专利名称：克隆青虾chh基因的引物组及克隆青虾chh基因的方法
技术领域：
发明涉及CHH基因，具体地说是一种青虾(Mcrobrachium nipponense) CHH基因和编码蛋白及其克隆方法。
背景技术：
CHH家族激素在调控甲壳运物的蜕皮、变态发育、生殖、血糖平衡以及体内的渗透压等方面起着重要的作用。甲壳类高血糖激素(Crustacean hyperglycemic hormone, CHH)是 CHH 家族的一员，可以通过调控磷酸化酶、糖原合成酶以及中肠淀粉酶活性使无眼柄的甲壳动物血糖增加，CHH根据内部信号如血淋巴中葡萄糖量，外部信号如缺氧、寄生虫感染、热激、污染物等做出反应。除了糖代谢外，CHH也参与脂代谢(Santos等，1997)、控制鳃的离子转运(Pienot 等，2000)以及调节渗透压。研究表明，克氏原鳌虾iProcmibariis clarkii)的CHH异构体对大颚器官MF的合成具有抑制作用(Laufer等，1994)，同样无缘蜘蛛蟹Hibinia emarginata)的CHH异构体也对MF的合成也具有调节作用(Liu等，1997)。许多证据显示CHH对生殖具有促进作用Jensen等(1989)利用异源体内生物活性检测的方法，发现美洲鳌龙虾(Homarus americanus)的两种CHH-B的异构体对来自无常小长臂虾(Palaemonetes varians)的非卵黄发生期的卵细胞的生长具有促进作用，另外在同源体外生物活性检测中也发现两种CHHB异构体对生殖具有促进作用(Van Herp, 1992) 0 雌性美洲鳌龙虾卵黄发生前期CHH-A与CHH-B的mRNA水平及眼柄中CHH的浓度显著变高， 在卵成熟过程中，血淋巴中的CHH-A与CHH-B浓度亦变高，而GIH浓度变高的阶段则出现在卵黄发生前期及未成熟期。这一结果表明，CHH-A与CHH-B对卵黄发生起着激发作用，GIH 则对卵黄发生起着抑制作用。甲壳类高血糖激素(Crustacean hyperglycemic hormone，CHH)，是甲壳动物眼柄中含量最丰富且被研究的最多的激素。目前关于青虾CHH的研究尚未进行。因此，本发明以青虾眼柄为材料，分离了青虾CHH的全长cDNA序列，并对其所编码的神经肽的序列特征、 同源性、进化地位进行了分析，为全面掌握其生理功能提供了基础资料，为进一步研究青虾 CHH基因的表达、调控奠定了基础，同时也为甲壳动物整个CHH家族的功能和进化研究提供了新的材料。
发明内容
有鉴于此，本发明提供克隆青虾CHH基因系列的引物组和编码蛋白及其克隆方法。利用本发明提供的引物组首次从青虾眼柄中克隆到了一种CHH基因，为进一步研究CHH 基因参与血糖调节、脂代谢、离子转运、渗透压以及促进卵黄生成作用等奠定基础，为青虾繁殖生理功能研究提供参考。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案
本发明提供了扩增青虾AST基因全长cDNA序列的引物组，其由如下引物组成 引物组1:
正向引物FSl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 反向引物RS4的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 引物组2
正向外引物FC3-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示； 正向内引物FC3-3的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示; 反向外引物3' RACE Outer Primer的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示； 反向内引物3' RACE Inner Primer的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。引物组3:
正向外引物RC5-1的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示； 正向内引物RC5-3的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示； 反向外引物5' RACE Outer Primer的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示； 反向内引物5' RACE Inner Primer的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示。本发明还提供了一种克隆青虾CHH基因全长序列的方法，包括如下步骤 步骤1 从青虾眼柄中提取总RNA ；
步骤2 然后RT进行cDNA第一链合成；
步骤3 用引物组1扩增获得青虾CHH基因才cDNA序列中间片段；所述引物组1由如下引物组成
正向引物FSl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 反向引物RS4的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示；
步骤4 用引物组2扩增获得青虾CHH基因cDNA序列的3’端片段；所述引物组2由如下引物组成
正向外引物FC3-2的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示； 正向内引物FC3-3的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 反向外引物3' RACE Outer Primer的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示； 反向内引物3' RACE Inner Primer的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。步骤5 用引物组3扩增获得青虾CHH基因cDNA序列的5’端片段；所述引物组3 由如下引物组成
