专利名称：产脂肪酶基因工程菌株及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一株产脂肪酶基因工程菌株及其构建方法。
背景技术：
脂肪酶lipase是一种特殊的酯键水解酶，它能分解生物所产生的各种天然的油和脂肪，主要水解由甘油和十二碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯；同时，还可以催化甘油三酯与低碳醇的酯交换反应。由于脂肪酶的这种催化特性，使其可以应用在生物柴油的生产中。生物柴油是近年来开始研究的一种性质类似于柴油的可再生的新型生物质能。生物柴油主要以植物油、动物油和废弃食用油为原料，生产方法可以分为直接混合使用、微乳化法、热解法和酯交换法。脂肪酶可以应用在催化酯交换反应中，这种催化反应的反应条件温和，副产品分离较简单，不污染环境。但是，目前，使用的脂肪酶大多数都是进口的，价格昂贵，导致生物柴油价格偏贵，不利于生物柴油的产业化生产和推广使用。
发明内容
本发明是要解决现有脂肪酶大多数都是进口的，价格昂贵，导致生物柴油价格偏贵的问题，提供产脂肪酶基因工程菌株及其构建方法。本发明产脂肪酶基因工程菌株的细胞呈椭圆形，出芽生殖，形成子囊孢子；孢子呈短棒槌形；菌落呈圆形，颜色为乳白色，不透明，表面光滑、湿润；产脂肪酶酶活高。上述产脂肪酶基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行一、产脂肪酶菌株解脂耶罗维亚酵母HDY-76基因组DNA的提取取3mL解脂耶罗维亚酵母HDY-76的菌液，于 12000r/min离心lmin，弃去上清，按TIANGEN公司的基因组DNA提取试剂盒提取解脂耶罗维亚酵母HDY-76基因组DNA ；二、lip7基因的PCR扩增以步骤一提取到的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得扩增产物，将扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测；将扩增产物采用胶回收试剂盒进行纯化，获得目的基因lip7，将目的基因lip7进行测序验证其准确性；三、 重组表达载体pGAPH α M-Iip7的构建将目的基因lip7用Bio I和Not I进行双酶切，将表达载体PGAPH α M用Bio I和Not I进行双酶切，酶切后纯化回收目的基因lip7与表达载体pGAPH α M，用T4DNA连接酶于4°C连接10 14h，得到重组载体pGAPH α M_1 ip7 ；四、产脂肪酶基因工程菌株构建用限制性内切酶BglII对重组载体pGAPH α M-lip7进行酶切，酶切后回收重组载体pGAPH α M-Iip7，将酶切后的重组载体pGAPH α M_1 ip7与毕赤酵母感受态细胞GS115混合进行电击转化，然后将菌液涂布于MD固体培养基上，28°C恒温培养至长出菌落，随机挑取MD固体培养基上的单菌落，接种于5mL YPD培养基中，28°C震荡培养72h， 然后于5000r/min离心5min，取上清测定酶活，有酶活力的单菌落为阳性转化子，即完成产脂肪酶基因工程菌株的构建；其中步骤一中解脂耶罗维亚酵母HDY-76的菌液浓度为IO6 107cfu/mL ；步骤二中 PCR 扩增的正向引物为 5' -ACTCTCGAGATGGTCAGCTTTGGAG-3‘，反向引物为 5 ‘ -AAAGCGGCCGCTTAGTTGGAGAGCTC-3 ‘。
本发明的有益效果本发明构建的产脂肪酶工程菌株生物发酵产生的脂肪酶酶活为322.91 335. 95U/mL,比初始菌株脂肪酶酶活151. 73 159. 47U/mL有显著的提高。目前，工业用脂肪酶大多数都是进口的，价格昂贵，严重限制了其推广应用。本发明利用基因重组技术构建脂肪酶高产工程菌株，为将其应用在酶法催化油脂生产生物柴油中奠定了基础，可降低生物柴油的生产成本，为产业化生产和推广使用生物柴油提供了新思路。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式产脂肪酶基因工程菌株的细胞呈椭圆形，出芽生殖， 形成子囊孢子；孢子呈短棒槌形；菌落呈圆形，颜色为乳白色，不透明，表面光滑、湿润 ’产脂肪酶酶活高。挑取一环本实施方式产脂肪酶基因工程菌株，转接到种子培养基中，置于^°C、 180r/min摇床上振荡培养Mh，得种子液；以3% (ν/ν)的接种量将种子液接种到发酵培养基中，于振荡培养72h，得发酵液，将发酵液于5000r/min、4°C离心5min，取上清液，即得粗酶液。采用滴定法对粗酶液进行测定，得到本实施方式产脂肪酶基因工程菌株的脂肪酶酶活为322. 91 335. 95U/mL。所述种子培养基和发酵培养基为YPD培养基。
