从烟草克隆细胞色素p450基因的利记博彩app

专利名称：从烟草克隆细胞色素p450基因的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及从烟草克隆细胞色素P450基因。具体而言，本发明涉及在烟草 (Nicotiana)植物中编码细胞色素P450酶(下文称为P450和P450酶)的核酸序列和使用那些核酸序列来改变植物表型的方法。
背景技术：
细胞色素P450催化各种化学上不同的底物的酶反应，包括内源性和异源底物的氧化、过氧化和还原性代谢。在植物中，P450参与包括植物产物合成在内的生化途径，所述产物例如是苯丙素(phenylpropanoids)、生物碱、萜类、脂质、生氰糖苷(cyanogenic glycoside)禾口葡糖异硫氰酸盐(glucosinolates) (Chappe 1, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 198，49 =311-343)。细胞色素p450也称为血红素-硫醇盐蛋白 (heme-thiolate protein)，通常用作多组分电子转移链(称为含p450的单加氧酶系统) 中的末端氧化酶。所催化的特定反应包括脱甲基化、羟基化、环氧化、N-氧化、磺基氧化 (sulfooxidation)、N_、S_和0-脱烷基化、脱硫作用、脱氨基作用和偶氮基、硝基和N-氧化物基团的还原。烟草植物p450酶的各种作用涉及产生各种植物代谢物，例如苯丙素、生物碱、萜类、脂质、生氰糖苷、葡糖异硫氰酸盐和其它化学物质的宿主。近年来，人们开始了解一些 P450酶影响植物中植物代谢物的组成。例如，长期以来人们希望通过育种改变植物的所选脂肪酸的特性来改善特定植物的风味和香味；然而涉及控制这些叶子组成的水平的机理知之甚少。下调与改变脂肪酸有关的P450酶可有助于积累提供更适宜的叶子表型质量的所需脂肪酸。P450酶的功能及其在植物组成中广泛的作用仍有待发现。例如，特定类型的 P450酶发现可催化脂肪酸分解为挥发性C6-和C9-醛和醇，而主要是这些物质导致水果和蔬菜具有“新鲜翠绿”的气味。可改变其它作为新目标的P450酶的水平，通过改变烟草叶子中的脂质组成和相关的降解代谢物来提高叶子组成的质量。叶子中的几种这些成分受老化的影响，而老化刺激叶子质量特性的成熟。其它人也报道P450酶在改变涉及植物病原体相互作用和疾病抗性的脂肪酸中起作用。在其它例子中，已提示p450酶涉及生物碱的生物合成。降烟碱是在烟草 (Nicotiana tabaceum)中发现的少量生物碱。推测它是这样产生的p450介导的尼古丁脱甲基化，然后在N位酰化和亚硝基化，从而产生一系列N-酰基降烟碱(N-acylnonicotine) 和N-亚硝基降烟碱。推测的p450脱甲基酶催化的N-脱甲基化被认为是烟草中降烟碱生物合成的主要来源。尽管认为该酶是微粒体酶，但是迄今为止未能成功地纯化尼古丁脱甲基化酶，也未能分离到有关基因。
此外，有假说认为(但未证实)p450酶的活性受遗传控制并且也强烈地受环境因素的影响。例如，当植物达到成熟阶段后，认为烟草中尼古丁的脱甲基化作用大大增加。另外，有假说认为(还未证实)脱甲基化基因含有当存在时能抑制RNA翻译的转座元件。在本发明之前，p450酶形式的多样性、其结构和功能的不同使得对烟草p450酶的研究十分困难。此外，对P450酶的克隆至少部分由于这些膜定位的蛋白通常存在量低且经常在纯化中不稳定而受阻。因此，需要在植物中鉴定P450酶和与那些p450酶相关的核酸序列。特别是，在烟草中仅有少许细胞色素P450蛋白已见报道。本文所述的发明发现了许多细胞色素P450片段，这些片段基于它们的序列同一性而对应于几组p450种类。

发明内容
本发明针对植物p450酶。本发明还涉及来自烟草的植物p450酶。本发明也涉及其表达由乙烯和/和植物老化诱导的植物中的P450酶。本发明还涉及植物中具有酶活性的核酸序列，例如可分类为氧化酶、脱甲基酶等和其它酶，以及使用那些序列来使这些酶的表达降低和沉默和过度表达。本发明也涉及在含有较高降烟碱水平的植物而非显示较低降烟碱水平的植物中发现的P450酶。本发明一方面涉及以下所示的核酸序列:SEQ. ID. NO. 1、3、5、7、9、11、13、15、17、 19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、 69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、 117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、143、145、147、149、151、153、155、 157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、 195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、 233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、 271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、 309、311、313 和 315。