血小板生成素模拟肽二联体与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用的利记博彩app

专利名称：血小板生成素模拟肽二联体与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于生物技术与基因工程制药领域，具体涉及血小板生成素模拟肽二联体与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术：
在临床上常会遇到由各种原因引起的原发性和继发性血小板减少症，如原发性血小板减少性紫癜、再生障碍性贫血以及肿瘤化/放疗造成的血小板减少等。对于这类疾病， 比较适合应用长效升血小板药物进行救治，一方面，可以减少用药次数，使病人的针痛之苦减少；另一方面，可以减少药物用量，降低治疗费用。血小板由巨核细胞产生，促进巨核细胞的增殖、分化是提高血小板水平的主要手段。血小板生成素(Thrombopoietin，ΤΡ0)，又称巨核细胞生长发育因子(MGDF)，是骨髓巨核细胞增殖、分化和血小板生成的最重要调控因子。1994年TPO基因被首次成功克隆后不久，人们即研制出一种聚乙二醇化的重组功能型TPO基因工程产品-PEG-rHuMGDF。动物实验结果表明，PEG-rHuMGDF不仅具有突出的促血小板生成活性，而且在体内具有较长的半衰期，单次应用即可达到显著升高血小板的效果。然而，在临床试验过程中人们发现，一些健康受试者在接受该药物治疗后所产生的抗体与内源性TPO存在交差中和反应，导致受试者出现血小板减少，从而使得PEG-rHuMGDF乃至重组人TPO的研制在1998年时即被美国FDA 叫停。受其影响，在美、欧、日本等国家至今重组人TPO都未被批准进入临床。鉴于此，人们转而寻找和开发TPO的模拟物或类似物，以期研制出新一代的升血小板药物。所谓TPO的模拟物或类似物是指与TPO —样具有结合并激活TPO受体、促进巨核细胞增殖、分化和血小板生成的功能，但又与TPO完全不同源的多肽或化合物。1997 年 Cwirla 等(Cwirla SE et al.，Science，1997，276 :1696-1699)通过噬菌体展示技术筛选到一种可特异性结合并激活TPO受体的短肽，该短肽由14个氨基酸残基组成，其化学合成的二联体多肽与TPO受体的亲和力以及促巨核细胞增殖活性都与重组人TPO相当，但其氨基酸序列又与天然TPO完全不同源，所以不会诱导体内产生TPO中和性抗体，因此称之为 TPO 模拟肽(Thrombopoietin mimetic peptide, TMP)。然而，由于 TMP 二联体多肽分子量小，在体内的生物半衰期非常短，因此体内应用效果并不理想。为了增大分子量以促进体内应用效果，有研究者尝试将TMP 二联体的氨基末端共价结合聚乙二醇 (Serres M et al. ,Stem Cells, 1999,17 :203-209)，也有研究者将TMP与免疫球蛋白(IgG) 的Fc段进行了融合(EP1144454B1)。人血清白蛋白(HSA)是血浆中的主要蛋白成分，约占血浆总蛋白的50-60%。HSA 是一种非糖基化单链蛋白，共由585个氨基酸残基组成，其分子量为66. 5kDa(A. Dugaiczyk et al.，PNAS，1982，79 :71-75)，血浆半衰期长达两周以上。HSA在宿主细胞中是以一种原肽形式合成的，其中含M个氨基酸残基组成的信号肽和前肽，在转运和分泌过程中信号肽和前肽被切除。HSA是一个稳定的惰性蛋白，并能作为药物载体。HSA已成功地在多种宿主中表达(EP330451和EP361991)，尤其在酵母细胞中可实现HSA较高水平的稳定表达。当目的多肽与HSA融合表达时不仅可以提高多肽药物的稳定性，还可以增加多肽药物在体内的半衰期。

发明内容
本发明的目的在于提供一种血小板生成素模拟肽二联体与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用。本发明所述的血小板生成素模拟肽TMP 二联体与人血清白蛋白HSA的融合蛋白， 包含1个人血清白蛋白HSA和2个血小板生成素模拟肽TMP。人血清白蛋白HSA存在天然多态性，本发明融合蛋白中的人血清白蛋白HSA也包括这些多态型。优选地，所述血小板生成素模拟肽TMP具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列， 或在该氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸残基所得到的具有所述血小板生成素模拟肽 TMP的活性的氨基酸序列。