专利名称：用于检测裂谷热病毒s片段的引物和探针的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种用于检测裂谷热病毒S片段的引物和探针。
背景技术：
裂谷热(Rift valley fever, RVF)是一种严重的人兽共患病，也是自古以来流行于东非大峡谷地带的地方病，主要是在绵羊、山羊和牛中间传播，常可引起孕畜的流产风暴 (abortion storm)，幼龄羊死亡率高达90%以上。该病的流行周期约为5_10年。该病可感染人，患者表现发热、头痛和关节痛等流感样症状，少数有出血热和脑炎表现，偶可引发视网膜炎以至失明，病死率约1%，表现出血热症状时死亡率可高达50%左右。RVF主要经蚊虫传播，具有明显的季节性，也可通过接触感染。裂谷热病毒(RVFV)是白蛉热病毒属(Phlebovirus)，布尼病毒科(Bunyaviridae) 成员，为一种单一血清型的病毒，具有布尼病毒的典型形态学和理化特性。病毒有囊膜，直径90 llOnm，呈球形，表面有清楚的糖蛋白突起，突起直径长lOnm。病毒核酸位于病毒的核衣壳内，为单股负链RNA，RNA可分为L(大)、M(中)、S(小)三个节段。其中的S节段为双意义的RNA，即具有双定向编码功能，编码N蛋白和另外一种非结构蛋白(Nk) ；M节段编码Gl与G2两种外膜糖蛋白和两种非结构蛋白(NSm，大小分别为14kD和78kD)，Gl和G2 糖蛋白都能刺激机体产生抗体，但在体内只有G2能刺激机体产生中和抗体；L节段编码L 蛋白，L蛋白具有病毒转录酶的功能。病毒粒子不含基质蛋白。目前还未发现RVFV的分离株和试验室传代株的特异性抗原差异，但已证明各毒株的致病性存在着一定差异。目前，裂谷热病毒的诊断方法主要有病毒分离、琼脂糖免疫扩散技术、免疫荧光染色技术、血清学、分子生物学技术等诊断技术。其中病毒分离方法是RVF诊断最为高效敏感的方法，一直作为RVF诊断的经典方法。近年来，随着分子生物学技术的发展，实时荧光PCR 技术以其快速、敏感、特异性好的优点占有很大优势，引起了众多研究者的关注。荧光PCR(FQ-PCR)技术是美国PE (Perkin Elmer)公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该法自产生以来，不断发展完善，特别是随着TaqMan探针的广泛使用，到目前为止该技术已经非常成熟，具有灵敏度高(比普通PCR高100倍以上)、特异性强(在普通PCR —对引物的基础上，中间还设计有探针，只有引物和探针均完全配对，才可能得到扩增，可对少至2个核苷酸的序列差异进行鉴定，从而保证了反应的特异性)、操作安全方便(无须凝胶电泳，避免了 EB染色对人体的危害)等优点，目前已被广泛应用于细菌、病毒等病原体检测、肿瘤基因检测、免疫分析、基因表达、突变及其多态性的研究等多个领域。
发明内容
本发明的目的是提供用于检测裂谷热病毒S片段的引物和探针。本发明的另一目的是提供一种检测裂谷热病毒的荧光RT-PCR法。为了实现本发明目的，本发明的一种用于检测裂谷热病毒S片段的引物和探针，上游引物 RVFVUl :5，-GGATTACTTTCCTGTGATATCTGTTG-3，，下游弓丨物 RVFVLl 5，-GTATCCTGGGAGGRCCATCWC-3 ‘ (R 为 A 或G，W为 T 或 A)，探针 RVFVPl :5，-F1-ACTCCACT GACACAACACGACGACCACT-Q1-3‘；其中，Fl为报告荧光基团，Ql为淬灭荧光基团。优选Fl 为FAM，Ql为ECLIPSE。其中Fl还可以是FAM、HEX、TET等荧光基团，对应的Ql还可以是 TAMARA, BHQ、MGB等淬灭基团。本发明还提供检测裂谷热病毒的荧光PCR法，其以样品RNA为模板，用上述引物和探针进行实时荧光RT-PCR检测，根据扩增曲线判定样品中是否携带裂谷热病毒。25yL的反应体系含有成分如下10XPCR缓冲液(Mg2+)2.5yL;2.5mM MgCL2 5. 0 μ L ；2. 5mM dNTP 2· 5 μ L ；反转录酶 AMV 2. 5U ；Rnase 抑制剂 20U ； 10 μ M RVFVUl
0.5 μ L ； 10 μ M RVFVLl 0. 5 μ L, 10 μ MRVFVP1 0. 5 μ L, rTaq 聚合酶 2. 5U ；RNA 模板
1.6 X Kr6 1. 6 X KT1Iig,余量为双蒸水；反应程序为50°C反转录30min ；95°C预变性5min ；95°C变性10s，47°C退火20s， 45个循环，每个循环结束时采集FAM通道荧光信号。反应结束后，根据仪器自动给出的CT值判定阴阳性，当CT值<38时判定为阳性， 当CT值> 40时判定为阴性，当38 < CT < 40时判定为可疑，可疑样品需复检，复检仍为可疑者判为阳性。本发明进一步提供用于检测裂谷热病毒S片段的试剂盒，其包括前述的引物和探针。本发明引物和探针的特异性强、灵敏度高，以其建立的裂谷热病毒S片段实时荧光RT-PCR方法，具有反应快速、敏感性高、特异性强的优点，可以实现裂谷热病毒的检测。