在第2个相关的方面，根据它们在细胞色素p450基序GXRXCX (G/A)后的第一核酸到终止密码子的对应区域的同一性，对那些含有大于75%的核酸序列同一性的片段进行分组。代表性的核酸组和各自的种类示于表I。在第3方面，本发明涉及如以下所示的氨基酸序列:SEQ. ID. NO. 2、4、6、8、10、12、 14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、 64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、96、98、100、102、104、106、108、110、 112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、144、146、148、150、 152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、 190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、 228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、 266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、 304、306、308、310、312、314 和 316。在第4个相关的方面，根据它们在细胞色素p450基序GXRXCX (G/A)后的第一核酸到终止密码子的对应区域的同一性，对那些含有大于71 %的核酸序列同一性的片段进行分组。代表性的氨基酸组和各自的种类示于表II。
4
在第5个方面，本发明涉及如以下所示全长基因的氨基酸序列SEQ. ID. NO. 150、 152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、 190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、 228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、 266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、 304、306、308、310、312、314 和 316。在第6个相关的方面，根据彼此的同一性对那些含有大于85%和更高的氨基酸序列同一性的全长基因进行分组。代表性的氨基酸组和各自的种类示于表III。在第7个方面，本发明涉及如SEQ. ID. NO. 299-357所示片段的氨基酸序列。在第8个相关的方面，根据它们在第一细胞色素p450结构域UXXRXXZ到第3细胞色素结构域GXRXO的对应区域的互相同一性，对那些含有大于90%和更高的氨基酸序列同一性的片段进行分组，其中U是E或K，X是任何氨基酸，Z是R、T、S或M。代表性的氨基酸组和各自的种类示于表IV。在第9个相关的方面，p450酶在烟草植物中的减少或消除或过度表达可使用RNA 病毒系统瞬时实现。评价得到的转化或感染的植物的表型改变，包括(但不限于)使用本领域普通技术人员常规可用的技术来分析内源性P450RNA转录物、p450表达肽和植物代谢物的浓度。在第10个方面，本发明也涉及产生具有改变的p450酶活性水平的转基因烟草谱系。根据本发明，这些转基因谱系含有有效地特定酶表达减少、沉默或增加，从而在烟草中导致表型效应的核酸序列。这种核酸序列包括SEQ. ID. NO. 