优选地，所述人血清白蛋白HSA具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，或在该氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸残基所得到的具有所述人血清白蛋白HSA的活性的氨基酸序列。 优选地，所述人血清白蛋白HSA位于融合蛋白的N-末端，2个所述血小板生成素模拟肽TMP串联成二联体位于融合蛋白的C-末端，在人血清白蛋白HSA与血小板生成素模拟肽TMP 二联体之间以及两个血小板生成素模拟肽TMP之间均设有连接肽L，所述融合蛋白用结构式表示为HSA-L-(TMP)2，具体地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :3所示，编码所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO 5所示。优选地，所述2个血小板生成素模拟肽TMP串联成二联体位于融合蛋白的N-末端，所述人血清白蛋白HSA位于融合蛋白的C-末端，在人血清白蛋白HSA与血小板生成素模拟肽TMP 二联体之间以及两个血小板生成素模拟肽TMP之间均设有连接肽L，所述融合蛋白用结构式表示为(TMP)2-L-HSA,具体地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示，编码所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO 6所示。优选地，所述人血清白蛋白HSA与血小板生成素模拟肽TMP 二联体之间以及两个血小板生成素模拟肽TMP之间的连接肽L均由1-50个氨基酸残基组成。更优选地，所述人血清白蛋白HSA与血小板生成素模拟肽TMP 二联体之间的连接肽L由1-30个氨基酸残基组成，两个血小板生成素模拟肽TMP之间的连接肽L由1-15个氨基酸残基组成。优选地，组成所述连接肽L的氨基酸主要是Gly、Ser, Pro, Tyr或Ala。本发明还提供上述融合蛋白的制备方法，主要包含步骤1)获取人血清白蛋白HSA的基因，并将该基因克隆至载体质粒1中，获得含HSA基因的质粒2 ；2)以步骤1)获得的质粒2为模板，通过PCR扩增得到加载了编码TMP 二联体序列的PCR产物，将所述PCR产物克隆至载体质粒3然后转化大肠杆菌，获得含编码HSA与TMP 二联体的融合蛋白的基因的质粒4 ；
3)通过限制性内切酶酶切、连接、转化，将编码HSA与TMP 二联体的融合蛋白的基因从质粒4亚克隆至表达载体质粒5中，获得含编码HSA与TMP 二联体的融合蛋白的基因的重组表达质粒6 ；4)将步骤幻所述的重组表达质粒6转化到感受态细胞，再转化到宿主表达系统进行表达，即得所述融合蛋白。其中步骤1)的质粒1和步骤2)的质粒3均为可用于基因克隆的常见质粒载体， 优选的是PUC57质粒。其中步骤幻的质粒5为可用于重组基因表达的常见质粒载体，优选酵母表达质粒载体，更优选的是pPICZa质粒。其中步骤4)所述宿主是酵母。本发明还涉及含有上述融合蛋白的编码基因的重组表达载体。可用于携带编码本发明融合蛋白的基因的表达载体包括但不局限于原核、真核表达系统常用的质粒。本发明还涉及含有上述重组表达载体的宿主表达系统。宿主可以是细菌、酵母及哺乳动物细胞等，其中优选的是酵母，更优选的是毕赤酵母；对于重组表达的本发明融合蛋白可以通过多种方法从相应的细胞培养物中进行提取、纯化，这些方法包括离心、超滤及液相层析等技术，其中液相层析又包括了离子交换、疏水和分子筛等层析技术。本发明所述的融合蛋白可用于制备治疗原发性或继发性血小板减少症的药物。本发明所述融合蛋白可以与药物载体一起组成药物制剂使用，这些药物载体包括水、盐水、糖类、醇类及氨基酸等。由本发明融合蛋白制成的药物制剂优选的是含水量低于3%或不含水的冻干制剂。这些药物制剂可以用于多种原发性和继发性血小板减少症的治疗，给药方式包括静脉输注、注射(包括皮下和肌肉注射)、鼻内、呼吸道等，其中优选的是皮下或肌肉注射。本发明采用基因重组技术，将两个血小板生成素模拟肽TMP序列的二联体和人血清白蛋白HSA融合，HSA和TMP 二联体之间及两个TMP之间设置有合适长度的连接肽，所产生的融合蛋白在保持TMP 二联体具有突出促巨核细胞增殖分化和血小板生成特性的基础上显著延长其在体内的半衰期，可用于制备治疗原发性或继发性血小板减少症的药物。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例， 并配合附图，作详细说明如下。


