专利名称：利用微藻处理沼液耦合生产生物柴油的方法
技术领域：
本发明涉及环境保护领域及可再生能源领域，具体涉及一种利用微藻处理沼液耦合生产生物柴油的方法。
背景技术：
资源、能源和环境是当前人类社会发展面临和必须解决的三大难题，我国是世界上经济发展最为迅速的国家之一，对能源的需求量长期持续高速增长，石油供给远不能满足经济发展的需要。2009年，我国累计进口原油2. 04亿吨，对国际依存度首次超过50%。 国际石油价格的波动，不仅增加了购买石油的外汇消耗，而且给我国的可持续发展带来潜在威胁。发展替代能源是保障我国能源安全的重大战略举措。微藻是生产生物柴油的优质原料，微藻的含油量在5% 20%，部分微藻的含油量可高达40-60%，甚至80%。微藻的产油率是油料作物如大豆的30-100倍，为生产替代性燃料油奠定了基础。藻类是自养型生物，以光能作为能源，利用氮、磷等营养物质合成复杂的有机质。因此，藻类可降低污水中的氮、磷含量。对沼液中氮、磷的去处起到了较好的效果。另外制约微藻生物柴油发展的瓶颈性因素为成本太高，利用沼液养藻为节约成本起到了一定的作用。沼液是畜禽粪便及其他有机废弃物经厌氧发酵后的残留液，含有大量的氮、磷及重金属，被视为高浓度污水，直接排放会导致水体富营养化，污染水源，《农业生物质能产业发展规划O007-2015年)》中提出，到2015年，全国农村户用沼气总数将达到6000万户左右，年生产沼气233亿立方米左右，建成规模化养殖场，养殖小区沼气工程8000处，年产沼气6. 7亿立方米。约每天排放沼液量7. 5万吨，尽管少量的沼液可作为有机肥，但随着我国沼气工程的蓬勃发展，大量的沼液处理也就成了一个问题，因此，随着我国沼气工程的蓬勃发展，大量的沼液需要进行资源化利用。微藻自身含油量高，可以用各种水体养殖，具有不占用耕地等优势，但利用微藻生产生物柴油的方法存在很多问题，成本太高阻碍了该项技术的产业化。本发明利用沼液培养微藻，不仅解决了沼液直接排放的环境方面问题，还实现了沼液的资源化利用，降低了微藻生产生物柴油的成本，对能源和环境两方面均产生了积极的影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用微藻处理沼液耦合生产生物柴油的方法，该方法不但降低了微藻生物柴油生产成本，而且为环境中大量沼液处理提供了好的方法。为了实现本发明目的，本发明的一种利用微藻处理沼液耦合生产生物柴油的方法，其包括如下步骤(1)微藻种子液的制备利用微生物分离纯化法分离微藻，得到纯化微藻；(2)沼液的预处理
3CN 102433362 A
说明书
2/4页 将沼液过滤、离心，取上清液；(3)将处理后沼液转移入内循环式光反应器中，接种种子液，培养，定期测定微藻生长量和营养物质变化(微藻生长量用分光光度计OD54tl表示，OD54tl与微藻浓度成正比关系)，评价实验效果；所述营养物质用沼液中TN、TP(均用国标的方法)等变化来衡量。(4)收集微藻，并提取微藻中的油脂，得生物柴油。其中，所述微藻优选为小球藻，其从养殖厂排除污水中分离。其中，所述沼液为各种生物质经过沼气池厌氧发酵的产物。其中，所述步骤⑴还包括对纯化的微藻用液体BGll培养基扩大培养，直至培养至对数期。其中，步骤(1)中所述微生物分离纯化法优选平板划线法，所用培养基优选为 BGll 培养基，该培养基包括下述成分=NaNO3L 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 075g/L, NaCO3O. 02g/ L, K2HPO4 · 3Η200· 04g/L, CaCl2 · 2H20 0. 036g/L,柠檬酸(citic acid)0. 006g/L,柠檬酸铁铵(Ferric ammonium citrate) 0. 006g/L, EDTA-Na 0. OOlg/L, A5+co solution lml/L, 其中 A5+co solution 成分为 H3B032. 86g/L, MnCl2 · H2O 1. 81g/L, ZnSO4 · 7H20 0. 222g/L, CuSO4 · 5H20 0. 079g/L, NaMoO4 · 2H20 0. 390g/L, Co(NO3)2 · 6H20 0. 049g/L。其中，步骤⑵中所述过滤优选8-10层纱布过滤；所述离心条件优选转数 8000-10000rpm、温度4°C，离心时间10-15分钟；离心后的沼液上清液需稀释2_15倍，优选 10-15倍，更优选15倍。其中，步骤(3)所述种子液为对数期种子液，接种量按稀释后沼液总体积的 2% -5%接种量接种，使接种后OD54tl在0. 100附近。其中，步骤(3)所述培养条件为室温，一般M_27°C，自然光照，通气培养。其中，步骤中收集微藻的时间为OD值基本不再变化时；收集微藻的方法为离心法，离心条件优选4°C，IOOOOrpm离心10分钟，弃上清。所述步骤(4)收集微藻后、抽提之前，微藻还经过烘箱干燥和研钵研磨；所用烘箱温度为80°C，烘5-7个小时(至微藻恒重)；研磨至微藻成粉末状。本发明的积极效果是本发明利用沼液培养微藻，不仅解决了沼液直接排放的环境方面问题，还实现了沼液的资源化利用，降低了微藻生产生物柴油的成本，实现了可再生能源及环境治理双益，也为微藻产业化提供了基础。