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、 23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、 73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、 119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、143、145、147、149、151、153、155、157、 159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、 197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、 235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、 273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、 311,313 和 315。在本发明非常重要的第11方面，与对照植物相比，含有本发明核酸的植物栽培品系在使用全长基因或其片段的下调能力或使用全长基因或其片段的过度表达能力上具有改变的代谢物特性。在本发明的第12方面，含有本发明核酸的植物栽培品系具有对特定外源性化学物质或植物害虫耐受的用途，所述植物使用全长基因或其片段以更改来源于植物或植物以外的代谢物的生物合成或降解。这种核酸序列包括SEQ. ID. NO. 1、3、5、7、9、11、13、15、17、 19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、 69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、 117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、143、145、147、149、151、153、155、 157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、 195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、 271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、 309、311、313 和 315。在第13个方面，本发明涉及筛选含有与所述核酸序列具有实质性核酸同一性的基因的植物，优选烟草。使用本发明有利于鉴定和选择含有精确的或实质性同一性的核酸序列的植物，其中这种植物是传统或转基因品种的育种程序、诱变程序或天然存在的不同植物种群的一部分。可使用核酸探针结合核酸检测方法，包括(但不限于)核酸杂交和PCR 分析，通过评价植物的核酸物质来筛选实质性核酸同一性的植物。核酸探针可由对应于以下 SEQ ID 的所述核酸序列或其片段构成SEQ ID 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、 27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、 77、79、81、83、85、87、89、91、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、 123、125、127、129、131、133、135、137、139、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、 163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、 201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、 239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、 277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313 和 315。在第14个方面，本发明涉及鉴定与所述核酸序列具有实质性氨基酸同一性的植物基因，优选烟草。可使用核酸探针结合核酸检测方法，包括(但不限于)核酸杂交和PCR 分析，通过筛选植物cDNA文库来鉴定植物基因，包括cDNA和基因组克隆，优选烟草的cDNA 和基因组克隆。核酸探针可由对应于以下SEQ ID的核酸序列或其片段构成1、3、5、7、9、
II、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、 61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、95、97、99、101、103、105、107、109、