图1为pPICZ α /HSA-L- (TMP) 2重组质粒的构建流程；图2Α-2Β为HSA-L-(TMP)2编码序列的5’末端和3’末端测序结果，其中图2Α为 5’末端的测定序列(包含了部分载体序列，以及编码HSA信号肽、前肽和N端成熟肽的序列)，图2Β为3’末端的测定序列(包含HSA的C末端氨基酸的编码序列，以及编码连接肽和TMP 二联体的序列)；图3为纯化所得HSA-L-(TMP)2融合蛋白的SDS-PAGE分析结果，其中M为蛋白 Marker, 1为纯化后的HSA-L-(TMP)2融合蛋白；图4为HSA-L-(TMP)2融合蛋白的体外促巨核细胞增殖分化活性分析，其中1为空白对照组，2为TMP 二联多肽处理组，3为HSA处理组，4为HSA-L-(TMP)2融合蛋白处理组；
图5为HSA-L-(TMP)2融合蛋白的体内药代动力学分析。
具体实施例方式主要实验材料1. Pyrobest DNA Polymerase 试剂盒(TaKara 公司产品，中国大连)2.限制性核酸内切酶Asu II、Not I.Sac I (TaKara公司产品，中国大连)3. QIAprep Spin质粒提取试剂盒OiIAGEN公司，美国)4. DNA胶回收试剂盒(Omega公司，美国)5. T4 DNA连接酶试剂盒(Takara公司产品，中国大连)6.质粒载体pPICZa、毕赤酵母菌株X-33(InVitrogen公司产品，美国)
7.大肠杆菌DH5 a (本室保存)8. M07e细胞(本室保存)9. Zeocin(Invitrogen 公司产品，美国)10. SP阳离子层介质、Q阴离子层析介质、疏水和分子筛等层析介质及层析柱(GE 公司产品，美国)11.酵母提取物、胰蛋白胨(Oxford公司产品，美国)12.磷酸盐缓冲液
NaClSgKCl0.2gNa2HPO41.44gKH2PO40.24g溶于1000ml去离子水中，并用浓HCl调节pH值至7. 4，高压蒸气灭菌。13. LB 培养基酵母提取物 5g胰蛋白胨 IOgNaClIOg溶于1000ml去离子水中，并用lmol/L的NaOH调节pH值至7. 0，高压蒸气灭菌。14. YPD 培养基酵母提取物 IOg胰蛋白胨20gAgar20g溶于900ml去离子水中，高压灭菌，冷却后加入100ml经滤器除菌后的20%的右旋糖和适当浓度的kocin。15. YPDS 培养基酵母提取物 IOg胰蛋白胨 20g
山梨糖醇 182. 2g溶于900ml去离子水中，高压灭菌，冷却后加入IOOml经滤器除菌后的20 %的右旋糖和适当浓度的kocin。16. BMGY液体培养基
酵母提取物IOg
胰蛋白胨20g
无氨基酸酵母氮源134g 甘油IOg
磷酸钾26.631g溶于IOOOml双蒸水中高压灭菌，冷至室温，调节pH至6. 0，4°C保存备用。实施例1 人血清白蛋白HSA的全基因合成1、首先根据毕赤酵母偏爱密码子对编码HSA (包括M个氨基酸残基组成的信号肽和前肽)的基因序列进行优化，优化后的HSA的全长基因序列如SEQ ID NO 10所示，其中 5’端1-72个bp为编码HSA信号肽和前肽的碱基序列。信号肽和前肽在酵母细胞中表达分泌过程中会自动切除。2、委托上海生工生物工程公司合成优化后的HSA的全长基因并将其装载到PUC57 质粒中(pUC57质粒载体由上海生工生物公司提供)，获得PUC57-HSA。实施例2 :pPICZ α /HSA-L- (TMP) 2重组表达载体的构建
1、编码HSA-L- (TMP) 2的cDNA片段的获得(1)设计合成PCR引物Pl (SEQ ID NO 7) -age ttc gaa acg—atg aag tgg gta acc ttt att tcc ctt c 3'P2 (SEQ ID NO :8) :5' -ggc tct age age caa cca ttg tct caa agt tgg acc ctc aat acc aga tcc acc gcc tcc aga tcc acc tcc gcc gga tcc taa gcc taa ggc age ttg ac~3'P3 (SEQ ID NO :9) :5' -at cgc ggc cgc tta tgc tct age tgc aag cca ctg tct cag ggt agg tcc ctc gat tgg acc aga tgg ggc tct age age caa cca ttg-3'其中Pl中下划线部分碱基为限制性内切酶Asu II识别位点序列；P2中5'端为编码TMP的序列，中间斜体部分为HSA与TMP之间的Linker序列，3'端为HSA基因C-末端的特异性识别序列；P3中下划线部分碱基为限制性内切酶Not I识别位点序列，斜体部分为两个TMP之间的Linker序列。