将培养好的一级种子培养液接种至二级种子培养液中，于32 38°C下培养6 12h至该培养液中的菌群处于指数生长期的前期；(3)将培养好的种子液接种至营养度较高的发酵培养基中，使菌体在下列条件下进行发酵生产:采用补料分批发酵，发酵液PH为5.0 9.0，温度为32 38°C，搅拌转速150 600rev/min，通气量 1.0 15.0vvm，培养时间 18 24h ；(4)结束发酵，将发酵液转移至提取储罐中，边搅拌边用20%三氯乙酸调pH值至3.0，静置过夜，用板框进行过滤并收集滤出液，然后用去离子水调节溶液中透明质酸的含量约为5g/L，测定该溶液的pH值，用2N的NaOH溶液将该溶液的pH调节至6.0 9.0 ;(5)以10 100g/L的添加量加入特定型号的硅藻土并搅拌2h，用不锈钢板框进行过滤,收集滤出液；(6)将另一种特定型号的硅藻土按照10 100g/L的添加量加入到上述滤出液中，搅拌2h，用不锈钢板框过滤，并收集滤出液；(7)将I 10g/L的活性炭加入上述滤出液中，搅拌2h后用板框过滤并收集滤出液；(8)取样测定单位体积的滤出液中透明质酸的含量，然后按照2: 1(质量比)的比例添加一定浓度的氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液，边加边搅拌，全部加完后，继续搅拌2h ；(9)将上述混悬液进行板框过滤并得到沉淀；(10)配置0.2 1.0mol/L的NaCl溶液，然后将上述沉淀用该氯化钠溶液溶解，溶解过程要不断搅拌，以加速溶解速率；(11)将上述完全溶解后的溶液加入I 10g/L浓度的活性炭，搅拌2h后板框过滤并收集滤出液；(12)将上述滤出液通过孔径为0.22 μ m的滤膜过滤除菌，收集滤出液；(13)往上述滤出液中加入2 3倍体积的95%乙醇溶液，搅拌使原溶液中的透明质酸沉淀出来，至不再有沉淀产生时进行板框过滤，收集沉淀至洁净容器中，用95%乙醇洗2 3次，然后将沉淀放置于真空干燥箱内进行干燥；
(14)收集干燥后的产品并进行粉碎即得到最终的产品透明质酸钠。步骤(I)中的选育方法为:以一株马链球菌兽疫亚种为出发菌株，采用在平板培养基中添加I 10%无菌绵羊血或0.01 0.1 %透明质酸钠的筛选手段，经过亚硝基胍诱变及原生质体紫外诱变育种技术，筛选得到表达量高、不产β-溶血素及透明质酸酶且遗传特性稳定的突变菌株。步骤(I)中马链球菌兽疫亚种的突变株的选育方法为:(I)按照下述方法配制血琼脂平板培养基:称量葡萄糖5.0g，牛肉膏10g，酵母粉5g, MgSO4L Og,琼脂20g,加水1L,高温高压灭菌后,冷却至45°C时加入20ml无菌绵羊血,混合均匀，放置于45 °C水浴中，备用。(2)对出发菌马链球菌兽疫亚种进行亚硝基胍诱变:将斜面培养基上培养24h后的新鲜菌种接种至液体种子培养基中，于32°C下震荡培养12h，将该液体培养液离心后丢弃上清，得到的菌体沉淀物用无菌生理盐水悬浮，并用脱脂棉过滤，适当稀释制得IO8个/ml的菌悬液，得到的菌悬液置于小三角烧瓶中，并加入200μ g/ml的亚硝基胍溶液，混匀后于32°C下震荡培养30min，然后用稀释法终止反应，并将诱变后的菌液加入液体培养基中于32°C下震荡培养lh，取Iml经过中间培养的菌液加入上述血琼脂平板培养基中，混匀后倾倒入平皿中，培养48h，挑取平板上不产生透明圈的单菌落进行保藏，得到不产β -溶血素的突变株。(3)配制与(I)中所述成分相同的平板培养基，高温高压灭菌后，加入无菌透明质酸钠使其浓度为0.02%，但不加入绵羊血，放入45°C水浴中，备用。
