专利名称：一种不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌ClpP蛋白酶基因缺失株、其构建方法及应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌ClpP蛋白酶基因缺失株、 其构建方法及应用，属于细菌基因工程技术领域。
背景技术：
猪传染性胸膜肺炎(porcinecontagious pleuropneumonia, PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)引起的一种高度传染性、致死性的呼吸系统传染病。目前该病已在世界各国广泛流行，造成巨大的经济损失，成为国际公认的危害现代化养猪业的重要传染病之一。随着我国现代养殖业规模化、集约化的发展，本病的发生呈爆发趋势，有的猪场的阳性率已达到70%以上，严重阻碍了我国养猪业的健康发展。根据APP表面荚膜(CPS)和脂多糖(LPS)抗原性的不同，可将APP分为15个血清型，血清1型又分为Ia和Ib两个亚型，血清5型又分为fe和釙两个亚型。目前在我国已发现并分离到血清型1、2、3、4、5、7、8和15等多种血清型，主要流行的血清型为1、3、5和7 型。生物被膜(Biofilm)是在生物体内和非生物体表面集聚生长的由细菌及其产生的多糖蛋白复合物所形成的固定细菌群落，它是病原菌持续感染、产生耐药性和免疫逃逸的重要原因之一。APP长期潜伏于猪体内常常引起持续性感染，近年来获得的许多临床分离株具有多重耐药性，并且较普遍地能形成生物被膜，被认为在APP致病过程中发挥重要作用。生物被膜的产生是一个高度复杂的、由多种基因调控的动态过程，这些基因涉及到细菌的黏附、新陈代谢、群体感应(quorum sensing)和应激反应(stress response)等。 近年来对病原菌应激反应与感染性疾病的研究发现，ClpP蛋白酶这一应激蛋白是一种十分重要的毒力因子，它是ATP依赖的丝氨酸蛋白酶，调节着细菌对环境各种压力的适应(如热休克、营养缺限、氧化应激等)，维持细菌的形态和毒力，使其在各种环境下得到保护。研究发现该基因的插入突变或缺失通常会降低细菌对不良因素的承受能力，菌体生长被破坏， 存活力下降，并影响生物被膜形成，造成毒力减弱。目前虽然仅探索了少数病原菌ClpP蛋白酶的功能，但在揭示致病机理和疫苗研究中已经显示出极为重要的研究价值和疫苗应用前景。鉴于上述背景，构建在我国流行的APP血清7型ClpP蛋白酶基因缺失株，研究其遗传特性、生长特性、毒力、对动物的致病性和免疫原性等生物学特性，为猪传染性胸膜肺炎的防治、其它呼吸道传染病的药物研究以及疫苗研究奠定重要的基础。
发明内容
本发明的目的在于获得一种不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型ClpP 基因缺失株。
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本发明提供的一种不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型ClpP基因缺失株，是将猪胸膜肺炎放线杆菌的ClpP蛋白酶的编码基因灭活后得到的缺失株。本发明的目的之二在于提供一种制备所述不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型clpP基因缺失株的方法，其特征在于疫苗株是通过将DNA片段Δ clpP导入所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型菌株经同源重组实现的；所述DNA片段Δ clpP从上游至下游依次为同源臂ClpPS和同源臂ClpPX 所述同源臂ClpPS和同源臂ClpPX能与所述猪胸膜肺炎放线杆菌中的ClpP蛋白酶编码基因的上游序列和下游序列发生同源重组、灭活所述 ClpP蛋白酶的编码基因。在本发明的一个具体实施例中，所述ClpP蛋白酶的编码基因如SEQ ID NO. 1所
7J\ ο在本发明的一个具体实施例中，扩增上同源臂ClpPS的引物序列如下所示ClpSF 5' -CG GAATTC (EcoR I) GGGGCGTTACTGGATGC-3，CIpSR :5，-CCATCGCTTC CGCCTTTGGA GGTTTGC-3，扩增下同源臂ClpPX的引物序列如下所示cIpXF :5，-TCCAAAGGCG GAAGCGATGG AATACGGTC-3，ClpXR 5' -CG GGATCC (BamH I) TTCTCTGCTTTAAGTGTCGGC-3，。本发明的目的之三在于提供所述的一种不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型clpP基因缺失株在制备猪传染性胸膜肺炎疫苗中的应用。