具体实施方式
二 本实施方式产脂肪酶基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进
行一、产脂肪酶菌株解脂耶罗维亚酵母HDY-76基因组DNA的提取取3mL解脂耶罗维亚
酵母HDY-76的菌液，于12000r/min离心lmin，弃去上清，按TIANGEN公司的基因组DNA
提取试剂盒提取解脂耶罗维亚酵母HDY-76基因组DNA ；二、lip7基因的PCR扩增以步骤
一提取到的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得扩增产物，将扩增产物用1 %琼脂糖凝胶
电泳检测；将扩增产物采用胶回收试剂盒进行纯化，获得目的基因lip7，将目的基因lip7
进行测序验证其准确性；三、重组表达载体pGAPHaM-lip7的构建将目的基因lip7用
Xho I和Not I进行双酶切，将表达载体pGAPHaM用Xho I和Not I进行双酶切，酶切后
纯化回收目的基因lip7与表达载体pGAPHaM，用T4DNA连接酶于4°C连接10 14h，得
到重组载体pGAPHaM-lip7 ；四、产脂肪酶基因工程菌株构建用限制性内切酶BglII对重
组载体pGAPHa M_lip7进行酶切，酶切后回收重组载体pGAPH a M_lip7，将酶切后的重组
载体pGAPH a M-Iip7与毕赤酵母感受态细胞GS115混合进行电击转化，然后将菌液涂布
于MD固体培养基上恒温培养至长出菌落，随机挑取MD固体培养基上的单菌落，接种
于5mL YPD培养基中震荡培养72h，然后于5000r/min离心5min，取上清测定酶活，
有酶活力的单菌落为阳性转化子，即完成产脂肪酶基因工程菌株的构建；其中步骤一中解
脂耶罗维亚酵母HDY-76的菌液浓度为IO6 107Cfu/mL ；步骤二中PCR扩增的正向引物为
5 ‘ -ACTCTCGAGATGGTCAGCTTTGGAG-3 ‘，反向引物为 5 ‘ -AAAGCGGCCGCTTAGTTGGAGAGCTC-3 /
ο步骤二中获得的目的基因lip7序列如SEQ ID NO=I所示。本实施方式步骤一所述解脂耶罗维亚酵母HDY_76(Yarrowia IipolyticaHDY-76)保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2011年9月15日，保藏编号为CCTCC No =M 2011311。步骤五中所述MD固体培养基(IOOOmL)由0. ^ig生物素、3. 4g酵母、20. Og葡萄糖、 15. Og琼脂和余量的蒸馏水组成。步骤五中所述YPD培养基(IOOOmL)由10. Og酵母提取物、20. Og蛋白胨、20. Og葡
萄糖和余量的蒸馏水组成。本实施方式构建的产脂肪酶工程菌株生物发酵产生的脂肪酶酶活的检测试验， 具体如下1、种子液的制备挑取一环平板上的阳性转化子，转接到种子培养基中，置于 ^°C、180r/min摇床上振荡培养Mh，得种子液；2、粗酶液制备以3% (ν/ν)的接种量将种子液接种到发酵培养基中，于振荡培养72h，得发酵液，将发酵液于5000r/min、4°C离心5min，取上清液，即得粗酶液；所述种子培养基和发酵培养基为YPD培养基。滴定法测定脂肪酶酶活酶活定义lmL酶液于40°C、pH 7. 5条件下，水解脂肪每分钟生成1 μ mol的脂肪酸定义为1个酶活力单位；1)分别将4mL橄榄油PVA乳化液和5mL 0. 025mol/L、pH 7. 5的磷酸盐缓冲液加入到250mL三角烧瓶中；2)在40°C水浴锅中预热5min后，加入ImL粗酶液，反应15min ；3)加入15mL体积浓度95%的乙醇，滴加3滴酚酞，0. 05mol/L的NaOH溶液滴定， 记录消耗的碱量V1。4)空白液先加乙醇，再加酶液，其余操作相同，此时消耗的碱量为N0。每次试验测定结果都采用三个平行组，测试结果为各重复样的平均值，试验结果以X 士S表示。酶活计算公式酶活力(U/mL) = (V1-V0)AXnX50 ；式中V1为样品耗碱量，V0为对照样品耗碱量；t为反应时间；η为样品的稀释倍数。结果本实施方式构建的产脂肪酶工程菌株生物发酵产生的脂肪酶酶活为 322. 91 335. 95U/mL,比初始菌株脂肪酶酶活151. 73 159. 47U/mL有显著的提高。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
