专利名称：一种绿色糖单孢菌α-淀粉酶的基因及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种α-淀粉酶的基因，特别是一种绿色糖单孢菌α-淀粉酶的基因及其应用。
背景技术：
淀粉酶是可作用于可溶性淀粉、支链淀粉、糖元和α-1，4-葡聚糖等多糖，水解 α-1，4-糖苷键的一类酶。一般来说根据淀粉酶的作用方式可分简单为α-淀粉酶、淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶，其中α-淀粉酶广泛应用于食品、轻化工业、酿造、制药、 谷物加工、石油开采等领域。根据来源的不同α-淀粉酶又可分为真菌α-淀粉酶和细菌 α_淀粉酶，真菌α-淀粉酶是由曲霉属微生物发酵产生的一种α-淀粉酶。与细菌α-淀粉酶不同的是，真菌α-淀粉酶的最适作用温度为55°C左右，超过60°C开始失活，其水解淀粉的产物主要是高含量的麦芽糖和一些低聚糖及少量的葡萄糖。而细菌α-淀粉酶最适作用温度高(中温α-淀粉酶70 80°C，耐高温α-淀粉酶为95 105°C )，水解淀粉的主要产物是糊精。因此，细菌α-淀粉酶只能用于发酵工业，而真菌α-淀粉酶则广泛地应用于淀粉糖浆、低聚糖、啤酒、烘焙食品、面制品等的生产，具有十分广阔的市场前景。真菌 α-淀粉酶从20世纪50年代开始相继在英国和美国作为食品添加剂应用于面包生产行业， 在现代的淀粉糖浆、焙烤制品、啤酒酿制、生料酒精等行业已得到广泛的应用。随着现代制糖工业与发酵工业的发展及其对真菌α-淀粉酶的使用需求，使得真菌α-淀粉酶在现代工业酶制剂中占有显著地位，在淀粉糖行业真菌α-淀粉已逐渐替代β-淀粉酶而成为以淀粉为原料生产麦芽糖浆的关键酶。随着真菌α-淀粉酶需求量的日益增加及其相对较昂贵的价格，使得近年来越来越多的国内研究者开始关注真菌α-淀粉酶研究与开发工作。真菌α-淀粉可以水解淀粉内部的α-1，4-糖苷键，终产物中主要物质为麦芽糖和低聚寡糖及少量葡萄糖的糖浆。真菌α-淀粉酶的一个重要的用途就是用于生产高麦芽糖浆，目前，欧美各国大多采用真菌α-淀粉酶作为糖化剂生产高麦芽糖浆，得到的麦芽糖浆其组成中麦芽糖占40% 60%，麦芽三糖约10% 20%，其它为葡萄糖、低聚糖和糊精等。在工业生产中真菌α-淀粉可以与β-淀粉酶和普鲁兰酶等脱枝酶配合使用，用于生产超高麦芽糖浆，其麦芽糖含量超过70%，甚至更高。关于用于生产麦芽糖的α -淀粉酶的相关专利和研究报道，美国两项专利U. S Patent4604355 和 U. S Patent 6274355 是关于麦芽糖淀粉酶(maltogenic amylase enzyme)的制备方法和使用的专利，这种酶已经由诺维信公司商品化，这种酶转化淀粉的直接产物不是麦芽糖而是麦芽三糖以上的高麦芽糖寡糖，比真菌α -淀粉酶容易控制而且生成的葡萄糖少，所以可以进一步结合用其它脱支酶的共同作用就可以将淀粉转化成高麦芽糖糖浆。Petricek M也报道了从Thermomonospora curvata克隆到的一个新的芽糖α-淀粉酶基因，可以水解淀粉生成50%以上的麦芽糖和少量的葡萄糖(Petricek M， Tichy P，KuncovaM. Characterization of thealpha-amylase-encoding gene from Thermomonospora curvata. Gene. 1992，112(1) :77_83) ；YangCH 也才艮道了从 Thermobifida