本发明的目的之四在于提供一种猪传染性胸膜肺炎疫苗，其活性成分为本发明所述的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型clpP基因缺失株。本发明是通过以下技术方案来实现的本发明的不含抗性标记猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型clpP基因缺失突变菌株，衍生于中国兽药监察所购买的猪胸膜肺炎放线杆菌CVCC265株，将其基因组上的clpP基因缺失了 491bp，灭活clpP基因，使ClpP蛋白酶不表达。本发明的一种不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型clpP基因缺失株，分类命名为胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为=CGMCC No. 5258，保藏日期为2011年9月17日；在本发明的具体实施例中，本发明的一种不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型clpP基因缺失株，其基本构建方法是首先以猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型(简称 APP-7，下同)CVCC265株为起始材料，以PCR的方法从CVCa65的基因组中扩增出clpP基因的上同源臂ClpPS和下同源臂ClpPX，采用重叠延伸PCR方法拼接clpP基因的上、下同源臂，扩增AclpP基因片段，此片段缺失了 clpP基因的491bp。而后把这个经改造的AclpP 序列克隆至载体PUC18，最终成为同源重组载体(自杀性质粒)pUCAclpP。采用电转化的方法把自杀性质粒PUC Δ clpP转化到APP CVCC265株中，由于同源重组载体(自杀性质粒) 不能在APP菌中自主复制，因此转入受体菌细胞内的超螺旋的自杀质粒便会被线性化。因自杀质粒上含有受体菌基因的同源序列，它便会插入受菌体CVC(^65的染色体中，接着线性化的质粒与clpP基因发生置换，也就是通常所说的单交换同源重组事件的发生。只有置换到CVCC265染色体上被线性化的自杀质粒才能随着染色体的复制而存在。把受体菌涂布在含有筛选标记的TSA平板上，很容易的筛选出单交换子。由于单交换是整个载体序列 (含筛选药物抗性基因)都置换到染色体上，因此，我们必须进一步筛选目的基因整合到染色体上同时又删除载体序列的双交换子。将获得的同源重组单交换子经液体培养后，涂布于无抗性的TSA平板上，挑取单菌落进行PCR筛选阳性同源重组双交换子，即clpP基因缺失株APP Δ clpP。用APP Δ clpP接种动物，根据动物的临床表现和存活情况分析，APP Δ clpP 毒力弱于其亲本株CVCa65。本发明的主要优点是1、本发明所用的材料为猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型CVCC265株，是购自于中国兽药监察所，APP血清7型菌株是目前我国流行并严重导致猪发病的优势血清型。因此，今后以该菌株构建的clpP基因缺失突变菌株为基础研制的疫苗会具有很强的针对性，有广阔的市场应用前景。2、本发明猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型clpP基因缺失突变菌株不含任何抗性标记，完全符合我国疫苗生物安全要求。
图1为猪胸膜肺炎放线杆菌重组自杀质粒pUC Δ clpP的构建流程图；图2为上同源臂ClpPS和下同源臂ClpPX的PCR扩增结果；图中 1 :ClpPS(1200bp) ；2 =ClpPX(1249bp) ；M :DL2000DNAMarker图3为Δ clpP基因的PCR拼接结果；图中 1 Δ clpP 基因(2449bp) ；M :DL15000DNAMarker图4为重组自杀质粒pUC Δ clpP的PCR鉴定结果；图中 1-3 Δ clpP ；M :DL15000DNA Marker图5为单交换株的PCR鉴定结果；图中 1-3 单交换株；M :DL2000DNA Marker图6为缺失株的PCR鉴定结果；图中M :DL2000DNAMarker ；8号为筛选的clpP基因缺失株图7为缺失株的遗传稳定性实脸结果。图中 1-10 第 1-10 代缺失株；M :DL2000DNA Marker
具体实施例方式下面结合具体实例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。本发明实施例中所涉及的材料菌种APP血清7型CVCC265株购买自中国兽药监察所载体和试剂pUC18质粒、Ex Taq DNA聚合酶2U、T4DNA连接酶购自TaKafci公司。实施例1重组自杀载体pUC Δ clpP的构建1. IClpP蛋白酶基因上、下同源臂的引物设计和PCR扩增
