专利名称：枸杞胡萝卜素β-羟化酶基因及包括该基因的重组载体和宿主细胞及应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及枸杞(Lycium chinense Miller)中胡萝卜素β -羟化酶基因LmChyB 的克隆，属于分子生物学和生物技术领域。
背景技术：
在胡萝卜素分子中引进羟基、酮基、甲氧基和酯键等即可将其转化成含氧衍生物， 胡萝卜素β-羟化酶(Carotene β-hydroxylase，ChyB)可在β -胡萝卜素中引进两个羟基，将其催化成玉米黄质。目前为止，已从土豆、番茄、辣椒、拟南芥、玉米、野生烟草等植物中分离到类胡萝卜素代谢途径中的一些基因。类胡萝卜素是C40的碳氢化合物，广泛存在于植物、一些光合细菌以及藻类中的脂溶性色素，主要包括胡萝卜素(carotenes)和它们的氧化衍生物叶黄素(xanthophylls) 两大类。类胡萝卜素在植物光合作用中起着至关重要的作用，它们是光合天线和光反应中心复合体不可缺少的结构成分，还可以保护叶绿素免受强光导致的光氧化破坏。类胡萝卜素是维生素A的前体，具有增强免疫、抗氧化、增进细胞缝间联接交流、预防、延缓及治疗癌症的功能。Aluru等将细菌crtB (pds)和crtl基因串联在一起，在玉米胚乳中特异性表达， 胚乳中类胡萝卜素含量提高34倍，并积累了大量的维生素A的前体β -胡萝卜素。生物系统中一旦形成高度活泼的具有损伤能力的自由基后，就会对细胞遗传物质和细胞膜进行强烈的破坏，导致细胞功能下降，机体衰老以及疾病的发生。类胡萝卜素，尤其是胡萝卜素能抑制、清除体内自由基，可以延缓衰老和预防肿瘤、血栓、动脉粥样硬化等疾病。类胡萝卜素能增加免疫系统中B细胞的活力、消灭外源入侵的病原菌，能提高淋巴辅助T细胞的活力，协助B细胞产生抗体，并提高其他免疫组分的活性；还能增加自然杀伤细胞的数目，以消除机体内被感染的细胞或癌细胞。据报道，除胡萝卜素外，番茄红素等也有增加免疫力的功能。随着人类对类胡萝卜素药用价值及医疗保健作用的不断发现，对类胡萝卜素的种类和产量的需求也将越来越大，然而，类胡萝卜素很难用化学方法合成。现代分子生物学研究手段的发展，使得类胡萝卜素生物合成途径中的一系列关键酶的基因被陆续分离鉴定， 为通过DNA重组技术和遗传工程调控生产类胡萝卜素开辟了道路，特别是通过类胡萝卜素基因工程获得“金色水稻”和“金油菜”，极大地增强了人们开展植物类胡萝卜素基因工程的信心。
发明内容
本发明的目的在于提供一种枸杞胡萝卜素羟化酶基因。本发明的第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。本发明的目的还在于提供含有该基因的重组载体和宿主细胞。本发明的另一个目的在于提供该基因的用途。
本发明提供了一种枸杞胡萝卜素β-羟化酶基因LmChyB，如序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列构成。本发明提供了一种上述枸杞胡萝卜素β-羟化酶基因LmChyB编码的蛋白质，如序列表中所示的氨基酸序列的蛋白质。本发明提供了一种上述枸杞胡萝卜素β-羟化酶基因LmChyB重组克隆载体 pMD18-T-LmChyB。含有上述的枸杞胡萝卜素β -羟化酶基因LmChyB的重组载体，这些重组载体包括质粒。所述的质粒表达载体大肠杆菌表达载体PET28a-LmChyB。含有上述枸杞胡萝卜素β-羟化酶基因LmChyB完整编码阅读框序列的宿主细胞， 如含有上述重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。所述的宿主细胞选自大肠杆菌细胞。本发明提供了一种含有LmChyB基因工程菌。上述枸杞胡萝卜素β -羟化酶基因LmChyB的应用包括该LmChyB基因编码的蛋白在大肠杆菌中的应用；本发明的技术方案具体概述如下本发明提供的一种枸杞胡萝卜素β-羟化酶基因LmChyB，如序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，还包括所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的70%以上同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。本发明提供的一种枸杞胡萝卜素羟化酶基因LmChyB编码的蛋白，如序列表 SEQ IDN0. 2所示氨基酸序列。本发明的克隆方法由下述步骤组成从枸杞叶片中提取总RNA，根据转录组Unigene序列中枸杞胡萝卜素β -羟化酶基因核苷酸序列设计上游引物LmChyBF :5，-ATGGCTGCCGGAATTTCAGGC-3，，然后利用3 ‘ RACE 方法扩增得到完整的基因序列为939bp。本发明构建含枸杞胡萝卜素β-羟化酶基因LmChyB的大肠杆菌表达载体 PET28a-LmChyB,由下述步骤组成1)构建含有枸杞胡萝卜素β -羟化酶基因LmChyB的中间载体pMD18-T_LmChyB 设计由SEQ ID NO. 3所示的上游引物P1，和由SEQ ID N0.4所示的下游引物P2，以枸杞胡萝卜素β -羟化酶基因的cDNA为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物连接于PMD18-T载体，获得含有序列表中SEQ ID NO. 1所示的LmChyB基因的中间载体 pMD18-T-LmChyB。