III、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、143、145和 147。在其它第15个方面，可使用针对部分或全部所述氨基酸序列的抗体来筛选表达肽的cDNA表达文库。这种氨基酸序列包括SEQ ID 2、4、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、 26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、 76、78、80、82、84、86、88、90、92、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、 122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、144、146、148。在第16个重要的方面，本发明也涉及产生过度表达p450酶活性水平的转基因烟草谱系。根据本发明，这些转基因谱系包括编码全长基因的氨基酸序列的所有核酸序列，所述基因有效地增加特定酶的表达从而导致烟草中的表型效应。这种氨基酸序列包括SEQ. ID.150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、 186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、 224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、 262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、 300、302、304、306、308、310、312、314 和 316。也提供了含有降烟碱含量降低的烟叶(叶片和/或茎)的烟草产品。该烟草产品包括烟草(含有叶片和/或茎的烟叶)，该烟草来自含有本文所述序列或消除或抑制了编码烟草特异性亚硝基胺的基因的植物。与用未消除或抑制编码烟草特异性亚硝基胺的基因的烟草植物制备的烟草产品相比，消除或抑制编码烟草特异性亚硝基胺的基因有效地降低了烟草产品中约5-10%、或者约10-20%、或者约20-30%、或者30%以上的烟草特异性亚硝基胺。本文使用的烟草产品可包括香烟、雪茄、烟丝、鼻烟、口嚼烟(chewing tobacco)、混合了烟草产品的产品和它们的混合物。本发明涉及如下各项1. 一种分离的烟草核酸分子，该核酸分子含有选自SEQ. ID. No. :299-357的核酸序列。2. 一种转基因植物，该转基因植物含有如项1所述的核酸分子。3.如项2所述的转基因植物，其特征在于，所述植物是烟草植物。4. 一种产生转基因植物的方法，该方法包括以下步骤(i)将如项1所述的核酸分子与在所述植物中具有功能的启动子操作性相连以产生植物转化载体；(ii)用步骤的所述植物转化载体转化所述植物；(iii)选择用所述转化载体转化的植物细胞；和(iv)从所述转化的植物细胞再生转化植物。5.如项4所述的方法，其特征在于，所述核酸分子处于反义方向。6.如项4所述的方法，其特征在于，所述核酸分子处于有义方向。7.如项4所述的方法，其特征在于，所述核酸分子处于RNA干扰方向。8.如项4所述的方法，其特征在于，所述核酸分子表达为双链RNA分子。9.如项4所述的方法，其特征在于，所述双链RNA分子长度为约15-25个核苷酸。10.如项4所述的方法，其特征在于，所述转基因植物是烟草植物。11. 一种选择含有核酸分子的植物的方法，其中分析所述植物中是否存在选自 299-357的核酸序列。12.如项11所述选择植物的方法，其特征在于，通过DNA杂交分析所述植物。13.如项11所述选择植物的方法，其特征在于，所述DNA杂交是Southern印迹分析。14.如项11所述选择植物的方法，其特征在于，所述DNA杂交是Northern印迹分析。15.如项11所述选择植物的方法，其特征在于，通过PCR检测分析所述植物。16.如项11所述选择植物的方法，其特征在于，所述植物是烟草植物。17. 一种增加或降低植物中降烟碱水平的方法，所述方法包括以下步骤(i)将如项1所述的核酸分子与在所述植物中具有功能的启动子操作性相连以产生植物转化载体；(ii)用步骤(i)所述植物转化载体转化所述植物；(iii)选择用所述转化载体转化的植物细胞；和(iv)从所述转化的植物细胞再生转化植物。18.如项17所述的方法，其特征在于，所述核酸分子处于反义方向。19.如项17所述的方法，其特征在于，所述核酸分子处于有义方向。20.如项17所述的方法，其特征在于，所述核酸分子处于RNA干扰方向。
21.如项17所述的方法，其特征在于，所述核酸分子表达为双链RNA分子t
22.如项17所述的方法，其特征在于，所述转基因植物是烟草植物。 附图简述