(2)PCR扩增以实施例1所得的pUC57-HSA质粒DNA为模版，以Pl和P2分别作为上、下游引物，进行PCR扩增。反应条件如下①变性94°C，5min ；②变性94°C，lmin ；③ 复性:55°C,lmin ；④延伸72°C，2min ；⑤返回步骤“②”，35循环；⑥延伸:72°C，lOmin，总循环次数为35次。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示扩增出约1. 9kb大小的 DNA条带。然后，以所得PCR产物为模版，再以Pl和P3分别作为上、下游引物，进行PCR扩增，反应条件同前，扩增获得约2. Okb大小的DNA片段。(3) HSA-L-(TMP) 2的cDNA片段克隆与测序将步骤(2)所得PCR产物与载体pUC57 进行连接，转化大肠杆菌DH5 α，涂于氨苄抗性LB板37°C培养过夜，筛选阳性克隆，具体实验步骤参照T载体克隆试剂盒操作说明(TaKara公司产品)。所得克隆送上海生工生物工程公司测序，序列正确的克隆命名为pUC57/HSA-L- (TMP) 2。2、酵母表达载体pPICZ α /HSA-L-(TMP)2的构建提取测序正确pUC57/HSA-L-(TMP)2的质粒DNA，Asu II和Not I双酶切质粒DNA， 胶回收HSA-L- (TMP) 2对应的DNA片段。同时，Asu II 和 Not I 双酶切pPICZ α-A (Invitrogen 公司产品)质粒DNA，胶回收pPICZ α -A载体片段。T4DNA酶连接两个胶回收的DNA片段， 转化大肠杆菌DH5 α，涂于kocin抗性LB板37°C培养过夜，次日挑取细菌克隆，LB液体培养基过夜培养，提取质粒DNA，再用Asu II和Not I双酶切鉴定，将能够切下约2. 01Λ 大小DNA片段的质粒送上海生工生物工程公司测序，测序正确的克隆即命名为pPICZ α / HSA-L-(TMP) 2。pPICZ α /HSA-L-(TMP)2 的构建流程如图 1 所示，HSA-L-(TMP)2 编码序列的测序结果如图2Α-2Β所示，由于编码HSA-L-(TMP)2的序列较长，为了清楚显示测定序列的正确性，特别选择了关键部位的测序结果在图2中进行展示，其中图2Α为5’末端的部分测定序列(包含了部分载体序列，以及编码HSA信号肽、前肽和成熟肽N端数个氨基酸的序列)，图2Β为3’末端的部分测定序列(包含HSA的C末端数个氨基酸的编码序列，以及编码连接肽和TMP 二联体的序列)。将测序正确的pPICZ α /HSA-L-(TMP) 2质粒DNA用&ic I酶切回收后，转化X-33 感受态细胞。电击转化参数为1500V，200 Ω，25 μ F。然后将转化菌液接种于kocin抗性 YPDS平板，30°C培养3-4天，挑取克隆，采用Pl和P3作为引物对所挑取克隆的基因组DNA 进行PCR扩增鉴定，对能够扩增出约2. 01Λ大小DNA片段的克隆进行编号登记。将得到阳性克隆分别接种BMGY液体培养基，30°C培养M小时，然后转接至培养瓶，继续培养96小时， 7500rpm低温离心15分钟，取上清，SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况，并用TMP 二联多肽的抗体(第三军医大学全军复合伤研究所研制)进行Western blot分析，显色阳性且分子量约70kD蛋白条带即为HSA-L-(TMP)2融合蛋白，选择表达水平最高的菌株作为工程菌，冻存于-70°C保种。实施例3 =HSA-L- (TMP) 2融合蛋白的表达与纯化取-70°C冻存的整合有pPICZ α /HSA-L-(TMP)2的酵母工程菌种接种于YPDS平板 30°C过夜培养活化，挑选外观优良的单个菌落接种于BMGY培养基，30°C恒温摇床220rpm振荡培养16 18h至OD6tltl ^ 3 5，然后按1 10转种1次培养至OD6tltl约为4，以此菌液为种子液。然后将种子液移种于装有7L基础盐培养基的15L发酵罐(比欧公司，瑞士)进行高密度培养发酵。