2)构建大肠杆菌表达载体pET28a_LmChyB 设计由SEQ ID NO. 5所示的上游引物P3，和由SEQ ID N0. 6所示的下游引物P4， 以质粒pMD18-T-LmChyB为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物经BamHI和XhoI酶切后， 将大肠杆菌表达载体pET28a经BamHI和BioI酶切，二者进行连接反应，得到大肠杆菌表达载体 pEI^8a-LmChyB。本发明提供了一种枸杞胡萝卜素羟化酶基因及包括该基因的重组载体和宿主细胞及应用，首次从枸杞中分离出编码胡萝卜素羟化酶的完整cDNA，连接到大肠杆菌表达载体上，利用外源表达系统验证枸杞LmChyB基因在蛋白水平表达的产物具有酶的活性。本发明通过提取新鲜枸杞叶片总RNA，用3' RACE技术克隆了枸杞胡萝卜素β-羟化酶基因LmChyB，得到完整的基因序列为939bp。构建了大肠杆菌表达载体 PET28a-LmChyB，应用大肠杆菌异源表达系统，对克隆的枸杞胡萝卜素β-羟化酶基因 LmLycB编码的酶活性进行了鉴定，胡萝卜素β-羟化酶LmOffB能够在β -胡萝卜素中引进两个羟基，将胡萝卜素催化成玉米黄质。本发明所述的枸杞胡萝卜素β-羟化酶基因可望用于制备转基因玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、马铃薯、棉花、谷子、大麦以及花卉和蔬菜植株。
图 lpMD18-T-LmChyB 载体示意图。图2pET28a_LmChyB酶切验证结果。图3LmChyB在大肠杆菌中的表达。图4表达LmCHYB的大肠杆菌HPLC检测结果。
具体实施例方式实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1枸杞胡萝卜素β -羟化酶基因LmChyB的克隆以 RNeasy Plant Mini Kit ^!IAGEN，German)试剂盒，从 IOOmg 新鲜枸杞叶片中提取Total RNA，根据转录组的Unigene序列设计上游引物，枸杞胡萝卜素β-羟化酶基因 LmChyB 上游引物为LmChyBF :5，-ATGGCTGCCGGAATTTCAGGC-3，。利用 3' -FULLRACE Core Set Ver. 2. 0 (TaKaRa, Japan)试剂盒扩增得到完整的基因序列。具体步骤①以Total RNA 为模板，使用3' RACE Adaptor引物进行反转录反应，合成1st Strand cDNA，反应体系如
下RNA 2 μ 13' RACE Adaptor 1 μ 15XM-MLV Buffer 2μ 1dNTP Mixture 1 μ 1RNase Inhibitor 0.25 μ 1Reverse Transcriptase M-MLV 0.25 μ 1RNase Free dH20 3. 5 μ 1反应条件42°C，60min；70°C，15min。②根据基因的上游引物与试剂盒提供的下游引物3' RACE out primer 5，-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3，，以 1st Strand cDNA 为模板，进行 PCR 反应，反应体系如下1st PCR 产物2μ1
dNTP Mixture 8 μ 1LmChyBF 2μ 13' RACE out primer 2μ 110XLA PCR Buffer II :4 μ 1MgCl2 3μ 1TaKaRa LA Taq 0. 25 μ 1dH20 28. 75 μ 1反应条件94°C，3min；94°C,30sec ；55°C,30sec ；72 °C, Imin ；72 °C，lOmin，30 个循环。实施例2克隆载体pMD18-T_LmChyB的构建过程将序列表所示的LmChyB基因与pMD18_T载体连接，反应体系如下目的PCR 片段4μ1pMD18_T 载体1μ 1SolutionI 5μ 1反应条件16°C，30min。连接产物转化E-Coli. T0P10，涂布于含氨苄的LB平板。 以目的基因为引物进行 PCR(反应条件:94°C,3min ；94°C，30sec ；54°C,30sec ；72°C, Imin ； 72°C，10min，30个循环。)得到PCR产物，电泳条带正确，然后送华大基因公司测序，测序结果在NCBI中进行Blast，表明为该基因。实施例3大肠杆菌表达载体PET28a-LmChyB的构建过程首先，以pMDIS-T-LmChyB为模版，P3和P4分别为上下游引物扩增LmChyB片段， 其反应条件为 94°C，3min ；94°C，30sec ；55°C，30sec ；72°C，2min ；72°C，lOmin，30 个循环。 在P3中引入BamHI酶切位点(GGATCC)，在P4中引入BioI酶切位点(CTCGAG)。然后，PCR 产物与pET28a质粒分别经BamHI和BioI双酶切，将二者酶切产物连接16°C，l^irs，连接 (2 μ 1 10XT4buffer,0. 5μ 1 T4DNA 连接酶，5 μ 1 载体 DNA，7. 5 μ 1 外源 DNA，5 μ 1 ddH20)。 连接产物转化E coli.ToplO，涂布于含Amp的LB平板。