图1显示核酸SEQ. ID. No. 图2显示核酸SEQ. ID. No. 图3显示核酸SEQ. ID. No. 图4显示核酸SEQ. ID. No. 图5显示核酸SEQ. ID. No. 图6显示核酸SEQ. ID. No. 图7显示核酸SEQ. ID. No. 图8显示核酸SEQ. ID. No.
1和氨基酸SEQ. ID. No. 3和氨基酸SEQ. ID. No. 5和氨基酸SEQ. ID. No. 7和氨基酸SEQ. ID. No. 9和氨基酸SEQ. ID. No. 11和氨基酸SEQ. ID. No. 13和氨基酸SEQ. ID. No. 15和氨基酸SEQ. ID. No.
2。 4。 6。 8。 10。 12c
14c
16c图9显示核酸SEQ. ID. No. :17 和氨基酸SEQ. ID. No. :18ο
图10显示核酉I SEQ.ID.No.19和氨基酉変 SEQ.ID.No.20。
图11显示核酉I SEQ.ID.No.21和氨基酉変 SEQ.ID.No.22。
图12显示核酉I SEQ.ID.No.23和氨基酉変 SEQ.ID.No.24。
图13显示核酉I SEQ.ID.No.25和氨基酉変 SEQ.ID.No.26。
图14显示核酉I SEQ.ID.No.27和氨基酉変 SEQ.ID.No.28。
图15显示核酉I SEQ.ID.No.29和氨基酉変 SEQ.ID.No.30。
图16显示核酉I SEQ.ID.No.31和氨基酉変 SEQ.ID.No.32。
图17显示核酉I SEQ.ID.No.33和氨基酉変 SEQ.ID.No.34。
图18显示核酉I SEQ.ID.No.35和氨基酉変 SEQ.ID.No.36。
图19显示核酉I SEQ.ID.No.37和氨基酉変 SEQ.ID.No.38。
图20显示核酉I SEQ.ID.No.39和氨基酉変 SEQ.ID.No.40。
图21显示核酉I SEQ.ID.No.41和氨基酉変 SEQ.ID.No.42。
图22显示核酉I SEQ.ID.No.43和氨基酉変 SEQ.ID.No.44。
图23显示核酉I SEQ.ID.No.45和氨基酉変 SEQ.ID.No.46。
图24显示核酉I SEQ.ID.No.47和氨基酉変 SEQ.ID.No.48。
图25显示核酉I SEQ.ID.No.49和氨基酉変 SEQ.ID.No.50。
图26显示核酉I SEQ.ID.No.51和氨基酉変 SEQ.ID.No.52。
图27显示核酉I SEQ.ID.No.53和氨基酉変 SEQ.ID.No.54。
图28显示核酉I SEQ.ID.No.55和氨基酉変 SEQ.ID.No.56。
图29显示核酉I SEQ.ID.No.57和氨基酉変 SEQ.ID.No.58。
图30显示核酉I SEQ.ID.No.59和氨基酉変 SEQ.ID.No.60。
图31显示核酉I SEQ.ID.No.61和氨基酉変 SEQ.ID.No.62。
图32显示核酉I SEQ.ID.No.63和氨基酉変 SEQ.ID.No.64。
图33显示核酉I SEQ.ID.No.65和氨基酉変 SEQ.ID.No.66。
图34显示核酉I SEQ.ID.No.67和氨基酉変 SEQ.ID.No.68。
图35显示核酉I SEQ.ID.No.69和氨基酉変 SEQ.ID.No.70。
图36显示核_I SEQ.ID.No.71和氨基酸SEQ. ID. No.72。
图37显示核_I SEQ.ID.No.:73和氨基酸SEQ. ID. No.74。
图38显示核_I SEQ.ID.No.:75和氨基酸SEQ. ID. No.76。
图39显示核_I SEQ.ID.No.:77和氨基酸SEQ. ID. No.78。
图40显示核_I SEQ.ID.No.79和氨基酸SEQ. ID. No.80。
图41显示核_I SEQ.ID.No.81和氨基酸SEQ. ID. No.82。
图42显示核_I SEQ.ID.No.83和氨基酸SEQ. ID. No.84。
图43显示核_I SEQ.ID.No.85和氨基酸SEQ. ID. No.86。
图44显示核_I SEQ.ID.No.87和氨基酸SEQ. ID. No.88。
图45显示核_I SEQ.ID.No.89和氨基酸SEQ. ID. No.90。
图46显示核_I SEQ.ID.No.91和氨基酸SEQ. ID. No.92。
图47显示核_I SEQ.ID.No.93和氨基酸SEQ. ID. No.94。
图48显示核_I SEQ.ID.No.95和氨基酸SEQ. ID. No.96。
图49显示核_I SEQ.ID.No.97和氨基酸SEQ. ID. No.98。
图50显示核_I SEQ.ID.No.99和氨基酸SEQ. ID. No.100。
图51显示核_I SEQ.ID.No.101和氨基·g SEQ. ID. No.:102o
