专利名称：一种fgfr3基因突变检测特异性引物和液相芯片的利记博彩app
—种FGFR3基因突变检测特异性引物和液相芯片技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种FGFR3基因突变检测特异性引物和液相芯片。
背景技术：
成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors, FGFs)是一组结构相似的多肽类家族，并通过跨膜高亲和力的成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptors, FGFRs)发挥作用。成纤维细胞生长因子受体3 (Fibroblast growth factor receptors 3,FGFR3)是一种酪氨酸激酶受体,它在细胞有丝分裂的发生、促进血管新生、伤口愈合及肿瘤形成中起重要作用。FGFR3属于跨膜蛋白质，当受体细胞外段与配体FGFs结合后，受体形成同源或异源二聚体，使细胞内段的酪氨酸激酶活化，在细胞内引起一系列级联反应，最终导致DNA合成和细胞分裂。FGFR3可以同时启动Ras-MAPK介导的丝裂原信号转导途径和对细胞生长起抑制作用的STAT信号转导途径，在正常发育时，细胞在两条信号系统的作用下生长和分化，FGFR3突变时，受体的功能异常活化，从而破坏了组织的正常生长和发育。有研究表明，FGFR3基因突变与肿瘤的形成有关。
目前，对FGFR3基因突变进行检测和分析的方法很少，主要有直接测序法和 PCR-RFLP分析法，其中最常用的方法有PCR-RFLP分析法。PCR-RFLP法是基于基因突变造成的限制性内切酶识别位点的改变，如位点丢失或产生新位点，通过PCR扩增某一特定片段，再用限制性内切酶酶切扩增产物，电泳观察片段的大小，这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变，可直接判断基因型，但该法不能用于没有产生新酶切位点的基因突变检测。 再次，以上这些方法都存在着检测通量的局限性，每次只能检测一种突变类型，不能满足实际应用的需要。发明内容
本发明的目的之一是提供FGFR3基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于单独或并行检测 FGFR3 基因 12 种常见基因型 R248C、G370C、S371C、Y373C、G380R、A391E、D641N、 K650Q/E/T/M、G697C的野生型和突变型。
实现上述目的的技术方案如下
一种FGFR3基因突变检测液相芯片，包括有
(A).针对FGFR3基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为针对R248C位点的SEQ ID NO. 22及SEQ ID NO. 23 ;针对G370C位点的 SEQ ID NO. 24 及 SEQ ID NO. 25 ;针对 S371C 位点的 SEQ ID NO. 26 及 SEQ ID NO. 27 ;针对 Y373C 位点的 SEQID NO. 28 及 SEQ ID NO. 29 ;针对 G380R 位点的 SEQ ID NO. 30 及 SEQ ID NO. 31 ;针对 A391E 位点 的 SEQ ID NO. 32 及 SEQ ID NO. 33 ;针对 D641N 位点的 SEQ ID NO. 34 及 SEQ ID NO. 35 ;针对 K650Q/E/T/M 位点的 SEQ ID NO. 36 以及选自 SEQ ID NO. 37、SEQ ID NO. 38、SEQ IDN0. 39、SEQ ID NO. 40 中的一种以上；和 / 或针对 G697C 位点的 SEQ ID NO. 41 及 SEQ ID NO. 42，所述 tag 序列选自 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO. 21 ；
(B).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID NO. 43 SEQ ID NO. 63， 且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；
(C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
优选地，所述扩增引物为针对R248C位点的SEQ ID NO. 64及SEQ ID NO. 65 ;针对 G370C、S371C、Y373C、G380R、A391E 位点的 SEQ ID NO. 66 及 SEQ ID NO. 67 ;针对 D641N、 K650Q/E/T/M位点的 SEQ ID NO. 68及 SEQ ID NO. 69 ;和/或针对G697C位点的 SEQ ID NO. 70 及 SEQ ID NO. 71。
优选地，所述ASPE弓丨物为针对R248C位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 22组成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 23组成的序列；针对G370C位点的由SEQ ID NO. 3 和SEQ IDN0. 24组成的序列及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 25组成的序列；针对S371C位点的由SEQ IDN0. 5和SEQ ID NO. 26组成的序列及由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 27组成的序列；针对Y373C位点的由SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 28组成的序列及由SEQ ID NO. 8 和SEQ ID NO. 29组成的序列；针对G380R位点的由SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 30组成的序列及由SEQ ID NO. 10和SEQID NO. 31组成的序列；针对A391E位点的由SEQ ID NO. 11 和SEQ ID NO. 32组成的序列及由SEQID NO. 12和SEQ ID NO. 33组成的序列；针对D641N 位点的由 SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 34 组成的序列及由 SEQ ID NO. 14 和 SEQ ID NO. 35 组成的序列；针对K650Q/E/T/M位点的由SEQ IDN0. 15和SEQ ID NO. 36组成的序列以及选自由 SEQ ID NO. 16 和 SEQ ID NO. 37 组成的序列、由 SEQ ID NO. 17 和 SEQ ID NO. 38 组成的序列、由 SEQ ID NO. 18 和 SEQ ID NO. 39 组成的序列、由 SEQ ID NO. 19 和 SEQ ID NO. 40 组成的序列中的一种以上；和/或针对G697C位点的由SEQ IDN0. 20和SEQ ID NO. 41组成的序列及由SEQ ID NO. 21和SEQ ID NO. 42组成的序列。