以目的基因为引物进行PCR得到 939bp产物，酶切鉴定得到目的条带如图2所示，最后送华大基因测序公司测序，结果表明载体pET28a-LmChyB构建正确。将构建好的植物表达载体PEI^8a-LmChyB转化大肠杆菌BL21。实施例4LmChyB基因在大肠杆菌中的功能验证在大肠杆菌中共转化质粒pACCAR16 Δ crtX(氯霉素抗性)和表达载体 PET28a-LmChyB(卡那霉素抗性)，具体步骤为①向E. coli(BL21)感受态细胞中加入两种质粒DNA各1 μ L，混勻，冰上放置30min ；②42°C热激90s，然后冰上放置2_;3min ；③加 800 μ L，37°C预热的LB液体培养基(不含抗生素)，37°C，150r/min振荡培养45min ；④吸取50 μ L上述培养液于含相应抗生素的LB固体培养基上，涂板；⑤倒置平板，37°C，培养 12hrs。枸杞胡萝卜素β-羟化酶基因LmChyB编码的酶可以将橘黄色的β -胡萝卜素转变为黄色的玉米黄质，表现为大肠杆菌菌落颜色由橘黄色转变为黄色。如图3所示Α为转化
6质粒 pACCAR16 Δ crtX ；B 为共转化质粒 pACCAR16 Δ crtX 和表达载体 pEI^8a_LmChyB。LB 液体培养基组成为10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，5g/L酵母提取物。大肠杆菌类胡萝卜素的提取①离心收集菌体，菌体质量不超过0. Sg ；②加20ml 甲醇到菌体中，重悬；③加^ι1，60% Κ0Η，重悬；④60°C温浴20min，再将样品冷却至室温； ⑤将样品与20ml含有10%乙醚的石油醚(bp. 40-60°C )转移到分液漏斗中，充分混合，萃取；⑥若样品与乙醚/石油醚分层效果不好，可以加入适量的饱和NaCl溶液和少量乙醇； ⑦收集上层有机相；⑧通氮气，吹干样品。大肠杆菌类胡萝卜素的HPLC检测将样品溶于40yL丙酮，使用nucleosil 100-3c250X4. 6mm (MN ,Germany)色谱柱，兰博(进口 SSI)四元梯度泵。按照 Sander (LaneC. Sander, Katherine Epler Sharpless, et al, Development of Engineered Stationary Phases for the Seperation of Carotenoid Isomers, Anal. Chem,1994,66 :1667-1674) 等(1994)的方法进行高效液相色谱分析。流动相为乙腈甲醇异丙醇=85 10 5， 流速为1. OmL/min，同时用Thermo 二极管阵列(diode-array detector,DAD)检测器，全波长扫描类胡萝卜素谱图。如图4所示A和B分别为为转化质粒PACCAR16 Δ crtX和共转化质粒pACCAR16 Δ crtX和表达载体pET28a_LmChyB的提取物谱图。
权利要求
1.一个枸杞胡萝卜素β-羟化酶基因，其特征在于选自以下核苷酸序列之一1)具有SEQID No. 1所示的核苷酸序列；2)SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的70%的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的枸杞胡萝卜素羟化酶基因编码的蛋白质，其特征在于所述的蛋白质具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
3.—种重组载体，其特征在于含有权利要求1所述的枸杞胡萝卜素羟化酶基因全序列或部分片段。
4.一种权利要求3所述的重组载体，其特征在于它是质粒表达载体大肠杆菌表达载体 pET28a-LmChyB0
5.一种权利要求3所述的重组载体，其特征在于它是重组载体的大肠杆菌BL21。
6.一种宿主细胞，其特征在于含有权利要求1所述的枸杞胡萝卜素羟化酶基因全序列或部分片段。
7.—种权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于它是大肠杆菌细胞。
全文摘要
本发明涉及一种枸杞胡萝卜素β-羟化酶基因及包括该基因的重组载体和宿主细胞及应用。选自以下核苷酸序列之一1)具有SEQ ID No.1序列所示的核苷酸序列；2)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的70％的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。通过提取新鲜枸杞叶片总RNA，用3′RACE技术克隆枸杞胡萝卜素β-羟化酶基因LmChyB，得到完整的基因序列为939bp。构建了大肠杆菌表达载体pET28a-LmChyB，应用大肠杆菌异源表达系统，对克隆的枸杞胡萝卜素β-羟化酶基因LmLycB编码的酶活性进行了鉴定，枸杞胡萝卜素β-羟化酶LmCHYB能够在β-胡萝卜素中引进两个羟基，将β-胡萝卜素催化成玉米黄质。
文档编号C12N15/70GK102559713SQ201110417010
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月14日 优先权日2011年12月14日
发明者关春峰, 吴疆, 季静, 李招娣, 王罡, 金超 申请人:天津大学