每1升基础培养基中含有甘油50g、浓磷酸laiil，KOH 2. 6g，CaSO4 · 2H20 0. 6g, K2SO4 9. 5g，MgSO4 ·7Η20 7. 8g，生物素 0. 3ang，YTB 溶液(内含有 65g/L 的!^eSO4 ·7Η20， 6g/L 的 CuSO4 · 5H20, 20g/L 的 ZnSO4 · 7H20,6g/L 的 MnSO4 · 5H20 和 0. 5 % 的浓硫酸)2ml。发酵温度控制在30°C (开始甲醇诱导后控制为)，溶解氧控制在30% 40%之间，pH值控制在6.0以下，培养至甘油耗尽后开始流加甘油，继续培养至OD6tltl 150时开始流加甲醇诱导，甲醇流加速率控制在1 %左右。诱导表达60h后停止发酵，低温离心取上清，随后进行纯化。
首先将上清进行超滤层析，以去除部分色素和降低高强度的盐离子浓度，并将目的多肽浓缩，同时用20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH值7. 0)更换缓冲体系。接着过SP Sepharose Fast Flow柱进行阳离子交换层析，去除绝大部分残留色素和杂蛋白，收集含有目的多肽的组分，再上Phenyl Sepharose Fast Flow柱进行疏水层析，最后再过Supdex 200层析柱，将收集分离组分即为纯化的融合蛋白，分子量约为70KD (如图3所示)，HPLC测定其纯度大于98%。实施例4 =HSA-L- (TMP) 2融合蛋白的体外生物活性测性采用CCK-8法(改良MTT法)检测HSA_L_ (TMP) 2融合蛋白对人巨核细胞株M07e 细胞的促增殖活性，具体操作如下取对数生长期的M07e细胞，离心洗涤，再用仅含10%胎牛血清的1640培养液重新悬浮细胞，培养18-24h后收集进行细胞计数，并按5 X 105/ml转接至96孔U型板中，每孔lOOul。分别设立空白对照组(培养液中不含任何细胞因子)、 HSA对照组(IOnM)、TMP 二联肽处理组(IOnM)及等摩尔浓度的HSA-L-(TMP)2融合蛋白处理组(IOnM)，每组6个复孔，置于37°C、5% CO2孵箱培养，培养7 后每孔加入CCK-8试剂 10ul,37°C,5% CO2孵箱培养Mi后于酶标仪490nm波长检测细胞光密度值并分析细胞的增殖情况。结果显示，把44-01^)2可以显著促进巨核细胞的增殖(如图4所示)，说明本发明融合蛋白保留了 TMP 二联肽的促巨核细胞增殖活性。实施例5 =HSA-L- (TMP) 2融合蛋白的体内半衰期测定给小鼠体内皮下注射HSA-L-(TMP)2融合蛋白O00ug/kg)，于给药后1、4、对、48、 96、144、192h时间点取样采血，采用自行制备的TMP 二联肽抗体，通过酶连免疫吸附方法 (ELISA)检测小鼠血清中的HSA-L- (TMP) 2融合蛋白浓度，并计算药代动力学参数，求出融合蛋白在血液中的半衰期。结果显示HSA-L-(TMP)2融合蛋白的半衰期约为120h(如图5所示)，而文献报道皮下注射TMP 二联肽在小鼠体内的半衰期约为lh，说明通过于HSA融合显著延长了 TMP 二联肽在体内的半衰期。虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。
权利要求
1.一种血小板生成素模拟肽TMP的二联体与人血清白蛋白HSA的融合蛋白，其特征在于，包含1个人血清白蛋白HSA和2个血小板生成素模拟肽TMP。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述血小板生成素模拟肽TMP具有 SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，或在该氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸残基所得到的具有所述血小板生成素模拟肽TMP的活性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人血清白蛋白HSA具有SEQID NO 2所示的氨基酸序列，或在该氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸残基所得到的具有所述人血清白蛋白HSA的活性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人血清白蛋白HSA位于融合蛋白的N-末端，所述2个血小板生成素模拟肽TMP串联成二联体位于融合蛋白的C-末端，在人血清白蛋白HSA与血小板生成素模拟肽TMP 二联体之间以及两个血小板生成素模拟肽TMP 之间均设有连接肽L，所述融合蛋白用结构式表示为HSA-L-(TMP)2。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :3所示，编码所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO :5所示。
