专利名称：一种人脐带间充质细胞的分离和培养方法
技术领域：
本发明涉及一种人脐带间充质细胞的分离和培养方法。
背景技术：
因胚胎干细胞受伦理学限制，2006年日本学者Siinya Yamanaka将鼠成纤维细胞重编程为多潜能分化干细胞，该细胞理论上具有分化为三胚层细胞能力。2007年日本学者 Shinya Yamanaka与美国学者Thompson将人皮肤成纤维细胞重编程为多潜能分化干细胞， 随后全球掀起多潜能分化干细胞重编程热潮，但是目前重编程细胞来源受个体差异、免疫反应、动物源性成分污染等困扰，因此，需要寻找一种容易获得，不存在伦理学限制、免疫反应和动物源性污染等问题的重编程细胞来源，以保证多潜能分化干细胞能安全、普遍地应用于临床。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人脐带间充质细胞的分离和培养方法，其具有操作简单、易于推广等优点，能够方便地获取低免疫源性的人脐带间充质细胞，其作为重编程细胞来源，可重编程为多潜能分化干细胞，供基础与临床研究用。本发明的目的是通过以下技术方案实现的一种人脐带间充质细胞的分离方法， 包括以下步骤1)取人脐带活组织，洗净，切碎；2)加入胶原酶IV，置于(X)2培养箱中进行消化处理，然后加入DMEM/F12培养基终止消化，离心，弃上清液；3)加入胰酶，置于(X)2培养箱中进行消化处理，然后加入DMEM/F12培养基终止消化；4)过滤，取滤液进行离心，离心后弃上清液，然后加入DMEM/F12培养基重悬细胞。进一步地，在所述的步骤2)中，胶原酶IV的浓度为lmg/ml ;3mg/ml，消化处理的时间为3. 5 4. 5小时。胶原酶IV能够从组织中消化下细胞，具有作用温和、对细胞损伤较小等优点，实验表明，采用浓度为lmg/ml 3mg/ml的胶原酶IV消化3. 5 4. 5小时，得到的单个细胞量最多，而且细胞活力最佳；如果降低胶原酶IV的浓度、延长消化处理的时间，或者提高胶原酶IV的浓度、缩短消化处理的时间，均不利于单个细胞数量和细胞活力的最大化。进一步地，在所述的步骤3)中，胰酶的浓度为0. 05% 0. 50%，消化处理的时间为10 20分钟。进一步地，所述的胰酶中还添加有浓度为0. 02%的EDTA。经胶原酶IV分离得到的细胞往往是抱团生长的，并非单细胞生长。而胰酶是多种酶的复合体，它能够将组织分化为单个细胞，以供单个细胞贴壁生长。在胰酶中添加EDTA 是为了螯合钙镁离子(因为钙镁离子会抑制胰酶的活性以及破坏细胞间的连结结构)，进一步提高胰酶的活性，使细胞能够分散成单个细胞，从而获得数量和活力最大化的单个贴壁生长的脐带间充质细胞。进一步地，所述的DMEM/F12培养基中还添加有10% FBS、1 %非必需氨基酸、1 % L-谷氨酸盐、青-链霉素和ImM 2-巯基乙醇。进一步地，所述步骤2)和步骤4)中的离心条件为1500rpm 3000rpm，5 10分钟。采用这一离心条件，能够最大限度地减少原代细胞在离心过程中死亡。进一步地，在所述的步骤2)和步骤3)中，CO2培养箱的培养条件为37°C、5% CO20进一步地，在所述的步骤4)中，采用直径为40 μ m的呢绒滤网进行过滤。呢绒滤网具有滑糯、柔软、悬垂性好、对细胞损伤小等优点，而40 μ m的滤孔直径与脐带间充质细胞的直径相当，能够只让单个脐带间充质细胞通过，其它未被消化为单个细胞的则不能通过，从而提高了细胞的纯度。一种人脐带间充质细胞的培养方法，包括以下步骤a.采用明胶对培养皿进行包被处理，然后用无Ca2+和Mg2+的PBS缓冲液对该培养皿进行洗涤；b.取根据本发明所述分离方法获得的细胞，接种到经步骤a处理后的培养皿中；c.待细胞汇合生长至85% 90%时，进行消化传代。进一步地，在所述的步骤a中，采用浓度为0. 01% 0. 02%的明胶对培养皿包被 20 30分钟。进一步地，在所述的步骤b中，细胞以0. 5X IO5 1. OXlO5的浓度接种到经步骤
a处理后的培养皿中。本发明采用酶消化法获得人脐带间充质细胞，该方法具有操作简单、容易掌握、便于推广等优点，而且获得的人脐带间充质细胞免疫源性低，无动物源性细胞污染，不存在传播异种病原体的危险，为日后人脐带间充质细胞重编程为多潜能分化干细胞的应用进行铺垫。
