专利名称：女性雌激素敏感性毒副作用易感基因无创检测试剂盒的利记博彩app
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种女性雌激素敏感性毒副作用的易感基因检测试剂盒，根据检测结果从基因层面评估女性雌激素代谢方面的风险级别，并作为更年期雌激素的用药指导。
背景技术：
更年期指女性卵巢功能从旺盛状态逐渐衰退到完全消失的一个过渡时期，包括绝经和绝经前后的一段时间。进入更年期是女性的一个特殊阶段，受到生物、心理和社会因素的影响，现代医学研究认为，卵巢功能衰退、性激素分泌减少、促性腺激素升高以及不适应机体内分泌的重新调整而引起植物神经功能紊乱是导致绝经期综合征发病的主要原因。科学研究发现，雌激素受体广泛分布在女性全身组织和器官的细胞膜上，当雌激素减少时，这些组织和器官就会发生退行形变或代谢上的变化，进而出现一系列神经、内分泌、代谢和心理的失衡，引起各系统改变的综合症候群。目前认为卵巢功能衰退而引起雌激素分泌减少是引起绝经期综合征的主要原因，并且发现雌激素降低的水平与绝经期综合征的严重度基本呈正相关。为了缓解女性更年期症状，雌激素替代疗法即由外界供给维持身体需要的雌激素水平被广为使用。但是临床研究发现，有相当一部分女性在使用雌激素后，却导致了子宫肌瘤、子宫内膜癌和乳腺癌等疾病。目前认为这部分女性对雌激素极为敏感，服用雌激素会造成乳腺细胞和子宫内壁上皮细胞快速分裂，癌细胞突变的机会增加，诱发了子宫肌瘤、子宫内膜癌和乳腺癌等。因此，建立简单、快速的女性雌激素敏感性毒副作用的检测方法，能够检测出女性在雌激素代谢及解毒能力相关的基因单核苷酸位点基因型，及时筛查出对雌激素敏感的女性高危人群，从而调整雌激素替代疗法用药方案，这对于降低女性乳腺癌、子宫肌瘤发病率有非常重要的意义。
发明内容
基于ER-α 基因 Pvu II (rs2234693)、XbaI (rs9340799), CYP17 基因 MspAl I (rs743572)的3个单核苷酸多态性位点基因型可用来评估女性雌激素生物学功能基础上，本发明提供一种女性雌激素敏感性毒副作用易感基因检测试剂盒。该试剂盒包括检测ER-α 基因 Pvu II (rs2234693)、XbaI (rs9340799)，CYP17 基因上 MspAlI (rs743572)的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物；PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)；PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。
本发明试剂盒的组分和含量包括PCR 反应体系10 X PCR 反应缓冲液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 0. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0. 125ul ；20uM特异性引物对(每条引物各0. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 产物纯化体系lU/ul SAP 酶 0. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 0. 375ul ； ddH203. 875uL·测序反应体系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 测序引物 Iul ；125mMEDTA 溶液 Iul ； 100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH202ul。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1.检测试剂盒的使用1、抽提DNA模板刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。2、PCR扩增反应使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对(I)ER-α (Pvu II)/ER-α (XkiI)正向引物5 ‘ TCTCCCACCTCAGCCTTACA3 ‘ER-α (Pvu II)/ER-α (XbaI)反向引物5 ‘ TCCATAGCCATACTTCCCTTG3‘(2)CYP17(MspAlI)正向引物5' CCCATACGAACCGAATAGA 3'CYP 17 (MspA II)反向引物5' AGTCAAGGTGAAGATCAGGGTAG3‘PCR扩增的反应体系为10 X PCR反应缓冲液2. 5μ 1 ； 25mM的dNTP混合液0. 2 μ 1、 5U/ul Taq酶0. 125 μ 1、DNA模板 1 μ 1 (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各 0. 25 μ 1、 ddH20 19. 175μ 1 ；反应条件为94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C 1分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。3、PCR扩增产物纯化使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物 20ul, lU/ul SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，去离子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min，72°C、20min。4、DNA测序反应使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物(I)ER-α (Pvu II)/ER-α (XbaI)测序引物5' CCCATACGAACCGAATAGA3‘(2) CYP17 (MspAlI)测序引物5' AGTCAAGGTGAAGATCAGGGTAG3 ‘