3fusca克隆到一个新的芽糖α-淀粉酶基因，可以水解淀粉生成50%以上的麦芽糖和少量的葡萄糖，其同源性和前面Petricek M报道的有98 %的同源性(Yang CH, Liu WH. Cloning and characterization of a maltotriose-producing alpha-amylase gene from Thermobifida fusca. J Ind Microbiol Biotechnol. Epub,2007,34(4) 325-330)； 2002年Ammar YB报道从Str印tomyces sp菌属分离纯化到一种新型的麦芽糖α -淀粉酶(Maltose-forming α -Amylase)，这种酶在转化淀粉时在4小时内就可以将淀粉转化成 58%的麦芽糖，27. 5%的麦芽三糖，14. 5%的麦芽四糖和五糖，而且不会产生葡萄糖(Ammar Y B, Matsubara T, Ito K, Iizuka M, Limpaseni T, Pongsawasdi P, Minamiura N. New action pattern of a maltose-forming alpha-amylase from Streptomyces sp. and its possible application in bakery. J Biochem Mol Biol. 2002,35(6) :568_575)，它的水解淀粉的特性似乎是一种很有应用前景的麦芽糖α “淀粉酶，可惜其没有相关基因克隆的报道。国内关于麦芽糖α-淀粉酶基因的报道只有訾楠等报道从地衣芽孢杆菌克隆到生麦芽糖α-淀粉酶的基因，其水解淀粉的产物主要是麦芽糖和葡萄糖(訾楠，沈微，石贵阳，王正祥.地衣芽孢杆菌生麦芽糖α-淀粉酶的基因克隆与鉴定.应用与环境生物学报.2009， 15(1) :130 133)。本人也从嗜热链霉菌(Streptomyces thermoviolaceus)菌属中克隆到一个麦芽糖α-淀粉酶基因，可以水解淀粉生成麦芽糖的含量达到50%的糖浆(中国专利申请号201010045645. 9)。
发明内容
本发明的目的是提供一种绿色糖单孢菌α -淀粉酶的基因及其应用，可以水解淀粉生成麦芽糖浆。本发明人研究分析GenBank上绿色糖单孢菌基因组DNA序列中的一个假定为糖苷酶的0RF(GI =256583961)的DNA序列，并进行了信号肽预测，并将该ORF序列导入大肠杆菌进行表达和功能鉴定。实验表明该ORF编码一种α-淀粉酶，它与可溶性淀粉、六糖、五糖、 四糖、三糖反应，经HPLC检测产物均为麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖的混合物，不能与二糖、 α-环糊精和β-环糊精反应，说明该ORF编码的是一种水解性的α-淀粉酶，水解淀粉得到主要产物是麦芽糖和麦芽三糖以及少量葡萄糖的糖浆。本发明所述的α -淀粉酶基因克隆自绿色糖单孢菌(Saccharomonospora viridis)这些菌种可以从国内外的微生物中心购买，也可以通过野外分离培养以及其他途
径来获得。从绿色糖单孢菌(Saccharomonospora viridis)分离得到的α -淀粉酶具有以下特征1.分子量约为50kD2.酶的适合反应温度为55 65°C，优选60°C3.酶的反应的pH在5. 5 7. 5，优选pH为6. 5 7. O ；4.酶活力的热稳定性受外加Ca2+的影响很小，不需要外加Ca2+来激活酶的活力。5.酶对淀粉的水解的主要产物是麦芽糖、麦芽三糖和葡萄糖。本发明所克隆到的α -淀粉酶基因在Genbank中注释为糖苷酶(glycosidase)基因，但目前还没有相关的实验验证和具体功能的报道，而其编码的α -淀粉酶的DNA序列与已发表的淀粉酶家族蛋白的DNA序列同源性为都很低，同源性仅为14%，但其氨基酸序列和糖苷酶家族有很大的同源性，同源性达到90%以上。糖苷酶是作用各种糖苷或寡糖使糖苷键水解的酶之总称，种类繁多，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、异淀粉酶和糖苷转移酶的糖苷键水解相关的酶，所以对某一糖苷酶必须要进行相关的功能鉴定才能确定是具体属于那种酶。α -淀粉酶是属于种类繁多的水解酶，在生物体中的生理生化活动扮演着十分重要的角色，因而分布十分广泛，遍及微生物至高等植物。不同来源的α-淀粉酶即使存在一定的同源性，但其分子量大小不同，最适反应温度，最适反应PH以及水解淀粉所得到产物组成等酶学特性上都会有很大差异，因而在用途上也有所不同。