图52显示核_I SEQ.ID.No.:103和氨基·g SEQ. ID. No.:104o
图53显示核_I SEQ.ID.No.:105和氨基·g SEQ. ID. No.:106o
图54显示核_I SEQ.ID.No.:107和氨基·g SEQ. ID. No.:108。
图55显示核_I SEQ.ID.No.109和氨基·g SEQ. ID. No.:110o
图56显示核_I SEQ.ID.No.:111和氨基·g SEQ. ID. No.:112。
图57显示核_I SEQ.ID.No.:113和氨基·g SEQ. ID. No.:114。
图58显示核_I SEQ.ID.No.:115和氨基·g SEQ. ID. No.:116o
图59显示核_I SEQ.ID.No.:117和氨基·g SEQ. ID. No.:118o
图60显示核_I SEQ.ID.No.:119和氨基·g SEQ. ID. No.:120o
图61显示核_I SEQ.ID.No.:121和氨基·g SEQ. ID. No.:122。
图62显示核_I SEQ.ID.No.:123和氨基·g SEQ. ID. No.:124o
图63显示核_I SEQ.ID.No.:125和氨基·g SEQ. ID. No.:126o
图64显示核_I SEQ.ID.No.:127和氨基·g SEQ. ID. No.:128o
图65显示核_I SEQ.ID.No.129和氨基·g SEQ. ID. No.:130o
图66显示核_I SEQ.ID.No.:131和氨基·g SEQ. ID. No.:132o
图67显示核_I SEQ.ID.No.:133和氨基·g SEQ. ID. No.:134o
图68显示核_I SEQ.ID.No.:135和氨基·g SEQ. ID. No.:136o
图69显示核_I SEQ.ID.No.:137和氨基·g SEQ. ID. No.:138o
图70显示核_I SEQ.ID.No.139和氨基·g SEQ. ID. No.:140o
图71显示核_I SEQ.ID.No.141和氨基·g SEQ. ID. No.:142o
图72显示核_I SEQ.ID.No.143和氨基·g SEQ. ID. No.:144。
图73显示核_I SEQ.ID.No.145和氨基·g SEQ. ID. No.:146o
图74显示核_I SEQ.ID.No.147和氨基·g SEQ. ID. No.:148o
图75显示核_I SEQ.ID.No.:149和氨基画g SEQ.ID.No.:150o
图76显示核_I SEQ.ID.No.:151和氨基画g SEQ.ID.No.:152o
图77显示核_I SEQ.ID.No.:153和氨基画g SEQ.ID.No.:154o
图78显示核_I SEQ.ID.No.:155和氨基画g SEQ.ID.No.:156o
图79显示核_I SEQ.ID.No.:157和氨基画g SEQ.ID.No.:158o
图80显示核_I SEQ.ID.No.:159和氨基画g SEQ.ID.No.:160o
图81显示核_I SEQ.ID.No.:161和氨基画g SEQ.ID.No.:162o
图82显示核_I SEQ.ID.No.:163和氨基画g SEQ.ID.No.:164o
图83显示核_I SEQ.ID.No.:165和氨基画g SEQ.ID.No.:166o
图84显示核_I SEQ.ID.No.:167和氨基画g SEQ.ID.No.:168o
图85显示核_I SEQ.ID.No.:169和氨基画g SEQ.ID.No.:170o
图86显示核_I SEQ.ID.No.:171和氨基画g SEQ.ID.No.:172o
图87显示核_I SEQ.ID.No.:173和氨基画g SEQ.ID.No.:174o
图88显示核_I SEQ.ID.No.:175和氨基画g SEQ.ID.No.:176o
图89显示核_I SEQ.ID.No.:177和氨基画g SEQ.ID.No.:178o
图90显示核_I SEQ.ID.No.:179和氨基画g SEQ.ID.No.:180o
图91显示核_I SEQ.ID.No.:181和氨基画g SEQ.ID.No.:182o
图92显示核_I SEQ.ID.No.:183和氨基画g SEQ.ID.No.:184o
图93显示核_I SEQ.ID.No.:185和氨基画g SEQ.ID.No.:186o
图94显示核_I SEQ.ID.No.:187和氨基画g SEQ.ID.No.:188o
图95显示核_I SEQ.ID.No.:189和氨基画g SEQ.ID.No.:190o