反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物Iul，25% Bigdye mixlul，3. 2uMDNA 测序引物lul，去离子水2ul。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98 °C 2min,进行25个循环的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室温下沉淀 15min ；在4°C，3600rpm/min的转速离心30min，轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul， 3600rpm/min离心15min，轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul，放入测
序仪中。5、基因型分析熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的 SNP位点的基因型。实施例2.对人们进行预防神经管缺陷基因无创检测的服务1.采样及抽提DNA由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提2.基因型检测使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的ER-α基因Pvu II (rs2234693)、XbaI (rs9340799)，CYP17 基因上 MspAlI (rs743572)的 3 个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这3个SNPs位点的基因型。3.雌激素敏感性毒副作用女性高危人群风险评估通过对受检者SNPs基因型的分析，出具雌激素敏感性毒副作用风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者 ER-α 基因 Pvu II (rs2234693) ,XbaI (rs9340799), CYP17 基因上MspAlI (rs743572)基因上SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。除此之外，根据受检者的风险级别，并由医师向受检者详细说明和解读雌激素敏感性毒副作用易感基因无创检测报告单。
权利要求
1.一种检测女性雌激素敏感性毒副作用的易感基因无创检测试剂盒，其特征在于检 IlJ ER- α 基因 Pvu II (rs2234693)、XbaI(rs9340799)，CYP17 基因上 MspAlI (rs743572)的 3 个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、 ddH20 等。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物对是指针对ER-α 基因 Pvu II (rs2234693)、XbaI (rs9340799)，CYP17 基因上 MspAlI (rs743572)的 3 个单核苷酸多态性位点，能特异性扩增出包含这3个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的DNA测序引物是针对ER-α基因 Pvu II (rs2234693)、XbaI (rs9340799)，CYP17 基因上 MspAlI (rs743572)的 3 个单核苷酸多态性位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出上述3个SNPs位点基因型的DNA 测序引物。
4.根据权利要求1所示的试剂盒，其特征在于，所含的2对特异性引物序列如下(1)ER-α(Pvu II)/ER-α (XbaI)正向引物5' TCTCCCACCTCAGCCTTACA3‘ER-α (Pvu II)/ER-α (XbaI)反向引物5 ‘ TCCATAGCCATACTTCCCTTG3‘(2)CYP17 (MspAlI)正向引物5' CCCATACGAACCGAATAGA 3'CYP 17 (MspA 11)反向引物5 ‘ AGTCAAGGTGAAGATCAGGGTAG3 ‘
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所含的2条DNA测序引物序列如下(1)ER-α(PvuII)/ER-α (XbaI)测序引物5' CCCATACGAACCGAATAGA3‘(2)CYP17 (MspAlI)测序引物5' AGTCAAGGTGAAGATCAGGGTAG3‘
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括(1)PCR反应体系10XPCR反应缓冲液2. 5ul，25mM dNTP 混合液0. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶0. 125ul，20uM特异性引物对，每条引物各0. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 产物纯化体系川/111SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，ddH20 3.875ul。(3)测序反应体系25%BigDyemixlul，3. 2uM DNA 测序引物 lul，125mMEDTA 溶液 lul， 100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ulo本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
全文摘要
本发明提供了一种检测女性雌激素敏感性的易感基因无创检测试剂盒。该试剂盒包括检测ER-α基因Pvu II(rs2234693)、XbaI(rs9340799)，CYP17基因上MspA1I(rs743572)的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、PCR反应组件、PCR产物纯化组件、DNA测序反应组件等。本发明的试剂盒通过检测与雌激素敏感性毒副作用密切相关的3个单核苷酸多态性位点的基因型来评估女性雌激素敏感性毒副作用的风险级别，并最终根据每一位受检者的基因检测结果从基因层面评估更年期雌激素药物代谢能力，指导更年期女性适量使用雌激素替代疗法缓解更年期症状。本发明采样方法是口腔黏膜细胞采样，无痛、无创、避免了交叉感染。测序检测结果准确，可靠，不必购置价格昂贵的进口专用仪器，方法易普及推广。
文档编号C12Q1/68GK102433380SQ201110379138
公开日2012年5月2日 申请日期2011年11月23日 优先权日2011年11月23日
发明者姜丽, 潘加奎 申请人:解码(上海)生物医药科技有限公司