根据已报道的APP-7型AP76株序列(参照GenBank登录号为CP001091. 1的基因序列)设计两对引物分别扩增clpP基因的上同源臂ClpPS和下同源臂ClpPX，扩增片段大小分别为1200bp和lM9bp，上同源臂上游引物5’端设计EcoR I酶切位点，下同源臂下游引物5’端设计BamH I酶切位点。上述引物均由北京华大基因公司合成。猪胸膜肺炎放线杆菌重组自杀质粒PUC Δ clpP的构建流程图如图1所示。扩增上同源臂的引物序列如下ClpSF 5' -CG GAATTC (EcoR I) GGGGCGTTACTGGATGC-3，CIpSR 5，-CCATCGCTTC CGCCTTTGGA GGTTTGC-3，扩增下同源臂的引物序列如下cIpXF 5，-TCCAAAGGCG GAAGCGATGG AATACGGTC-3，ClpXR 5' -CG GGATCC (BamH I) TTCTCTGCTTTAAGTGTCGGC-3，以APP血清7型CVCC265株基因组DNA为模板分别扩增cIpP基因上、下同源臂PCR扩增反应体系为50 μ L，其中模板DNA 10ng，上、下游引物各1 μ M，dNTP 200 μ Μ, IOXTaq buffer 10 μ L，Ex Taq DNA 聚合酶 2U(TaKaRa)。PCR 反应程序为95°C预变性 5min，94°C 60s, 55°C 60s, 72°C 90s，30 个循环，72°C IOmin0 PCR 产物经凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收。上同源臂ClpPS和下同源臂ClpPX的PCR扩增结果如图2所示。1. 2重叠延伸PCR方法扩增Δ clpP基因片段以上、下同源臂的PCR回收产物为模板，采用重叠延伸PCR方法拼接clpP基因的上、下同源臂，扩增Δ clpP基因片段，引物clpSR 5’端下划线部分的碱基与引物clpXF斜粗体部分的碱基反向互补，引物clpXF 5’端下划线部分的碱基与引物clpSR斜粗体部分的碱基反向互补。PCR扩增反应体系为50 μ L，其中模板DNA 10ng，上、下游引物各1 μ M，dNTP 200 μ Μ, IOXTaq buffer 10 μ L, Ex Taq DNA 聚合酶 2U (TaKaRa)。PCR 反应程序为95°C预变性 5min，94°C 60s, 55°C 90s, 72°C 150s，30 个循环，72°C IOmin0 PCR 产物经凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收，然后用EcoR I和BamH I进行酶切，用胶回收试剂盒回收。AclpP基因的PCR拼接结果如图3所示。1. 3重组自杀质粒pUC Δ clpP的构建将纯化的Δ clpP基因片段用T4DNA连接酶(TaKaRa)与经EcoR I和BamH I双酶切消化的PUC18载体相连接，16°C连接Mh，热激转化入大肠杆菌DH5 α感受态细胞，经菌落PCR鉴定为阳性的克隆进行增菌并利用碱裂解法小量提取质粒，经酶切鉴定的阳性质粒命名为pUC AclpP,重组自杀质粒pUC Δ clpP的PCR鉴定结果如图4所示，对克隆的Δ clpP 基因进行测序鉴定。实施例2APP血清7型clpP基因缺失突变株的构建将构建的重组自杀质粒pUCA clpP电转化进入APP血清7型CVC(^65，在IOug/ mLAmp抗性平板上筛选单交换株阳性菌落，并在上、下同源臂内部设计引物，进行PCR鉴定， 野生株能扩增获得858bp片段，缺失株能扩增获得367bp片段，单交换株能同时扩增获得 858bp和367bp片段。单交换株的PCR鉴定结果如图5所示。上述引物均由北京华大基因公司合成。引物序列如下cIpJDF 5' -CGTGGTGTCGCTTGAAACTC-3，
clpJDR 5' -AATTAGACCGTATTCCATCGC-3，将单交换株阳性单菌落在不含Amp抗性的TSB (1 %的烟酰胺腺嘌吟二核苷酸和 10%的马血清)培养增殖后，涂布于无抗性的TSA平板，挑取单菌落，进行PCR鉴定，野生株能扩增获得858bp片段，缺失株仅能扩增获得367bp片段，该阳性克隆命名为APP Δ clpP。将本发明制备的clpP基因缺失突变菌株APP Δ clpP在TSB培养基连续传代10次， 用PCR鉴定，若每一代的突变菌株都能扩增出367bp片段，表明本发明的突变菌株是能够稳定遗传的，缺失株的PCR鉴定结果如图6所示；若扩增出858bp片段，表明本发明的突变菌株是不能稳定遗传的。结果如图7所示本发明制备的clpP基因缺失突变菌株能够稳定遗传。实施例3APP Δ clpP突变株的毒力鉴定和免疫保护实验试验动物4_6周龄SPF级Balb/C雌鼠，购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。3. 1毒力鉴定将小鼠随机分为二组，每组10只。具体接种方案如下第一组(试验组)接种实施例2制备的APPAclpP，稀释为表1中所列浓度 (CFU)，每只小鼠腹腔接种剂量0. Iml。第二组(对照组)接种猪胸膜肺炎放线杆菌CVCC265，稀释为表1中所列浓度 (CFU)，每只小鼠腹腔接种剂量0. Iml。小鼠存活情况见表1。表权利要求
