专利名称：一种多重pcr快速检测致病性嗜水气单胞菌的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种快速检测致病性嗜水气单胞菌的分子生物学方法，本发明还涉及该方法在水产动物嗜水气单胞菌疾病诊断上的应用。
背景技术：
随着水产动物集约化养殖规模的不断扩大，其病害发生日益频繁，严重制约了水产养殖业的健康发展。水产动物疾病病原众多，用传统的微生物分离培养再做鉴定已经不能满足水产动物病害防治的需要。因此，建立快速、准确、灵敏的病原检测方法是及时控制和预防疾病发生的前提。传统的微生物学检测方法，费时费力，一般需要5-7d，另外免疫学方法如ELISA等则需要制备血清，并且其灵敏度相对较低，特异性差，难以推广。自从PCR 技术建立以来，其灵敏度高、特异性强、操作简便快速等优点，使得该技术在疾病诊断中得以广泛应用。单一 PCR尽扩增一个基因，不能准确确定某一病原菌的特性，多重PCR则增加了其准确性。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题提供一种多重PCR检测致病性嗜水气单胞菌的方法。本发明的另一个目的是将上述建立的方法在水产动物疾病诊断中的应用。本发明的目的是通过下列技术方案实现的 1、DNA模板的制备
①取具有嗜水气单胞菌感染自然发病的水产动物并在组织、心、肝、血液等，勻浆，取 1. 0ml, IOOOOg离心IOmin,沉淀用蒸馏水悬浮，再IOOOOg离心lOmin，将沉淀悬浮于Iml的蒸馏水中，沸水煮8-10min，IOOOOg离心IOmin,上清液即为DNA模板。②取健康相同水生动物的①中相同组织按上述方法制的的DNA模板为阴性模板。2、多重 PCR 三对引物分别为A :Aero, B: 16S rDNA, C: QS
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3、多重PCR反应体系为
IOXPCR buffer2. 5 μ L (已加 Mg2+，终浓度为 1. 5mmol/L)
dNTP mixture2 μ L (终浓度为 0. 25mmol/L)
引物上下游各2 μ L (终浓度0. 5 μ mol/L)
DNA模板1 μ L
Ex Taq1 μ LddH2014.51 μ L
总体积251 μ L
4、多重 PCR 反应条件 94°C 5min ；65°C Imin ；72°C 2min，30 个循环，72 延迟 lOmin。5、取10 μ L多重PCR反应产物，按常规DNA琼脂糖凝胶电泳方法检测，凝胶浓度为
0.8-1^%。在凝胶成像系统中照相，如出现图1的条带则致病菌为嗜水气单胞菌。为尽量避免多重PCR检测嗜水气单胞菌带来的假阳性，将3对引物同时在一个PCR 体系中进行扩增，构成多重PCR检测法。三对引物分别是根据嗜水气单胞菌的16Sr DNA保守序列基因、溶血素基因和群体感应信号分子基因设计的，对致病性嗜水气单胞菌有较强的特异性。与普通PCR检测方法相比，本发明采用多重PCR有更高的特异性和准确性；与免疫学方法ELISA检测方法相比，多重PCR省事省力，检测时间短、实验条件相对要求低。
图1是运用多重PCR检测致病性嗜水气单胞菌电泳结果图。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。实施例1
1、无菌操作取具有嗜水气单胞菌(A hydrophila)(具体操作和鉴定参照Chopra Α. K. , Houston C. W. , Peterson J. W. & Jin G. -F. (1993) Cloning, expression, and sequence analysis of a cytolytic enterotoxin gene from Aeromonas hydrophila. Canadian Journal of Microbiology 39，513 - 523.，菌种鉴定人为)感染典型临床症状的异育银鲫(fera^im auratus #力Wio)溃烂的肌肉组织10g，用勻浆器勻浆。取勻浆液Ig装入1. 5ml离心管中IOOOOg离心lOmin，弃上清，沉淀用蒸馏水重悬，再IOOOOg离心 ΙΟπ η,ΜΛ Iml蒸馏水重悬，盖上离心管，放入沸水中煮沸lOmin, IOOOOg离心IOmin,将上清转移至一新无菌离心管中，作为多重PCR的DNA模板。2、DNA模板的制备
①取具有嗜水气单胞菌感染自然发病的水产动物并在组织、心、肝、血液等，勻浆，取
1.0ml, IOOOOg离心IOmin,沉淀用蒸馏水悬浮，再IOOOOg离心lOmin，将沉淀悬浮于Iml的蒸馏水中，沸水煮8-10min，IOOOOg离心IOmin,上清液即为DNA模板。②取健康相同水生动物的①中相同组织按上述方法制的的DNA模板为阴性模板。3、多重 PCR 三对引物分别为A :Aero, B: 16S rDNA, C: QS
权利要求
1. 一种应用多重PCR快速检测致病性嗜水气单胞菌的方法，其特征按一下步骤 DNA模板的制备①取具有嗜水气单胞菌感染自然发病的水产动物病灶组织、心、肝、血液等，勻浆，取 1. 0ml, IOOOOg离心IOmin,沉淀用蒸馏水悬浮，再IOOOOg离心lOmin，将沉淀悬浮于Iml的蒸馏水中，沸水煮8-lOmin，IOOOOg离心lOmin，上清液即为DNA模板；②取健康相同水生动物的心、肝、血液等，勻浆，取1.0ml, IOOOOg离心lOmin，沉淀用蒸馏水悬浮，再IOOOOg离心lOmin，将沉淀悬浮于Iml的蒸馏水中，沸水煮8_10min，IOOOOg离心lOmin，上清液即为DNA阴性模板；多重 PCR 三对引物分别为A :Aerol、Aero2, B: 16S rDNAl、16S rDNAl、，C: QS1、QS2ifmtn/' Γ,Ail :-]5' CKAO^C^IBCOA CCOACT-! ·.' ^rCTCCAO CCICACC CCl 1 ■ Γm^MiMf: -Ci wVbI'O FT A Ti j "" C TtkA TA C· .1TA -.!- 5 Cb L-.Ι- 'Jj Gl ^AL AAALO - J :QSLr. ICA ^ato-tcp χλ gi g rr yI船Οβ25 a TGTCAA "GCA GG TC-I.多重PCR反应体系为IOXPCR buffer2. 5 μ L (已加 Mg2+，终浓度为 1. 5mmol/L)dNTP mixture2 μ L (终浓度为 0. 25mmol/L)引物上下游各2 μ L (终浓度0. 5 μ mol/L)DNA模板1 μ LEx Taq1 μ LddH2014.51 μ L总体积251 μ L多重 PCR 反应条件 94°C 5min ；65°C Imin ；72°C 2min，30 个循环，72 延迟 IOmin ； 取10 μ L多重PCR反应产物进行DNA琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度为0. 8-1. 1。
全文摘要
一种应用多重PCR快速检测致病性嗜水气单胞菌的方法。利用嗜水气单胞菌16rDNA基因保守区序列、外毒素基因以及群体感应信号基因序列设计三对引物，建立多重PCR的快速检测方法。该方法特异性高，操作方便，检测成本低，时间短，能同时检测大批量样品，可以标准化为产品，可以满足检验检疫部门大批量检测水产动物致病性嗜水气单胞菌的需要。
文档编号C12Q1/04GK102337349SQ20111035125
公开日2012年2月1日 申请日期2011年11月9日 优先权日2011年11月9日
发明者侯玉峰, 储卫华, 姜焱, 张常印, 朱卫, 王凯民, 陈雷 申请人:中华人民共和国江苏出入境检验检疫局, 中国药科大学