(4)按照(2)中所述方法取不产β_溶血素的突变株作为出发菌制备菌悬液并用亚硝基胍处理，然后取经过中间培养Ih的菌液Iml加入(3)中所述的平板培养基中，混匀后倾倒入平皿中，培养48h后，将I %浓度的无菌氯化十六烷基吡啶溶液均匀的倒在平板上，放置IOmin后，挑取平板上菌落周围有浑浊带的单菌落进行保藏，得到既不产β-溶血素同时也不产透明质酸酶的突变株。(5)取(4)中所述得到的突变菌株作为出发菌，进行原生质体紫外诱变选育高产透明质酸的变异株。原生质体制备与再生的最佳条件为:将出发菌用液体种子培养基培养Ilh后离心得到菌体，加入高渗缓冲液溶解的蜗牛酶及纤维素酶，在35°C恒温处理lh，离心，用高渗缓冲液洗涤得到原生质体悬液，在15w紫外灯下，于30cm处，照射300s，然后将处理过的菌液混入软琼脂再生培养基，倾倒至再生培养基平板上。培养48h后，以出发菌作为对照组，挑取平板上长势良好，粘性大且菌落大于对照组菌的单菌落进行摇瓶发酵培养，于32°C振荡培养24h后，测定发酵液中的透明质酸含量。上述软琼脂再生培养基的成分为:葡萄糖5.0g，牛肉膏10g，酵母粉5g，MgSO4L Og,琼脂4g,加水IL ;再生培养基的成分为；葡萄糖5.0g,牛肉膏IOg,酵母粉5g,MgSO4LOg,琼脂 20g，加水 IL0可以反复进行紫外诱变选育，以期得到产量更高的正突变菌株。我们共进行了 6次紫外诱变，最终得到一株既不产生溶血素同时也不产生透明质酸酶的高产菌SY-121，经过发酵培养，最终发酵液中透明质酸的浓度为10g/L。经过10次传代培养，产透明质酸能力没有下降。所述的斜面种子培养基的成分为:葡萄糖1.0 10g/L,牛肉膏10 50g/L,酵母粉 5 15g/L, Na2HPO4 0.5 2.0g/L, MgSO4 0.2 1.0g/L。所述的发酵培养基成分为:葡萄糖10 70g/L，酵母粉10 50g/L，Na2HPO4I 5g/L，MgSO4 I 5g/L，消泡剂 0.5 1.5g/L。所述的补料分批发酵是将总糖为70g/L，初糖为10g/L，剩余的葡萄糖按照1:3:5: 7的量分四次分别于发酵的第8h，9h，10h，14h添加到发酵液中，发酵过程中不断调节进气量及搅拌转速，使发酵液的溶氧维持在10 70%的范围内，搅拌转速不可大于600rev/mino步骤(5)中所述的特定型号的硅藻土为型号为⑶10的硅藻土。步骤(6)中所述的特定型号的硅藻土为型号为⑶3的硅藻土。步骤(7)中所述的活性炭为针形活性炭。步骤(8)中所述的一定浓度的氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液是将CPC溶于去离子水得到浓度为100g/L的溶液。与现有技术相比，本发明的技术方法，通过小试、中试，已建立起一套成熟的生产工艺，可以用于规模化生产，最后制得的产品符合国际通用标准，满足市场需求。具体的产品质量标准可达到:
权利要求