正向外引物RC5-1的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示； 正向内引物RC5-3的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示； 反向外引物5' RACE Outer Primer的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示； 反向内引物5' RACE Inner Primer的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示。步骤6 将所述CHH基因的3’端和5’端片段拼接，即得。作为优选，步骤4和5所述扩增为套式两轮PCR。本发明以青虾眼柄组织为材料，分离了青虾CHH基因全长序列，利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、嵌套聚合酶链反应(NeSted-PCR)、3，端cDNA快速扩增(3，-RACE)以及5’端cDNA快速扩增(5’ -RACE)的方法，对青虾CHH基因进行了研究，首次从青虾眼柄组织中克隆到了 CHH基因全长序列，并对其所编码的神经肽的序列特征、同源性、进化地位进行了分析，为进一步研究青虾CHH基因的表达、调控奠定了基础，为CHH基因参与血糖调节、 脂代谢、离子转运、渗透压以及促进卵黄生成作用的研究提供参考，同时也为甲壳动物CHH 基因功能和进化研究提供了新的背景资料。
图1为青虾CHH前体与其它甲壳动物CHH前体的氨基酸序列比对，其中竖线“ |，， 表示信号肽和二盐基的切割位点；
图2为CHH前体的NJ系统进化树。
具体实施例方式本发明公开了扩增青虾CHH基因全长序列的引物组和编码蛋白及其克隆方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供了扩增青虾CHH基因全长序列的引物组，其由如下引物组成 引物组1:
正向引物FSl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 反向引物RS4的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 引物组2
正向外引物FC3-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示； 正向内引物FC3-3的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示; 反向外引物3' RACE Outer Primer的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示； 反向内引物3' RACE Inner Primer的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。引物组3:
正向外引物RC5-1的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示； 正向内引物RC5-3的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示； 反向外引物5' RACE Outer Primer的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示； 反向内引物5' RACE Inner Primer的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示。本发明还提供了一种扩增青虾CHH基因全长序列的方法，包括如下步骤 步骤1 从青虾眼柄中提取总RNA ；
步骤2 然后RT进行cDNA第一链合成；
步骤3 用引物组1扩增获得青虾CHH基因才cDNA序列中间片段；所述引物组1由如下引物组成
正向引物FSl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 反向引物RS4的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示；
步骤4 用引物组2扩增获得青虾CHH基因cDNA序列的3’端片段；所述引物组2由如下引物组成
正向外引物FC3-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示； 正向内引物FC3-3的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示; 反向外引物3' RACE Outer Primer的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示； 反向内引物3' RACE Inner Primer的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。步骤5 用引物组3扩增获得青虾CHH基因cDNA序列的5’端片段；所述引物组3 由如下引物组成
正向外引物RC5-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示； 正向内引物RC5-3的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示； 反向外引物5' RACE Outer Primer的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示； 反向内引物5' RACE Inner Primer的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示。步骤6 将所述CHH基因的3’端和5’端片段拼接，即得。作为优选，步骤4和5所述扩增为套式两轮PCR。使用ClustalWl. 83将CHH基因编码的前体氨基酸序列与已公布的部分甲壳类和昆虫CHH(包括PO型和ES型，PO型用CHH-PO表示)基因编码的前体氨基酸序列进行了比对。比对结果(如图1)。结果显示，青虾CHH与R. kairei、圣诞岛红蟹、云斑厚纹蟹、三叶真蟹、榄绿青蟹这五种虾蟹的ES型CHH的相似性各自都比青虾CHH与这五种虾蟹的PO型 CHH的相似性高，由此可以确定所分离得到的青虾CHH为ES型。通过对青虾中获得的CHH基因cDNA编码的氨基酸序列与其它甲壳类和昆虫的CHH 氨基酸序列，使用MEGA 4构建NJ系统发育树(如图2)，CHH分支中，海螯虾类与鳌虾类先聚在一起，再与沼虾类聚在一起(booststrap值仅为37)，然后再与蟹类聚在一起，最后与对虾类的CHH聚为一支。本发明中青虾由太湖无锡湖区渔民提供，试剂均可由市场够得，纯化及cDNA第一链合成试剂盒购自上海生工生物工程有限公司(Sang0n)，3'及5' RACE试剂盒购自宝生物(大连)有限公司(Takara)。下面结合实施例，进一步阐述本发明 实施例1