1.一种不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型ClpP基因缺失株，其特征在于 该菌株缺失了 ClpP蛋白酶的编码基因。
2.如权利要求1所述的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型clpP基因缺失株，其特征在于 所述ClpP蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一种构建权利要求1所述的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型clpP基因缺失株的方法，其特征在于缺失株是通过将DNA片段Δ clpP导入所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型菌株经同源重组实现的；所述DNA片段AclpP从上游至下游依次为同源臂ClpPS和同源臂 ClpPX 所述同源臂ClpPS和同源臂ClpPX能与所述猪胸膜肺炎放线杆菌中的ClpP蛋白酶编码基因的上游序列和下游序列发生同源重组、灭活所述ClpP蛋白酶的编码基因。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述ClpP蛋白酶的编码基因如SEQIDNO. 1 所示。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于扩增上同源臂ClpPS的引物序列如下所示 clpSF :5，-CG GAATTC (EcoR I) GGGGCGTTACTGGATGC-3，cIpSR :5，-CCATCGCTTC CGCCTTTGGA GGTTTGC-3‘ 扩增下同源臂ClpPX的引物序列如下所示 cIpXF :5，-TCCAAAGGCG GA A GCGATGG AATACGGTC-3’ clpXR 5' -CG GGATCC (BamH I) TTCTCTGCTTTAAGTGTCGGC-3，。
6.如权利要求1所述的一种不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型clpP基因缺失株，其特征在于所述的基因缺失株为胸膜肺炎放线杆菌重组菌APP Δ clpP,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCCNo. 5258。
7.权利要求1、2或6中任一项所述的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型clpP基因缺失株在制备猪传染性胸膜肺炎疫苗中的应用。
8.一种猪传染性胸膜肺炎疫苗，其活性成分为权利要求1、2或6中任一项所述的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型clpP基因缺失株。
全文摘要
本发明公开了一种不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌ClpP蛋白酶基因缺失株及其制备方法，属于细菌基因工程技术领域。本发明公开的一种胸膜肺炎放线杆菌的重组菌APPΔclpP，是采用定向同源重组技术将胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropeumoniae)中的ClpP蛋白酶的编码基因灭活得到的菌株，破坏了ClpP蛋白酶的表达。本发明得到的突变株比亲本株毒力小，对动物安全，对猪传染性胸膜肺炎疫苗的改造及配套的鉴别诊断试剂的研制提供了重要依据，对促进全球猪传染性胸膜肺炎的根除和净化具有十分重要的意义。
文档编号C12R1/01GK102443552SQ20111033686
公开日2012年5月9日 申请日期2011年10月31日 优先权日2011年10月31日
发明者张艳禾, 朱晓凯, 李建军, 李艳玲, 王春来, 谢芳 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所