专利名称：一种大肠埃希杆菌o157∶h7基因组dna作为pcr标准物质的制备方法
技术领域：
一种大肠埃希杆菌0157 H7基因组DNA作为PCR标准物质的制备方法，属于生物学技术领域。
背景技术：
大肠埃希杆菌0157 H7广泛存在于自然界中，是一种重要的人畜共患病致病菌， 人被感染后常引起严重腹泻和败血症，严重的可引起溶血性尿毒综合征(HUQ、血栓形成性血小板减少性紫癜(TTP)，其中并发HUS和TTP者死亡率高达80%左右，因此，如何控制大肠埃希杆菌0157 H7的感染是目前公共卫生学中的重要课题，对大肠埃希杆菌0157 H7 的快速、准确检验是保证人类健康的必要手段。传统的检测细菌的方法包括了生化培养、分离鉴定，检验程序复杂繁琐，报告检验结果大致需4 7d，耗时太长，而且检测灵敏度低。随着分子生物学的发展，PCR技术已广泛应用于食品微生物、动植物疫病、饲料成分及转基因成分的检测领域，使食源性致病菌的快速检验发展到一个崭新的高度。本发明提供一种大肠埃希杆菌0157 H7 PCR检测中阳性标准物质的制备方法，使PCR的检测结果更加确凿。
发明内容
本发明的目的是提供一种提取纯化大肠埃希杆菌0157 H7基因组DNA作为PCR 标准物质的制备方法，以便使PCR样品的检测结果更加准确。本发明的技术方案一种提取纯化大肠埃希杆菌0157 H7基因组DNA作为PCR 标准物质的制备方法，利用羧基化的磁性纳米粒子提取了大肠埃希杆菌0157:H7基因组 DNA ；大肠埃希杆菌0157 H7已为下列文献公开，文献1 [Food Microbiology 23 (2006) 162 - 168. The use of Fourier transform infrared spectroscopy to differentiate Escherichia coli 0157:H7 from other bacteria inoculated into apple juice ；Murad A. Al-Holya, Mengshi Linb, Anna G. Cavinatoc, Barbara A. Rascob]；
文献2: [Food Research International 39 (2006) 98 - 105. Inactivation of food spoilage bacteria and Escherichia coli 0157:H7 in phosphate buffer and orange juice using dynamic high pressure ；Imane Tahiri, Joseph Makhlouf 氺，Paul Paquin, Ismail Fliss].
(1)大肠埃希杆菌0157 H7的培养
按传统培养方法对大肠埃希杆菌0157 H7进行增菌培养；
(2)表面羧基化的磁性纳米粒子的制备
制备羧基修饰的磁性纳米粒子，用于吸附大肠埃希杆菌0157 H7基因组DNA;
(3)病原微生物大肠埃希杆菌0157 H7基因组DNA的提取；(4)用步骤(2)得到的大肠埃希杆菌0157 H7基因组DNA过kphadex G-200分离柱进行分离纯化；
(5)用步骤(4)得到的纯化后的大肠埃希杆菌0157 H7基因组DNA测定ICP-MS计算浓度；
(6)将步骤(4)纯化后的DNA的PCR扩增产物进行PCR检测，琼脂糖电泳检测大肠埃希杆菌0157 H7的目的条带。各步骤的操作详见具体实施例。本发明的有益效果本发明采用羧基化的磁性纳米粒子提取了大肠埃希杆菌 0157 :H7基因组DNA，并进行分离纯化，电感耦合等离子体质谱ICP-MS测定P元素以确定提取DNA浓度，最终进行PCR扩增，电泳检测目的条带明显，-20°C保存半年性质不变，稳定性高，可以作为大肠埃希杆菌0157 H7基因组DNA的PCR标准物质，以便使PCR样品的检测结果更加准确。