6.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述2个血小板生成素模拟肽TMP串联成二联体位于融合蛋白的N-末端，所述人血清白蛋白HSA位于融合蛋白的C-末端，在人血清白蛋白HSA与血小板生成素模拟肽TMP 二联体之间以及两个血小板生成素模拟肽TMP 之间均设有连接肽L，所述融合蛋白用结构式表示为(TMP)2-L-HSA。
7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示，编码所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO 6所示。
8.根据权利要求4至7中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述人血清白蛋白HSA 与血小板生成素模拟肽TMP 二联体之间以及两个血小板生成素模拟肽TMP之间的连接肽L 均由1-50个氨基酸残基组成。
9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，所述人血清白蛋白HSA与血小板生成素模拟肽TMP 二联体之间的连接肽L由1-30个氨基酸残基组成，两个血小板生成素模拟肽 TMP之间的连接肽L由1-15个氨基酸残基组成。
10.根据权利要求9所述的融合蛋白，其特征在于，组成所述连接肽L的氨基酸主要是 Gly、Ser> Pro、Tyr 或 Ala。
11.一种权利要求1所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，包含步骤1)获取人血清白蛋白HSA的基因，并将该基因克隆至载体质粒1中，获得含HSA基因的质粒2 ；2)以步骤1)获得的质粒2为模板，通过PCR扩增得到加载了编码TMP二联体序列的 PCR产物，将所述PCR产物克隆至载体质粒3并转化大肠杆菌，获得含编码HSA与TMP 二联体的融合蛋白的基因的质粒4;3)通过限制性内切酶酶切、连接并转化大肠杆菌，将编码HSA与TMP二联体的融合蛋白的基因从质粒4亚克隆至表达载体质粒5中，获得含编码HSA与TMP 二联体的融合蛋白的基因的重组表达质粒6;4)将步骤幻所述的重组表达质粒6转化到感受态细胞，再转化到宿主表达系统进行表达，即得所述融合蛋白。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤1)的质粒1和步骤幻的质粒 3均为pUC57质粒；步骤3中的质粒5为pPICZ α质粒。
13.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤4)所述宿主是酵母。
14.一种含有权利要求1所述的融合蛋白的编码基因的重组表达载体。
15.一种含有权利要求14所述的重组表达载体的宿主表达系统。
16.权利要求1所述的融合蛋白在制备治疗原发性或继发性血小板减少症的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种血小板生成素模拟肽TMP的二联体与人血清白蛋白HSA的融合蛋白及其制备方法和应用。所述融合蛋包含1个HSA和2个TMP，其中HSA位于融合蛋白的N-末端，2个TMP序列串联成二联体位于融合蛋白的C-末端，或HSA位于融合蛋白的C-末端，2个TMP序列串联成二联体位于融合蛋白的N-末端；在HSA与TMP二联体之间以及两个TMP之间均设有连接肽。所述融合蛋白具有显著促进血小板生成的特性，且在体内具有较长的半衰期，可用于制备治疗多种原发性或继发性血小板减少症等疾病的药物。
文档编号C12N1/21GK102408485SQ201110420870
公开日2012年4月11日 申请日期2011年12月15日 优先权日2011年12月15日
发明者王军平, 王崧, 王艾平, 申明强, 粟永萍, 许杨, 陈芳, 陈默 申请人:中国人民解放军第三军医大学