本发明通过基因克隆，外源基因表达，表达产物的酶学研究等多种复杂的实验步骤，证实这一基因编码是的α-淀粉酶，该淀粉酶是与前人发现的淀粉酶具有完全不同特征，这些不同的特性特征包括了氨基酸序列和DNA序列的不同，酶的分子量大小不同，酶的最适反应温度和最适反应PH不同，以及酶对淀粉水解产物组成差异等特性的差异。本发明与现有技术相比，具有实质性特点和显著的优势1.和大多数的细菌α-淀粉酶属于液化型的淀粉酶相比，本发明的α-淀粉酶属于糖化型的淀粉酶，水解淀粉的产物简单，主要产物麦芽糖和麦芽三糖及少量的葡萄糖，酶活力的热稳定性受Ca2+的影响很小，在水解淀粉反应中不需要添加Ca2+来激活酶的活力，在水解淀粉制备麦芽糖浆上具有一定优势。2.和真菌α -淀粉酶相比，真菌α _淀粉水解淀粉的产物主要是麦芽糖和一些低聚糖及少量的葡萄糖，真菌α -淀粉酶的最适作用温度为55°C左右，超过60°C开始失活，最适反应pH为4. 8 5. 4，真菌α -淀粉酶水解淀粉产物只能得到50%左右的麦芽糖，而本发明的α -淀粉酶具有更高适于反应温度55 65°C，因而更适于工业化水解淀粉对酶耐较高反应温度的要求，最适反应pH在5. 5 7. 5，更接近中性反应条件，在生产中不需要添加酸来调节PH值，本发明的α -淀粉酶水解产物也更简单，主要产物麦芽糖和麦芽三糖及少量的葡萄糖，没有低聚糖，水解淀粉产物中麦芽糖能达到60%左右，在水解淀粉制备麦芽糖浆上具有一定优势。3.目前商品花真菌α-淀粉酶大多数采用曲霉属微生物发酵生产，本发明的 α-淀粉酶不仅具有适合制备麦芽糖浆的性质，而且是来源细菌的基因，因而比来自真菌的基因更容易实现利用基因工程菌来生产重组，有利于降低生产成本。
图1是温度对酶水解淀粉活力的影响的曲线图。图2是pH对酶水解淀粉活力的影响的曲线图。图3是外加Ca2+离子对酶稳定性的影响的曲线图。图4酶水解淀粉产物HPLC分析色谱图。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明。实施例1.绿色糖单孢菌的培养及总DNA的提取
绿色糖单孢菌(Saccharomonospora viridis 4. 1335)购买自中国微生物菌种保存中心，接种于以下培养基(克/升)葡萄糖4. O克，酵母提取物4. O克，麦芽提取物10. O 克，pH7. 2，然后在50°C恒温摇床上振荡48小时，培养至菌体饱和后离心收集菌体用于总 DNA的提取，总DNA提取采用CTAB法提取。2.绿色糖单孢菌α-淀粉酶基因的表达及重组酶的制备根据α _淀粉酶基因成熟肽的DNA序列设计相应引物扩增其成熟肽序列并连接到表达载体上导入大肠杆菌进行表达，设计引物如下上游引物5-ATACATATGATGGCACCACCCGGCGAAC-3下游引物5-ATCGAATTCTCATACGCGAGCGCCGACG-3用设计好的引物扩增α-淀粉酶成熟肽的DNA序列，命名为sv，扩增产物利用 Ncol和HindIII进行双酶切，然后与同样利用Ncol和HindIII进行双酶切的表达载体 pSEe380进行连接，然后经过筛选验证得到重组质粒pSE380-sv。把重组载体重组质粒 pSE380-sv转化到大肠杆菌感受态细胞中，将转化子在37°C摇床中培养，当0D600达到0. 8 左右时，加入IPTG使其终浓度达到lmmol/L在37°C继续培养20小时进行诱导表达。诱导表达培养好的发酵液离心收集菌体，利用破胞缓冲液洗涤菌体一次，再利用破胞缓冲液重悬菌体后在冰浴条件下利用超声波进行破胞，破胞至菌液澄清，用1200rpm/min离心15分钟离心收集上清，所收集的上清液即为重组的粗酶液，可用于下一步的水解淀粉产物试验。3.酶水解淀粉最适的反应温度分析取50 μ L的酶液与450 μ L ρΗ为7. O的1 %可溶性淀粉溶液混合，分别在30°C、 35°C、340°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70V下反应IOmin后测定淀粉酶活力，结果表明酶的最适温度为60°C，在50°C到65°C之间该酶有80%以上的活性，65°C以后酶活性急剧下降，结果如图1所示。4.酶水解淀粉最适的反应ρΗ分析分别用ρΗ4· 5、ρΗ5· 0、ρΗ5· 5、ρΗ6· 0、ρΗ6· 5、ρΗ7· 0、ρΗ7· 5、ρΗ8· 0、ρΗ8· 5、ρΗ9· O 的