图1 :S印hadex G-200分离纯化图。图2 基因组DNA样品琼脂糖凝胶电泳图。图3 基因组DNA样品-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本发明。实施例1.大肠埃希杆菌0157 H7基因组DNA进行粗提； (1)大肠埃希杆菌0157 H7的增菌培养
将大肠埃希杆菌0157 H7菌株，即ATCC 35150，接种在山梨醇麦康凯SMAC平板上， 37°C培养10h，再接一环接种于IOmL改良E. C新生霉素增菌肉汤，于37°C培养10h。(2)磁纳米粒子的制备
取0. 65g !^eCl3,0.4g柠檬酸三钠，20mL乙二醇，搅拌反应lOmin。t取1. 2g醋酸钠加入上述溶液中，搅拌反应20min，再将上述溶液在230°C下搅拌反应10h。直向上述溶液中加入20mL无水乙醇，超声lOmin，6000rpm离心lOmin，去上清。向上述沉淀中加入20mL去离子水，超声lOmin，6000rpm离心lOmin，去上清。f:向上述沉淀中加入5mL去离子水，得到粒径为350nm的表面羧基化的磁性纳米粒子。(3)大肠埃希杆菌0157 H7基因组DNA的提取 ,取大肠埃希杆菌0157 Η7改良Ε. C新生霉素增菌肉汤培养液lmL，IOOOOrpm离心 5min，去除上清。；！将.中沉淀用 ImL TE 缓冲液溶解(50mM Tris-Hcl, IOmM EDTA, pH8. 0)，加入 ΙΟΟμ 10%SDSof向上述溶液中加入20μ (2)中制备的磁纳米粒子。向上述溶液中加入370μ 30% (w/v) PEG6000的6mol/L NaCl混合液，室温下反应15min。f将上述溶液放入磁力架中，去除上清。⑥向上述磁粒子中加入ImL 70%乙醇洗涤。⑦将上述溶液放入磁力架中，去除上清。⑧向上述磁粒子中加入IOOPL TE缓冲液溶解(IOmOTris-HCl，ImM EDTA, pH8. 0)， 65°C反应 lOmin。⑨将上述溶液放入磁力架中，取上清，为粗提取的大肠埃希杆菌0157 H7基因组 DNA。实施例2. S印hadex G-200分离柱进行分离纯化分离柱:Sephadex G-200 ；
流动相TE 缓冲液(IOmM Tris-HCl, ImM EDTA, pH8. 0)； 流速:0. 5mL/min ；
检测器紫外检测器(发射波长260nm)； 上样量提取DNA样品ImL ；
从6. 5mL处的样品开始收集分离峰，得到的为纯化后的大肠埃希杆菌0157 H7基因组 DNA。实施例3.大肠埃希杆菌0157 H7基因组通过ICP-MS测定P元素浓度来测定 DNA浓度
1)将实施例2中获得的DNA样品，用纯水在4°C中进行透析48h，去除样品中的小分子。2)准确量取4mL步骤1)中透析好的样品于微波消解管中，加浓硝酸6mL，盖好盖子，室温放置过夜，第二天早上放于微波消解仪中消解。待消解完成后放入通风橱中排酸， 然后将消化液转移入50mL塑料离心管中，定容至25mL，混勻，然后定重，待测。消解程序如下(表1):
表1样品消解程序
权利要求
1.一种提取纯化大肠埃希杆菌0157 H7基因组DNA作为PCR标准物质的制备方法， 其特征在于利用羧基化的磁性纳米粒子提取了大肠埃希杆菌0157:H7基因组DNA ；工艺步骤为(1)大肠埃希杆菌0157 H7的培养按传统培养方法对大肠埃希杆菌0157 H7进行增菌培养；(2)表面羧基化的磁性纳米粒子的制备制备羧基修饰的磁性纳米粒子，用于吸附大肠埃希杆菌0157 H7基因组DNA;(3)病原微生物大肠埃希杆菌0157 H7基因组DNA的提取；(4)用步骤(2)得到的大肠埃希杆菌0157 H7基因组DNA过kphadex G-200分离柱进行分离纯化；(5)用步骤(4)得到的纯化后的大肠埃希杆菌0157 H7基因组DNA测定ICP-MS计算浓度；(6)将步骤(4)纯化后的DNA的PCR扩增产物进行PCR检测，琼脂糖电泳检测大肠埃希杆菌0157 H7的目的条带。