二不同的是步骤二中PCR扩增的
反应体系如下成分用量
50ng/|iL的解脂耶罗维亚酵母HDY-76基因组DNA0.5|iL
10mmol L的引物Pl
0.5|iL
5，- ACTCTCGAGATGGTCAGCTTTGGAG -3， 10mmol L的引物P2
0.5|iL
5，- AAAGCGGCCGCTTAGTTGGAGAGCTC -3，
IOxHBuffer2.5|iL
dNTP2.0|iL
Taq 酶0.5|iL
ddH2018.5|iLPCR扩增条件为941预变性41^11，941变性妨8，58. 5°C退火30s，72°C延伸80s， 共32个循环，再72°C延伸10min，4°C保温。其它与具体实施方式
二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
二不同的是步骤三中将目的基因 lip7用Xho I和Not I进行双酶切的体系如下
成分用量
16ng/|iL目的基因/中715|iL
Xhol3μL
Notl3μL
IOxHBuffer6|iL
ddH2033μL酶切反应条件37°C，12 14h。其它与具体实施方式
二相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
二不同的是步骤三中将表达载体 pGAPH α M用Xho I和Not I进行双酶切的体系如下
成分用量
16ng/|iL 表达载体 pGAPHaM15|iL
Xhol3μL
Notl3μL
IOxHBuffer6|iL
ddH2033μL酶切反应条件37°C，12 14h。其它与具体实施方式
二相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
二不同的是步骤三中连接反应体系如下
成分用量
16ng/|iL目的片段6|iL
16ng/|iL表达载体2|iL
T4 DNA 酶Ιμ
IOxBuffer\μL其它与具体实施方式
二相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
二不同的是步骤四中酶切的体系
如下
成分用量
16ng/|iL 重组载体 pGAPHaM-/中715|iL
Bglll1.5|iL
Buffer3 μ
ddH200.5|iL酶切反应条件37°C，12 14h。其它与具体实施方式
二相同。
权利要求
1.产脂肪酶基因工程菌株，其特征在于产脂肪酶基因工程菌株的细胞呈椭圆形，出芽生殖，形成子囊孢子；孢子呈短棒槌形；菌落呈圆形，颜色为乳白色，不透明，表面光滑、湿润；产脂肪酶酶活高。
2.权利要求1所述的产脂肪酶基因工程菌株的构建方法，其特征在于产脂肪酶基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行一、产脂肪酶菌株解脂耶罗维亚酵母HDY-76基因组 DNA的提取取3mL解脂耶罗维亚酵母HDY-76的菌液，于12000r/min离心lmin，弃去上清， 按TIANGEN公司的基因组DNA提取试剂盒提取解脂耶罗维亚酵母HDY-76基因组DNA ；二、 lip7基因的PCR扩增以步骤一提取到的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得扩增产物，将扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测；将扩增产物采用胶回收试剂盒进行纯化，获得目的基因lip7，将目的基因lip7进行测序验证其准确性；三、重组表达载体pGAPHaM-lip7的构建将目的基因lip7用Xho I和Not I进行双酶切，将表达载体pGAPH α M用Xho I和Not I进行双酶切，酶切后纯化回收目的基因lip7与表达载体pGAPH α