本发明的另一目的是提供用于FGFR3基因突变检测的特异性引物。
实现上述目的的技术方案如下
所述特异性引物序列为针对R248C位点的SEQ ID NO. 22及SEQ ID NO. 23 ;针对 G370C 位点的 SEQ ID NO. 24 及 SEQ ID NO. 25 ;针对 S371C 位点的 SEQ ID NO. 26 及 SEQ ID NO. 27 ;针对 Y373C 位点的 SEQ ID NO. 28 及 SEQ ID NO. 29 ;针对 G380R 位点的 SEQ ID NO. 30 及 SEQ IDN0. 31 ;针对 A391E 位点的 SEQ ID NO. 32 及 SEQ ID NO. 33 ;针对 D641N位点的 SEQ ID NO. 34 及 SEQ ID NO. 35 ;针对 K650Q/E/T/M 位点的 SEQ ID NO. 36 以及选自 SEQ ID NO. 37,SEQ IDN0. 38,SEQ ID NO. 39、SEQ ID NO. 40 中的一种以上；和 / 或针对 G697C 位点的 SEQ ID NO. 41 及 SEQ ID NO. 42。
本发明的主要 优点在于
1.本发明所提供的FGFR3基因突变检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100%，所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的FGFR3基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及 ant1-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、ant1-tag标签序列的选取以及 tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。
2.本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3% ;除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的突变情况，检测效果一致。
3.本发明的检测方法步骤简单，12种突变位点检测可通过一步PCR即可完成四条含有突变位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。
4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷， 同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施方式
实施例1
本实施例所述的FGFR3基因突变检测液相芯片，主要包括有
一、ASPE 引物
针对FGFR3 基因 12 种常见基因型 R248C、G370C、S371C、Y373C、G380R、A391E、 D641N、K650Q/E/T/M、G697C的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由 “ tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE弓I物序列如下表所示
表1FGFR3基因的ASPE弓丨物序列(tag序列+特异性引物序列)
权利要求
1.一种FGFR3基因突变检测液相芯片，其特征是，包括有 (A).针对FGFR3基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为针对R248C位点的SEQ ID NO. 22及SEQ ID NO. 23 ;针对G370C位点的 SEQ ID NO. 24 及 SEQ ID NO. 25 ;针对 S371C 位点的 SEQ ID NO. 26 及 SEQ ID NO. 27 ;针对 Y373C 位点的 SEQID NO. 28 及 SEQ ID NO. 29 ;针对 G380R 位点的 SEQ ID NO. 30 及 SEQID NO. 31 ;针对 A391E 位点的 SEQ ID NO. 32 及 SEQ ID NO. 33 ;针对 D641N 位点的 SEQ IDNO. 34 及 SEQ ID NO. 35 ;针对 K650Q/E/T/M 位点的 SEQ ID NO. 36 以及选自 SEQ ID NO. 37、SEQ ID NO. 38、SEQ IDNO. 39、SEQ ID NO. 40 中的一种以上；和 / 或针对 G697C 位点的 SEQID NO. 41 及 SEQ ID NO. 42，所述 tag 序列选自 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO. 21 ； (B).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID NO. 43 SEQ ID NO. 63，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对； (C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
2.根据权利要求1所述的FGFR3基因突变检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为针对 R248C位点的 SEQ ID NO. 64 及 SEQ ID NO. 65 ;针对G370C、S371C、Y373C、G380R、A391E位点的 SEQ ID NO. 66 及 SEQ ID NO. 67 ;针对 D641N、K650Q/E/T/M 位点的 SEQ ID NO. 68 及SEQ ID NO. 69 ;和 / 或针对 G697C 位点的 SEQ ID NO. 70 及 SEQ ID NO. 71。
3.根据权利要求1所述的FGFR3基因突变检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物为针对R248C位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 22组成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQID NO. 23组成的序列；针对G370C位点的由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 24组成的序列及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 25组成的序列；针对S371C位点的由SEQ ID NO. 5和SEQ IDNO. 26组成的序列及由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 27组成的序列；针对Y373C位点的由SEQ ID NO. 7和SEQ IDNO. 28组成的序列及由SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 29组成的序列；针对G380R位点的由SEQ IDNO. 9和SEQ ID NO. 30组成的序列及由SEQ ID NO. 10和SEQID NO. 