图1显示的是裂谷热病毒S片段实时荧光PCR方法检测梯度标准质粒的扩增曲线图。图2显示的是裂谷热病毒S片段实时荧光PCR特异性扩增曲线图。图3显示的是裂谷热病毒S片段实时荧光RT-PCR方法检测裂谷热病毒样颗粒的扩增曲线图。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1引物和探针的制备1. 1引物和探针的设计与合成在美国国立生物信息中心NCBI基因库(GenBank)中检索获得裂谷热病毒S片段的保守序列，登录号为(DQ380149)。应用MegAlign软件分析其基因序列，根据引物和探针的设计原则，用BeaconDesigner 5. 0在序列的保守区域筛选到一对引物，并在该引物对的扩增区域内设定一条荧光TaqMan探针。引物序列为RVFVUl 5' -GGATTACTTTCCTGTGATATCTGTTG-3’
RVFVLl :5，-GTATCCTGGGAGGRCCATCWC-3，(R 为 A 或 G，W 为 T 或 A)，扩增产物长度为 92bp ；所述探针(RVFVPl)的序列为5，-ACTCCACTGACACAACACGACGACCACT-3‘，该探针的5’端用报告荧光染料FAM标记，3’端用淬灭荧光染料ECLIPSE标记。该探针的设计针对于所扩增序列间的高GC含量区。1.2引物和探针的制备引物和探针合成后，引物稀释为ΙΟμπιοΙ/l，探针稀释为ΙΟμπιοΙ/l，上、下游引物按照1 1的比例等体积混合，探针避光，分装后-20°C保存备用。实施例2荧光PCR检测方法的建立1. 1裂谷热S片段重组质粒的制备在美国国立生物信息中心NCBI基因库(GenBank)中检索获得裂谷热病毒S片段的保守序列，化学合成后分别在两端引入一个酶切位点(KpnI和HindIII)，然后连入克隆载体pGEM-T中，转化大肠杆菌感受态BL21，经蓝白斑筛选，挑取白斑摇菌，阳性菌液经测序后提取质粒及重组质粒(pGEM-T-rvfv-s)，测浓度为1.0X108拷贝/yL，制备成含裂谷热病毒S片段保守序列的标准质粒。以Dilution缓冲液(TaKaRa)将该质粒依次10倍倍比稀释至 1. 0X107、1. 0X106、1. 0X105、1. 0X104、1. 0X103、1. 0X102、1. OXlO1 拷贝 / μ L，制备成一系列梯度浓度的标准质粒。1.2荧光PCR反应体系及反应条件的建立以1. OX IO5拷贝/ μ L的重组质粒为模板，加入扩增反应所需的试剂组成表1所示的反应体系，反应同时设置阴性对照(以无菌水代替DNA模板进行)，反应体系见表1。
权利要求
1.用于检测裂谷热病毒S片段的引物和探针，其特征在于，上游引物 RVFVUl :5’ -GGATTACTTTCCTGTGATATCTGTTG-3，，下游引物 RVFVLl :5，-GTATCCTGGGAGGRCCATCWC-3，，其中 R 为 A 或 G，W 为 T 或 A。
2.用于检测裂谷热病毒S片段的探针，其特征在于，探针为5’-Fl-ACTCCACTGACACAAC ACGACGACCACT-Q1-3'，其中Fl为报告荧光基团，Ql为淬灭荧光基团。
3.检测裂谷热病毒的荧光RT-PCR法，其特征在于，以裂谷热病毒的RNA为模板，采用权利要求1所述的引物和权利要求2所述的探针进行荧光RT-PCR反应。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，25μL的反应体系含有成分如下10XPCR 缓冲液(Mg2+)2. 5μ L ;2. 5mM MgCL2 5. 0 μ L ；2. 5mM dNTP 2. 5 μ L ；反转录酶 AMV 2. 5U ； Rnase 抑制剂 20U ； IOyMRVFVUl 0. 5μ L ;10μΜ RVFVLl 0. 5 μ L, 10 μ M RVFVPl 0. 5 μ L, rTaq聚合酶2. 5U ；RNA模板1. 6 X 1(Γ6 1· 6 X KT1Iig,余量为双蒸水；反应程序为50°C反转录30min ；95°C预变性5min ；95°C变性10s，47°C退火20s，45个循环。
5.用于检测裂谷热病毒S片段的试剂盒，其包括权利要求1所述的引物和权利要求2 所述的探针。
全文摘要
本发明提供了一种用于检测裂谷热病毒S片段的引物和探针，其中上游引物5’-GGATTACTTTCCTGTGATATCTGTTG-3’，下游引物5’-GTATCCTGGGAGGRCCATCWC-3’(R为A或G，W为T或A)，探针5’-F1-ACTCCACTGACACAACACGACGACCACT-Q1-3′，F1为报告荧光基团，Q1为淬灭荧光基团。本发明还提供了裂谷热病毒S片段的实时荧光RT-PCR检测方法，该方法以裂谷热病毒假病毒颗粒为模板，用上述引物和探针进行实时荧光RT-PCR反应，根据反应结果判定是否为裂谷热病毒。本发明探针灵敏度高，特异性好，与非洲猪瘟、虹彩病毒、羊痘病毒均无交叉反应。
文档编号C12N15/11GK102433392SQ20111041560
公开日2012年5月2日 申请日期2011年12月13日 优先权日2011年12月13日
发明者吴绍强, 林祥梅, 王彩霞, 邓俊花 申请人:中国检验检疫科学研究院