图96显示核_I SEQ.ID.No.:191和氨基画g SEQ.ID.No.:192o
图97显示核_I SEQ.ID.No.:193和氨基画g SEQ.ID.No.:194o
图98显示核_I SEQ.ID.No.:195和氨基画g SEQ.ID.No.:196o
图99显示核_I SEQ.ID.No.:197和氨基画g SEQ.ID.No.:198o图100显示核_I SEQ.ID.No.199和氨基画1 SEQ.ID.No.200。
图101显示核_I SEQ.ID.No.201和氨基画g SEQ.ID.No.202。
图102显示核_I SEQ.ID.No.203和氨基画g SEQ.ID.No.204。
图103显示核_I SEQ.ID.No.205和氨基画g SEQ.ID.No.206。
图104显示核_I SEQ.ID.No.207和氨基画g SEQ.ID.No.208。
图105显示核_I SEQ.ID.No.209和氨基画g SEQ.ID.No.210。
图106显示核_I SEQ.ID.No.211和氨基画g SEQ.ID.No.212。
图107显示核_I SEQ.ID.No.213和氨基画g SEQ.ID.No.214。
图108显示核_I SEQ.ID.No.215和氨基画g SEQ.ID.No.216。
图109显示核_I SEQ.ID.No.217和氨基画g SEQ.ID.No.218。
图110显示核_I SEQ.ID.No.219和氨基画g SEQ.ID.No.220。
图111显示核_I SEQ.ID.No.221和氨基画g SEQ.ID.No.222。
图112显示核_I SEQ.ID.No.223和氨基画g SEQ.ID.No.224。
图113显示核_I SEQ.ID.No.225和氨基画g SEQ.ID.No.226。
图114显示核_I SEQ.ID.No.227和氨基画g SEQ.ID.No.228。
图115显示核_I SEQ.ID.No.229和氨基画g SEQ.ID.No.230。
图116显示核_I SEQ.ID.No.231和氨基画g SEQ.ID.No.232。
图117显示核_I SEQ.ID.No.233和氨基画g SEQ.ID.No.234。
图118显示核_I SEQ.ID.No.235和氨基画g SEQ.ID.No.236。
图119显示核_I SEQ.ID.No.237和氨基画g SEQ.ID.No.238。
图120显示核_I SEQ.ID.No.239和氨基画g SEQ.ID.No.240。
图121显示核_I SEQ.ID.No.241和氨基画g SEQ.ID.No.242。
图122显示核_I SEQ.ID.No.243和氨基画g SEQ.ID.No.244。
图123显示核_I SEQ.ID.No.245和氨基画g SEQ.ID.No.246。
图124显示核_I SEQ.ID.No.247和氨基画g SEQ.ID.No.248。
图125显示核_I SEQ.ID.No.249和氨基画g SEQ.ID.No.250。
图126显示核_I SEQ.ID.No.251和氨基画g SEQ.ID.No.252。
图127显示核_I SEQ.ID.No.253和氨基画g SEQ.ID.No.254。
图128显示核_I SEQ.ID.No.255和氨基画g SEQ.ID.No.256。
图129显示核_I SEQ.ID.No.257和氨基画g SEQ.ID.No.258。
图130显示核_I SEQ.ID.No.259和氨基画g SEQ.ID.No.260。
图131显示核_I SEQ.ID.No.261和氨基画g SEQ.ID.No.262。
图132显示核_I SEQ.ID.No.263和氨基画g SEQ.ID.No.264。
图133显示核_I SEQ.ID.No.265和氨基画g SEQ.ID.No.266。
图134显示核_I SEQ.ID.No.267和氨基画g SEQ.ID.No.268。
图135显示核_I SEQ.ID.No.269和氨基画g SEQ.ID.No.270。
图136显示核_I SEQ.ID.No.271和氨基画g SEQ.ID.No.272。
图137显示核_I SEQ.ID.No.273和氨基画g SEQ.ID.No.274。
图138显示核_I SEQ.ID.No.275和氨基画g SEQ.ID.No.276。
图139显示核_I SEQ.ID.No.277和氨基画g SEQ.ID.No.278。
图140显示核_I SEQ.ID.No.279和氨基画g SEQ.ID.No.280。
图141显示核_I SEQ.ID.No.281和氨基画g SEQ.ID.No.282。