31组成的序列；针对A391E位点的由SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 32组成的序列及由SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 33组成的序列；针对D641N位点的由SEQ ID NO. 13和SEQID NO. 34组成的序列及由SEQ ID NO. 14和SEQ ID NO. 35组成的序列；针对K650Q/E/T/M位点的由SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 36组成的序列以及选自由SEQ ID NO. 16和SEQ IDNO. 37组成的序列、由SEQ ID NO. 17和SEQ IDNO. 38组成的序列、由SEQ ID NO. 18和SEQID NO. 39组成的序列、由SEQ ID NO. 19和SEQ IDNO. 40组成的序列中的一种以上；和/或针对G697C位点的由SEQ ID NO. 20和SEQ ID NO. 41组成的序列及由SEQ ID NO. 21和SEQID NO. 42组成的序列。
4.根据权利要求1所述的FGFR3基因突变检测液相芯片，其特征是， (A).所述ASPE引物为针对R248C位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 22组成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 23组成的序列；针对G370C位点的由SEQ ID NO. 3和SEQ IDNO. 24组成的序列及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 25组成的序列；针对S371C位点的由SEQID NO. 5和SEQ ID NO. 26组成的序列及由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 27组成的序列；针对Y373C位点的由SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 28组成的序列及由SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 29组成的序列；针对G380R位点的由SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 30组成的序列及由SEQ IDNO. 10和SEQ ID NO. 31组成的序列；针对A391E位点的由SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 32组成的序列及由SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 33组成的序列；针对D641N位点的由 SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 34 组成的序列及由 SEQ ID NO. 14 和 SEQ ID NO. 35 组成的序列；针对K650Q/E/T/M位点的由SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 36组成的序列以及由SEQ ID NO. 16 和 SEQ IDNO. 37 组成的序列、由 SEQ ID NO. 17 和 SEQ ID NO. 38 组成的序列、由SEQ ID NO. 18和SEQ IDNO. 39组成的序列和由SEQ ID NO. 19和SEQ ID NO. 40组成的序列；和针对G697C位点的由SEQ ID NO. 20和SEQ ID NO. 41组成的序列及由SEQ ID NO. 21和SEQ ID NO. 42组成的序列； (B).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID NO. 43 SEQ ID NO. 63，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对； (C).所述扩增引物为:针对R248C位点的SEQID NO. 64及SEQ ID NO. 65 ;针对G370C、S371C、Y373C、G380R、A391E 位点的 SEQ ID NO. 66 及 SEQ ID NO. 67 ;针对 D641N、K650Q/E/T/M 位点的 SEQ ID NO. 68 及 SEQ ID NO. 69 ;和针对 G697C 位点的 SEQ ID NO. 70 及 SEQIDNO. 71。
5.根据权利要求1-4任一项所述的FGFR3基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂为5-10个T。
6.用于FGFR3基因突变检测的特异性引物，其特征是，所述特异性引物序列为针对R248C 位点的 SEQ ID NO. 22 及 SEQ ID NO. 23 ;针对 G370C 位点的 SEQ ID NO. 24 及 SEQ IDNO. 25 ;针对S371C位点的SEQ ID NO. 26及SEQ ID NO. 27 ;针对Y373C位点的SEQ ID NO. 28及 SEQ IDNO. 29 ;针对 G380R 位点的 SEQ ID NO. 30 及 SEQ ID NO. 31 ;针对 A391E 位点的SEQ ID NO. 32 及 SEQ ID NO. 33 ;针对 D641N 位点的 SEQ ID NO. 34 及 SEQ ID NO. 35 ;针对K650Q/E/T/M位点的 SEQ ID NO. 36 以及选自 SEQ ID NO. 37,SEQ ID NO. 38,SEQ ID NO. 39、SEQ ID NO. 40中的一种以上；和/或针对G697C位点的SEQ ID NO. 41及SEQ ID NO. 42。
全文摘要
本发明公开了一种FGFR3基因检测特异性引物和液相芯片，该液相芯片主要包括有每种由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成的ASPE引物，所述特异性引物序列为SEQ ID NO.22及SEQ ID NO.23；SEQ ID NO.24及SEQ ID NO.25；SEQ ID NO.26及SEQ ID NO.27；SEQ ID NO.28及SEQ ID NO.29；SEQ ID NO.30及SEQ IDNO.31；SEQ ID NO.32及SEQ ID NO.33；SEQ ID NO.34及SEQ ID NO.35；SEQ ID NO.36以及选自SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40中的一种以上；和/或SEQ ID NO.41及SEQ ID NO.42；有anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，实现多个突变位点的野生型和突变型并行检测。
文档编号C12Q1/68GK103031364SQ20111029959
公开日2013年4月10日 申请日期2011年9月30日 优先权日2011年9月30日
发明者许嘉森, 刘志明 申请人:广州益善生物技术有限公司