具体实施例方式DMEM/F12培养基的准备在DMEM/F12基础培养基中添加10% FBS、1%非必需氨基酸、L-谷氨酸盐、青-链霉素和ImM 2-巯基乙醇。取1 3厘米破宫产近胎儿端人脐带活组织，采用无Ca2+和Mg2+的PBS缓冲液对人脐带活组织进行清洗，并将人脐带活组织切碎至0. 5 1毫米的大小。将剪碎的人脐带组织块平铺至IOcm的培养皿中，加入IOml浓度为ang/ml的胶原酶IV，置于37°C、5% CO2培养箱中4小时，然后加入DMEM/F12培养基终止消化，在3000rpm 下离心8分钟，吸弃上清液。加入8ml浓度为0.25%的胰酶(含0. 02%的EDTA)，置于37°C、5% CO2培养箱中 15分钟，然后加入DMEM/F12培养基终止消化，并用孔径为40 μ m的呢绒滤网进行过滤，取滤液在1500rpm下离心8分钟，吸弃上清液，加入DMEM/F12培养基，重悬细胞。取IOcm的培养皿，预先用浓度为0. 01 %的明胶包被30分钟，然后用无Ca2+和Mg2+ 的PBS缓冲液洗涤2次。以IXlO5的浓度，将得到的细胞悬液接种在该培养皿中。每周换液2次，直至细胞汇合生长至85%，进行消化传代。
权利要求
1.一种人脐带间充质细胞的分离方法，包括以下步骤1)取人脐带活组织，洗净，切碎；2)加入胶原酶IV，置于(X)2培养箱中进行消化处理，然后加入DMEM/F12培养基终止消化，离心，弃上清液；3)加入胰酶，置于(X)2培养箱中进行消化处理，然后加入DMEM/F12培养基终止消化；4)过滤，取滤液进行离心，离心后弃上清液，然后加入DMEM/F12培养基重悬细胞。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于在所述的步骤2)中，胶原酶IV的浓度为lmg/ml 3mg/ml，消化处理的时间为3. 5 4. 5小时。
3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于在所述的步骤幻中，胰酶的浓度为 0. 05% 0. 50%，消化处理的时间为10 20分钟。
4.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于所述的胰酶中还添加有浓度为 0. 02% 的 EDTA。
5.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于所述的DMEM/F12培养基中还添加有 10% FBS、非必需氨基酸、L-谷氨酸盐、青-链霉素和ImM 2-巯基乙醇。
6.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于所述的步骤2)、步骤4)中的离心条件为 1500rpm 3000rpm, 5 10 分钟。
7.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于在所述的步骤2)和步骤3)中，CO2 培养箱的培养条件为37°C、5% C02。
8.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于在所述的步骤4)中，采用直径为 40 μ m的呢绒滤网进行过滤。
9.一种人脐带间充质细胞的培养方法，包括以下步骤a.采用明胶对培养皿进行包被处理，然后用无Ca2+和Mg2+的PBS缓冲液对该培养皿进行洗涤；b.取根据权利要求1所述分离方法获得的细胞，接种到经步骤a处理后的培养皿中；c.待细胞汇合生长至85% 90%时，进行消化传代。
10.根据权利要求9所述的培养方法，其特征在于在所述的步骤a中，采用浓度为 0. 01% 0. 02%的明胶对培养皿包被20 30分钟。
11.根据权利要求9所述的培养方法，其特征在于在所述的步骤b中，细胞以 0. 5 X IO5 1. OX IO5的浓度接种到经步骤a处理后的培养皿中。
全文摘要
本发明公开了一种人脐带间充质细胞的分离和培养方法，该方法采用胶原酶IV和胰酶对人脐带活组织进行消化处理，并将分离得到的人脐带间充质细胞接种于预先用明胶包被的培养皿中进行扩增。本发明所述的分离培养方法具有操作简单、易于推广等优点，能够方便地获取低免疫源性的人脐带间充质细胞。
文档编号C12N5/077GK102321575SQ20111030090
公开日2012年1月18日 申请日期2011年10月8日 优先权日2011年10月8日
发明者卢海, 高毅 申请人:南方医科大学珠江医院