M，用T4 DNA连接酶于4°C 连接10 14h，得到重组载体pGAPHaM-lip7 ；四、产脂肪酶基因工程菌株构建用限制性内切酶BglII对重组载体pGAPH α M-Iip7进行酶切，酶切后回收重组载体pGAPH α M_1 ip7， 将酶切后的重组载体pGAPHaM-lip7与毕赤酵母感受态细胞GS115混合进行电击转化，然后将菌液涂布于MD固体培养基上，28 °C恒温培养至长出菌落，随机挑取MD固体培养基上的单菌落，接种于5mLYPD培养基中，震荡培养72h，然后于5000r/min离心5min，取上清测定酶活，有酶活力的单菌落为阳性转化子，即完成产脂肪酶基因工程菌株的构建；其中步骤一中解脂耶罗维亚酵母HDY-76的菌液浓度为IO6 107Cfu/mL ；步骤二中PCR扩增的正向引物为 5' -ACTCTCGAGATGGTCAGCTTTGGAG-3‘，反向引物为 5' -AAAGCGGCCGCTTAGTTGGA GAGCTC-3‘。
3.根据权利要求2所述的产脂肪酶基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤二中 PCR扩增的反应体系如下成分用量50ng/|iL的解脂耶罗维亚酵母HDY-76基因组DNA0.5|iL10mmol/|iL 的引物 Pl 5’- ACTCTCGAGATGGTCAGCTTTGGAG -3，μ10mmol/|iL 的引物 P2 5’- AAAGCGGCCGCTTAGTTGGAGAGCTC -3，μIOxHBuffer2.5|iLdNTP2.0|iLTaq 酶0.5μ ddH2018.5|iLPCR扩增条件为94°C预变性％iin，94°C变性45s，58. 5°C退火30s，72°C延伸80s，共32 个循环，再72°C延伸10min，4°C保温。
4.根据权利要求2所述的产脂肪酶基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤三中将目的基因lip7用Bio I和Not I进行双酶切的体系如下成分用量16ng/|iL目的基因/中715|iLXhol3μLNotl3μLIOxHBuffer6|iLddH2033μL酶切反应条件37°C，12 14h。
5.根据权利要求2所述的产脂肪酶基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤三中将表达载体PGAPH α M用Bio I和Not I进行双酶切的体系如下成分用量16ng/|iL 表达载体 pGAPHaM15|iLXhol3μLNotl3μLIOxHBuffer6|iLddH2033μL酶切反应条件37°C，12 14h。
6.根据权利要求2所述的产脂肪酶基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤三中连接反应体系如下成分用量16ng/|iL目的片段6|iL16ng/|iL表达载体2|iLT4 DNA 酶Ιμ IOxBuffer\μL
7.根据权利要求2所述的产脂肪酶基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤四中酶切的体系如下成分用量16ng/|iL 重组载体 pGAPHaM-/中715|iLBglll1.5|iLBuffer3 μ ddH200.5|iL酶切反应条件37°C，12 14h。
全文摘要
产脂肪酶基因工程菌株及其构建方法，涉及一株产脂肪酶基因工程菌株及其构建方法。是要解决现有脂肪酶大多数都是进口的，价格昂贵，导致生物柴油价格偏贵的问题。产脂肪酶基因工程菌株的细胞细胞呈椭圆形，出芽生殖，形成子囊孢子；孢子呈短棒槌形；菌落呈圆形，乳白色，不透明，表面光滑、湿润；产脂肪酶酶活高。方法产脂肪酶菌株解脂耶罗维亚酵母HDY-76基因组DNA的提取；lip7基因的PCR扩增；重组表达载体pGAPHαM-lip7的构建；产脂肪酶基因工程菌株构建。本发明构建的产脂肪酶工程菌株生物发酵产生的脂肪酶酶活高。为将其应用在酶法催化油脂生产生物柴油中奠定了基础，可降低生物柴油的生产成本。
文档编号C12R1/645GK102505001SQ201110327510
公开日2012年6月20日 申请日期2011年10月25日 优先权日2011年10月25日
发明者赵凯 申请人:黑龙江大学