总RNA提取逐个取青虾眼柄组织，迅速放入盛有液氮的预冷研钵中，共取六只青虾的脑组织共约30mg，解剖速度要快并且注意添加液氮；总RNA的提取使用Takara公司的 RNAiso Plus提取试剂结合传统的酚仿抽提法进行，提取方法参照使用说明书。cDNA第一链合成据上海生工生物工程有限公司(Sangon) cDNA合成试剂盒说明书进行。青虾CHH基因全长cDNA序列的克隆
牛艮据已获得的罗氏沼虫下(Macrobrachium rosenbergii) CHH 禾口 Rimicaris kairei 的 cDNA编码区进行比较，依据比对结果，在保守区域设计引物，用于PCR扩增，得到青虾CHH基因全长cDNA序列； 正向引物
FSl 5' - GYSTYGMCAGGATRGAGAAGCTC -3' 反向引物
6RS4 5' - ATCTGGACffGMGKTSRCGTATTC -3' PCR扩增反应体系如下
权利要求
1.克隆青虾CHH基因的引物组，其特征在于，其由如下引物组成 引物组1:正向引物FSl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 反向引物RS4的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 引物组2 正向外引物FC3-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示； 正向内引物FC3-3的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示; 反向外引物3' RACE Outer Primer的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示； 反向内引物3' RACE Inner Primer的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示； 引物组3 正向外引物RC5-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示； 正向内引物RC5-3的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示； 反向外引物5' RACE Outer Primer的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示； 反向内引物5' RACE Inner Primer的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示。
2.一种克隆青虾GHH基因的方法，其特征在于，包括如下步骤 步骤1 从青虾眼柄中提取总RNA ；步骤2 然后RT进行cDNA第一链合成；步骤3 用引物组1扩增获得青虾CHH基因才cDNA序列中间片段；所述引物组1由如下引物组成正向引物FSl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 反向引物RS4的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；步骤4 用引物组2扩增获得青虾CHH基因cDNA序列的3’端片段；所述引物组2由如下引物组成正向外引物FC3-2的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示； 正向内引物FC3-3的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 反向外引物3' RACE Outer Primer的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示； 反向内引物3' RACE Inner Primer的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示； 步骤5 用引物组3扩增获得青虾CHH基因cDNA序列的5’端片段；所述引物组3由如下引物组成正向外引物RC5-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示； 正向内引物RC5-3的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示； 反向外引物5' RACE Outer Primer的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示； 反向内引物5' RACE Inner Primer的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示； 步骤6 将所述CHH基因的3’端和5’端片段拼接，即得。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4和5所述扩增为套式两轮PCR。
全文摘要
本发明涉及基因克隆领域，特别涉及青虾甲壳类高血糖激素(Crustaceanhyperglycemichormone，CHH)基因和编码蛋白及其克隆方法。利用本发明提供的引物组从青虾眼柄组织中克隆到了一种CHH基因，为研究CHH基因参与血糖调节、脂代谢、离子转运、渗透压以及促进卵黄生成作用等提供理论参考，为青虾繁殖生理功能研究奠定理论基础。
文档编号C12N15/10GK102433329SQ20111030379
公开日2012年5月2日 申请日期2012年2月6日 优先权日2012年2月6日
发明者乔慧, 傅洪拓, 吴滟, 王宁 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心