缓冲液配制ι %的可溶性淀粉溶液，然后分别450 μ L加入50 μ L的酶液，在65°C的条件下反应IOmin后测定淀粉酶活力，结果表明酶的最适反应ρΗ为pH6. 5，在pH5. 5到pH8. O之间该酶有80%以上的活性，pH8以后酶活性急剧下降，结果如图2所示。5.外加Ca2+离子对酶稳定性的分析用CaC12溶液把酶稀释成Ca2+终浓度分别为0、0. 5、l、2、3、4、5、6mmol/L的酶液， 于60°C恒温水浴中保温30分钟，然后取50 μ L酶液与ρΗ为6. 5的1 %可溶性淀粉450 μ L 反应10分钟后测定酶活，结果如图3所示，结果表明酶的热稳定性受外加的Ca2+的影响很小。6.酶水解淀粉产物成分的分析取50 μ L的酶液与450 μ L ρΗ为6. 5的1 %可溶性淀粉溶液混合，在60°C的反应条件反应12小时，然后通过HPLC分析酶产物的组成。检测条件为色谱柱Alltima Amino 100A 5u柱(4.6_X250mm)；检测器Alltech 2000ES型蒸发光散射检测器；流动相65% 乙腈35% H20 ；流速lmL/min，柱温28°C。酶与可溶性淀粉反应产物经HPLC检测，结果如图4所示，结果表明酶水解的产物主要为麦芽糖和麦芽三糖还有少量的葡萄糖，产物组成为6. 17%的葡萄糖、60. 97%的麦芽糖和32. 86%的麦芽三糖。
7.以淀粉制备麦芽糖糖浆在100升的不锈钢容器加入市售木薯淀粉25公斤，加入0. lmol/L,pH为7. 0磷酸氢二钠和磷酸二氢90升，混勻后在90°C保温10分钟使淀粉。糊化完成后使淀粉溶液温度降至60°C，加入制备好的酶液10升，在60°C条件下保温12小时进行水解，然后用HPLC对水解产物进行各种糖含量的分析，结果如表1 :表1 反应12小时后水解产物中各组分的含量(％ )
商品的木薯淀粉中组成为淀粉85%，水分14%，蛋白质和其它成分1%。按此计算商品的木薯淀粉25公斤含可降解的淀粉为21. 25公斤，水解后得到的糖浆中的麦芽糖重量约为12. 73kg，糖浆中的麦芽糖含量为59. 91%。
权利要求
1.一种绿色糖单孢菌α-淀粉酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ IDN0. 1 所示。
2.根据权利要求1的基因所编码的α-淀粉酶蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如 SEQIDN0. 2 所示。
3.—种表达载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的基因。
4.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求1所述基因的原核细胞或真核细胞。
5.权利要求2所述的基因所编码的α-淀粉酶蛋白质在水解淀粉中的应用，其特征在于水解淀粉得到的产物是主要由麦芽糖和麦芽三糖以及少量葡萄糖组成的糖浆，其中麦芽糖含量可以达到60%。
全文摘要
一种绿色糖单孢菌α-淀粉酶的基因及其应用，该基因克隆自绿色糖单孢菌(Saccharomonospora viridis)，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，该基因编码的α-淀粉酶的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。该基因可以用于构建表达载体并导入相应的宿主细胞进行表达获得重组的α-淀粉酶，该酶在水解淀粉中的应用能单独水解淀粉得到麦芽糖含量在60％的糖浆，这种麦芽糖浆可以直接应用在食品工业，也可以进一步加工成高纯度的麦芽糖。
文档编号C12P19/14GK102382849SQ201110340320
公开日2012年3月21日 申请日期2011年11月1日 优先权日2011年11月1日
发明者杜丽琴, 汪小波, 韦宇拓, 黄日波 申请人:广西大学