1.一种利用细菌发酵生产透明质酸钠的生产工艺，其特征在于，该工艺包括以下步骤: (1)以马链球菌兽疫亚种为出发菌，经过亚硝基胍诱变及原生质体紫外诱变，选育得到不产β-溶血素及透明质酸酶且产透明质酸能力大大提高的遗传特性稳定的突变株，将其在斜面种子培养基上于32 38°C的温度培养18 24h后，接种至一级种子培养基中； (2)将培养好的一级种子培养液接种至二级种子培养液中，于32 38°C下培养6 12h至该培养液中的菌群处于指数生长期的前期； (3)将培养好的种子液接种至营养度较高的发酵培养基中，使菌体在下列条件下进行发酵生产:采用补料分批发酵，发酵液pH为5.0 9.0，温度为32 38°C，搅拌转速150 600rev/min，通气量 1.0 15.0vvm，培养时间 18 24h ； (4)结束发酵，将发酵液转移至提取储罐中，边搅拌边用20%三氯乙酸调pH值至3.0，静置过夜，用板框进行过滤并收集滤出液，然后用去离子水调节溶液中透明质酸的含量约为5g/L，测定该溶液的pH值，用2N的NaOH溶液将该溶液的pH调节至6.0 9.0 ; (5)以10 100g/L的添 加量加入特定型号的硅藻土并搅拌2h，用不锈钢板框进行过滤，收集滤出液； (6)将另一种特定型号的硅藻土按照10 100g/L的添加量加入到上述滤出液中，搅拌2h，用不锈钢板框过滤，并收集滤出液； (7)将I 10g/L的活性炭加入上述滤出液中，搅拌2h后用板框过滤并收集滤出液； (8)取样测定单位体积的滤出液中透明质酸的含量，然后按照2: 1(质量比)的比例添加一定浓度的氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液，边加边搅拌，全部加完后，继续搅拌2h ; (9)将上述混悬液进行板框过滤并得到沉淀； (10)配置0.2 1.0mol/L的NaCl溶液，然后将上述沉淀用该氯化钠溶液溶解，溶解过程要不断搅拌，以加速溶解速率； (11)将上述完全溶解后的溶液加入I 10g/L浓度的活性炭，搅拌2h后板框过滤并收集滤出液； (12)将上述滤出液通过孔径为0.22 μ m的滤膜过滤除菌，收集滤出液； (13)往上述滤出液中加入2 3倍体积的95%乙醇溶液，搅拌使原溶液中的透明质酸沉淀出来，至不再有沉淀产生时进行板框过滤，收集沉淀至洁净容器中，用95%乙醇洗2 3次，然后将沉淀放置于真空干燥箱内进行干燥； (14)收集干燥后的产品并进行粉碎即得到最终的产品透明质酸钠。
2.根据权利要求1所述的一种利用细菌发酵生产透明质酸钠的生产工艺，其特征在于，步骤(I)中的选育方法为:以一株马链球菌兽疫亚种为出发菌株，采用在平板培养基中添加I 10%无菌绵羊血或0.01 0.1 %透明质酸钠的筛选手段，经过亚硝基胍诱变及原生质体紫外诱变育种技术，筛选得到表达量高、不产溶血素及透明质酸酶且遗传特性稳定的突变菌株。
3.根据权利要求2所述的一种利用细菌发酵生产透明质酸钠的生产工艺，其特征在于，所述的亚硝基胍诱变方法为:称取IOmg NTG倒入无菌离心管中，加入0.lmol/L、pH 6.0的磷酸缓冲液10mL，暗处振荡溶解，分装至无菌小试管中，每管lmL，取ImL菌液加入上述离心管中，充分摇匀，立即置于37°C水浴振荡处理30min，NTG的终浓度为500 μ g/mL后，离心收集菌体，将含NTG的上清液倒入浓NaOH溶液弃去，用无菌水洗涤菌体3次，用大量稀释法终止NTG的诱变，最后向离心管中加2mL无菌生理盐水，涂布无菌羊血琼脂平板，筛选菌落周围不产透明圈的变异菌进行鉴别并保藏，最终得到一株不产β_溶血素的变异菌株，将其作为出发菌继续进行NTG诱变，诱变所用NTG的最终浓度调节为600 μ g/mL,涂布含0.01 0.1%透明质酸钠的筛选平板，挑选菌落周围不产透明圈的单菌落进行鉴别并保藏，即可得到既不产β -溶血素，又不产透明质酸酶的变异菌株； 