2.根据权利要求1所述的提取纯化大肠埃希杆菌0157 H7基因组DNA作为PCR标准物质的制备方法，其特征在于大肠埃希杆菌0157 H7的增菌培养大肠埃希杆菌0157 H7 JPATCC 35150，接种在山梨醇麦康凯SMAC平板上，37°C培养 IOh,再接一环接种于IOmL改良E. C新生霉素增菌肉汤，于37°C培养10h。
3.根据权利要求1所述的提取纯化大肠埃希杆菌0157 H7基因组DNA作为PCR标准物质的制备方法，其特征在于表面羧基化的磁性纳米粒子的制备①取0.65g FeCl3,0.4g柠檬酸三钠，20mL乙二醇，搅拌反应IOmin ；②取1.2g醋酸钠加入①所得溶液中，搅拌反应20min ；再在230°C下搅拌反应IOh ；③向②所得溶液中加入20mL无水乙醇，超声10min，6000rpm离心lOmin，去上清；④向③所得沉淀中加入20mL去离子水，超声10min，6000rpm离心lOmin，去上清；⑤向上述步骤④所得沉淀中加入5mL去离子水，得到粒径为350nm的表面羧基化的磁性纳米粒子。
4.根据权利要求1所述的提取纯化大肠埃希杆菌0157 H7基因组DNA作为PCR标准物质的制备方法，其特征在于大肠埃希杆菌0157 H7基因组DNA的提取①取大肠埃希杆菌0157 H7改良E. C新生霉素增菌肉汤培养液lmL，IOOOOrpm离心 5min，去除上清；②将①中沉淀用ImLTE缓冲液溶解，加入IOOPL 10%SDS ；所述TE缓冲液为pH 8. 0含 IOmM EDTA 的 50mM Tris-HCl 缓冲液；③向②所得溶液中加入20μ 权利要求1步骤(2)或权利要求3中制备的表面羧基化的磁性纳米粒子；④向③所得溶液中加入370μ w/v 30% PEG 6000的6mol/L NaCl混合液，室温反应 15min ；⑤将④所得溶液放入磁力架中，去除上清；⑥向⑤所得磁粒子中加入ImL质量浓度70%乙醇；⑦将⑥所得溶液放入磁力架中，去除上清；⑧向⑦所得磁粒子中加入IOOPLTE缓冲液溶解，65°C反应lOmin，所述TE缓冲液为 pH8. 0 含 ImM EDTA 的 IOmM Tris-HCl 缓冲液；⑨将⑧所得溶液放入磁力架中，取上清，为粗提取的大肠埃希杆菌0157 H7基因组DNA。
5.根据权利要求1所述的提取纯化大肠埃希杆菌0157 H7基因组DNA作为PCR标准物质的制备方法，其特征在于采用kphadex G-200分离柱进行分离纯化 分离柱Sephadex G-200 ；流动相=TE缓冲液为ρΗ8· 0含ImM EDTA的IOmM Tris-HCl缓冲液； 流速:0. 5mL/min ；检测器紫外检测器，发射波长260nm ； 上样量提取DNA样品ImL;从6. 5mL处的样品开始收集分离峰，得到的为纯化后的大肠埃希杆菌0157 H7基因组 DNA。
全文摘要
一种大肠埃希杆菌O157∶H7基因组DNA作为PCR标准物质的制备方法，属于生物学技术领域。本发明采用羧基化的磁性纳米粒子提取了大肠埃希杆菌O157:H7基因组DNA，并进行分离纯化，电感耦合等离子体质谱ICP-MS测定P元素以确定提取DNA浓度，最终进行PCR扩增，电泳检测目的条带明显，-20℃保存半年性质不变，稳定性高，可以作为大肠埃希杆菌O157∶H7基因组DNA的PCR标准物质。
文档编号C12R1/19GK102399774SQ20111028274
公开日2012年4月4日 申请日期2011年9月22日 优先权日2011年9月22日
发明者勇倩倩, 王利兵, 胥传来 申请人:勇倩倩, 王利兵, 胥传来