图1是本发明提供的利用微藻处理沼液耦合生产生物柴油的方法一个实例中从污水中按提供方法分离纯化的微藻藻种。图2是本发明提供的利用微藻处理沼液耦合生产生物柴油的方法一个实施例中藻种种子液制备的结果。图3是本发明提供的利用微藻处理沼液耦合生产生物柴油的方法一个实施例中用提供沼液养殖微藻的生长曲线变化图。图4是本发明提供的利用微藻处理沼液耦合生产生物柴油的方法一个实施例中用沼液养殖微藻的总氮变化曲线图。
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图5是本发明提供的利用微藻处理沼液耦合生产生物柴油的方法一个实施例中用沼液养殖微藻的总磷变化曲线图。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明的具体实施方式
作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1沼液离心和稀释倍数的优化取过滤后的沼液，设置离心机的离心梯度6000rpm，8000rpm，IOOOOrpm, 12000rpm 接种相同量藻种，在同一条件下培养，十天后0D540分别为0. 560,0. 590,0. 608,0. 534。从而得出8000-10000rpm得出效果最好。根据初始沼液的氮、磷含量，参照BGll培养基的氮、磷含量，确定稀释倍数大致在 5-20倍附近。固取分别稀释度为2、5、10、15、20几个稀释度，接种藻种起始OD54tl —致，在相同条件下培养，十天后，得到OD值为0. 200,0. 372,0. 510,0. 642,0. 563。从而得出10-15倍稀释对微藻生长最有利。综上所述，选择转速8000-10000rpm离心，选择10_15倍为稀释倍数，对微藻生长是最优的。实施例2利用微藻处理沼液耦合生产生物柴油的方法1、藻种分离纯化及种子液制备配制BGll 培养基NaNO3L 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 075g/L，NaCO3O. 02g/L， K2HPO4· 3H20 0.04g/L, CaCl2 · 2H20 0.036g/L, citic acidO. 006g/L, Ferric ammonium citrate 0.006g/L, EDTA-Na 0.OOlg/L, A5+cosolution lml/L, ^ 中 A5+co solution
分为 Η3Β032· 86g/L, MnCl2 · H2Ol. 81g/L, ZnSO4 · 7H20 0. 222g/L, CuSO4 · 5H20 0. 079g/L, NaMoO4 · 2H20 0. 390g/L, Co(NO3)2 · 6H20 0. 049g/L。用平板划线的方法分离纯化污水中的小球藻，直至出现单藻株，用牙签挑单藻株接种三角瓶培养，如图1，图2。2、取北京X沼气厂沼液2升，先用8层纱布过滤，滤液用离心机10000rpm，4°C， lOmin，收集上清液，取处理后的上清液1L，用去离子水稀释至15L，将稀释15倍的沼液转入光合反应器中，将上一步中生长至对数期的纯种微藻种子液OD54tl值大约是2. 0-5. 0，按 2%-5% (起始OD54tl在0. 1附近)的接种量接种，通气培养，自然光照，室温对_271。3、隔天检测OD54tl,总氮，总磷变化情况，实验结果如图3、图4和图5。如图3所示 OD在十天左右基本不再变化，说明到达稳定期，图4所示为沼液中总氮的变化情况，起始稀释15倍沼液的总氮含量为53. 3;3mg/L，起始四天氮含量急剧下降，到第八天接近lmg/L，到第十天时总氮去除率达到99. 5%，总氮去除效果较为理想。图5为沼液中总磷的变化情况， 起始稀释15倍沼液的总磷含量为5. 92mg/L，变化趋势与总氮较为相似，起始前四天浓度急剧下降，到第八天时为0. 25mg/L,到第十天时总磷去除率接近99. 8%，总磷去除效果相当
王困相4、离心收集微藻，烘干测干重，微藻干重达到0. 5354g/L, 一般自养微藻干重为 0. 2-0. 5g/L左右。说明用稀释沼液养殖微藻效果较为良好，含量不低于相同条件下专门配
置的微藻培养培养基。