所述的原生质体紫外诱变方法为:将上述经过亚硝基胍诱变选育得到的既不产溶血素，又不产透明质酸酶的变异菌株作为出发菌，用种子培养基培养IOh后离心得到菌体，加入2mol/L的蔗糖溶液作为高渗缓冲液，溶解的0.5mg/ml的蜗牛酶及0.2mg/ml纤维素酶溶液5ml，在32°C恒温处理lh，离心，用高渗缓冲液洗涤得到原生质体悬液，在15w紫外灯下，于30cm处，照射lmin，然后将处理过的菌液混入软琼脂种子培养基中，琼脂含量为.0.5%的种子培养基，倾倒至种子培养基平板上。于35°C培养24 48h，待平板上菌落长出后，挑取比出发菌相比菌落面积较大的单菌落进行摇瓶发酵培养，并测定透明质酸钠产量，最终得到一株比原始菌产能提高400%的菌株，即为不产β_溶血素及透明质酸酶且产透明质酸能力大大提高的遗传特性稳定的突变株。
4.根据权利要求1所述的一种利用细菌发酵生产透明质酸钠的生产工艺，其特征在于，所述的斜面种子培养基的成分为:葡萄糖1.0 10g/L,牛肉膏10 50g/L,酵母粉5 15g/L, Na2HPO4 0.5 2.0g/L, MgSO4 0.2 1.0g/L。
5.根据权利要求1所述的一种利用细菌发酵生产透明质酸钠的生产工艺，其特征在于，所述的发酵培养基成分为:葡萄糖10 70g/L,酵母粉10 50g/L, Na2HPO4I 5g/L,MgSO4 I 5g/L，消泡剂 0.5 1.5g/L。
6.根据权利要求 1所述的一种利用细菌发酵生产透明质酸钠的生产工艺，其特征在于，所述的补料分批发酵是将总糖为70g/L，初糖为10g/L，剩余的葡萄糖按照1:3:5:7的量分四次分别于发酵的第8h，9h，10h, 14h添加到发酵液中，发酵过程中不断调节进气量及搅拌转速，使发酵液的溶氧维持在10 70%的范围内，搅拌转速不可大于600rev/min。
7.根据权利要求1所述的一种利用细菌发酵生产透明质酸钠的生产工艺，其特征在于，步骤(5)中所述的特定型号的硅藻土为型号为⑶10的硅藻土。
8.根据权利要求1所述的一种利用细菌发酵生产透明质酸钠的生产工艺，其特征在于，步骤(6)中所述的特定型号的硅藻土为型号为⑶3的硅藻土。
9.根据权利要求1所述的一种利用细菌发酵生产透明质酸钠的生产工艺，其特征在于，步骤(7)中所述的活性炭为针形活性炭。
10.根据权利要求1所述的一种利用细菌发酵生产透明质酸钠的生产工艺，其特征在于，步骤⑶中所述的一定浓度的氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液是将CPC溶于去离子水得到浓度为100g/L的溶液。
全文摘要
本发明涉及一种利用细菌发酵生产透明质酸钠的生产工艺，该生产工艺以马链球菌兽疫亚种(Streptococcus Zooepidemics)为出发菌株，经亚硝基胍诱变及原生质体紫外诱变后，采用特定的培养基，先经液态深层发酵生产高产量透明质酸，再经相应的分离纯化工艺得到高纯度透明质酸钠产品。在培养温度为32～38℃，发酵液pH值维持在5.0～9.0范围内，发酵罐搅拌转速为150～600rev/min的培养条件下，透明质酸的产量有大幅度提高，适用于工业化生产。
文档编号C12R1/46GK103173507SQ20111043626
公开日2013年6月26日 申请日期2011年12月23日 优先权日2011年12月23日
发明者杨晓辉, 叶昀, 林克, 王洪森 申请人:宁波林叶生物科技有限公司