5、用氯仿甲醇法(Bligh and Dyer, 1959)提取微藻中的油脂将冷冻干燥后的微藻干粉，按Ig藻粉3g石英砂的比例混合，置于研钵中充分研磨后加入氯仿甲醇的混合溶剂(氯仿甲醇水=1 2 0.8)，提取油脂。将混合体系于涡旋振荡器上振荡5min， 静置15min后离心，6000rpm，2min,收集上层提取液，下层沉淀重复上述操作，共提取3次。 合并所有的提取液，加入氯仿和水，使氯仿、甲醇和水的最终体积比为1 1 0.9。将混合溶液摇勻后静置分层，收集下层氯仿层，在旋转蒸发仪中60°C蒸去溶剂氯仿，即得到油脂。测得含油量为14 %，一般自养微藻含油量为5 % -20 %。沼液培养微藻油脂含量在一般范围内，说明沼液养藻的可行性。相同条件下，用小球藻Chlorella vulgaris (1068，购自武汉水生所)与污水分离出微藻作对照培养，Chlorella vulgaris处理沼液氮、磷去除率分别为72. 7%和77. 24%, 生物量干重达到0. 4(^9g/L，油脂含量达到10. 33%，而污水处理沼液氮、磷去除率分别达到99. 5%和99. 8 %，生物量干重达到0. 53Mg/L，油脂含量达14%，通过比较可知，污水分离微藻相对其他来源微藻在沼液处理方面优势较明显。本实验充分说明了沼液在养殖微藻方面的效果良好，氮、磷去除效果较理想，微藻生长状况良好，获得了微藻生物柴油制备的可能性，并且降低了微藻养殖成本。因此本发明提供的方法是一种耦合生物柴油制备及沼液处理的好方法，一方面降低了微藻养殖成本， 另一方面对环境治理有较好的效果，实现了可再生能源及环境治理双益，有较好的使用前景。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种利用微藻处理沼液耦合生产生物柴油的方法，其包括如下步骤(1)微藻种子液的制备利用微生物分离纯化法分离微藻，得到纯化微藻；(2)沼液的预处理将沼液过滤、离心，取上清液；(3)将处理后沼液转移入内循环式光反应器中，接种种子液，培养，定期测定微藻生长量和营养物质变化，评价实验效果；(4)收集微藻，并提取微藻中的油脂，得生物柴油。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微藻为小球藻。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)还包括对纯化微藻进行扩大培养。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述扩大培养所用的培养基为液体BGll 培养基，该培养基包括下述成分=NaNO3L 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 075g/L, NaCO3O. 02g/L, K2HPO4 · 3H20 0. 04g/L, CaCl2 · 2H20 0. 036g/L,柠檬酸 0. 006g/L,柠檬酸铁铵 0. 006g/L, EDTA-Na 0. OOlg/L, A5+co solution lml/L。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述离心条件为转数 8000-10000rpm、温度4°C，离心时间10-15分钟。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述离心后的沼液上清液需稀释 10-15 倍。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述种子液为对数期种子液，接种量按稀释后沼液总体积的2% -5%接种量接种。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述培养条件为室温，自然光照，通气培养。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤中收集微藻的时间为OD值基本不再变化时，收集微藻的方法为离心法。
10.如权利要求1-9任意一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)收集微藻后、抽提之前，微藻还经过烘箱干燥和研钵研磨。
全文摘要
本发明提供了一种利用微藻处理沼液耦合生产生物柴油的方法，它包括(1)微藻种子液的制备，利用微生物分离纯化法分离微藻，得到纯化微藻；(2)沼液的预处理，将沼液过滤、离心，取上清液；(3)将处理后沼液转移入内循环式光反应器中，接种种子液，培养，定期测定微藻生长量和营养物质变化，评价实验效果；(4)收集微藻，并提取微藻中的油脂，得生物柴油。本发明利用沼液培养微藻，不仅解决了沼液直接排放的环境方面问题，还实现了沼液的资源化利用，降低了微藻生产生物柴油的成本，实现了可再生能源及环境治理双益，也为微藻产业化提供了基础。
文档编号C12P7/64GK102433362SQ20111034026
公开日2012年5月2日 申请日期2011年11月1日 优先权日2011年11月1日
发明者李朋飞, 贺国强, 邓志平, 陈三凤 申请人:中国农业大学