图142显示核_I SEQ.ID.No.283和氨基画g SEQ.ID.No.284。
图143显示核_I SEQ.ID.No.285和氨基画g SEQ.ID.No.286。
图144显示核_I SEQ.ID.No.287和氨基画g SEQ.ID.No.288。
图145显示核_I SEQ.ID.No.289和氨基画g SEQ.ID.No.290。
图146显示核_I SEQ.ID.No.291和氨基画g SEQ.ID.No.292。
图147显示核_I SEQ.ID.No.293和氨基画g SEQ.ID.No.294。
图148显示核_I SEQ.ID.No.295和氨基画g SEQ.ID.No.296。图149显示组群成员的氨基酸同一性。图150显示序列组的比较。图151A-E显示了全长克隆的对比。图152显示通过PCR克隆细胞色素p450cDNA片段的方法。
图153显示核_I SEQ.IDNo.356和氨基酉変 SEQ.ID.No.357。
图154显示核_I SEQ.IDNo.358和氨基酉変 SEQ.ID.No.359。
图155显示核_I SEQ.IDNo. :360和氨基酸SEQ. ID. No. :361ο
图156显示核_I SEQ.IDNo.362和氨基酉変 SEQ.ID.No.363。
图157显示核_I SEQ.IDNo.364和氨基酉変 SEQ.ID.No.365。
图158显示核_I SEQ.IDNo.366和氨基酉変 SEQ.ID.No.367。
图159显示核_I SEQ.IDNo.368和氨基酉変 SEQ.ID.No.369。
图160显示核_I SEQ.IDNo.370和氨基酉変 SEQ.ID.No.371。
图161显示核_I SEQ.IDNo.372和氨基酉変 SEQ.ID.No.373。图162显示基因芯片上所有克隆的探针组序列。图 163 显示了 SEQ. ID No. :434-536。发明详述定义除非另有定义，本文使用的所有技术和科技术语均与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的具有相同的意义。Singleton等，(1994)《微生物和分子生物学字典》(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)，第二片反，John Wiley and Sons (纽约)为技术人员提供了许多关于本发明所用术语的通用字典。本文所提及的所有专利和出版物均纳入本文作为参考。出于本发明的目的，下列术语如下定义。“酶活性”包括脱甲基化、羟基化、环氧化、N-氧化、磺基氧化、N-、S-和0-脱烷基化、脱硫作用、脱氨基作用和偶氮基、硝基和N-氧化物基团的还原。术语“核酸”指单链或双链形式的，或有义或反义的脱氧核糖核酸或核糖核酸聚合物，并且除非另有限制，该术语包括能以类似于天然存在核苷酸的方式与核酸杂交的天然核苷酸的已知类似物。除非另有指出，特定的核酸序列包括其互补序列。术语“可操作性连接”、“可操作性结合”和“以可操作性顺序”指核酸表达控制序列(例如启动子、信号序列或转录因子结合位点的阵列)和第二核酸序列之间的功能性连接，其中表达控制序列影响对应于第二序列的核酸的转录和/或翻译。当术语“重组体”用于指细胞时，它指该细胞复制异源核酸，表达所述核酸或表达异源核酸编码的肽、异源肽或蛋白质。重组细胞可以有义或反义形式表达在细胞的天然形式(非重组)中未发现的基因或基因片段。重组细胞也可表达在细胞的天然形式中发现的基因，但其中该基因通过人工方式被改变并重新引入细胞。“结构基因”是含有编码蛋白质、多肽或其部分的DNA片段的基因的一部分，并且不包括启动转录的5’序列。或者结构基因可编码不可翻译的产物。结构基因可是在细胞中正常发现的基因，或者它是引入的而非在细胞或细胞位置中正常发现的基因，在这种情况下称为“异源基因”。异源基因可全部或部分来源于本领域已知的任何来源，包括细菌基因组或附加体、真核生物的、核的或质粒DNA、cDNA、病毒DNA或化学合成的DNA。结构基因可含有一种或多种修饰，这些修饰可影响生物活性或其特性、表达产物的生物活性或化学结构、表达速率或表达控制的方式。这种修饰包括(但不限于)一个或多个核苷酸的突变、插入、删除和取代。结构基因可构成不间断的编码序列或可包括一个或多个与合适的剪接接头结合的内含子。结构基因可以是可翻译或不可翻译的，包括反义方向(antisenseorientation)。结构基因可以是来源于多种来源和多种基因序列的复合物(天然存在的或合成的，其中合成的指化学合成的DNA)。“来源于”用来指从某种来源(化学和/或生物的)取得、获得、接受得、追溯、复制或传下的。可通过对原始来源的化学或生物学操作(包括，但不限于取代、添加、插入、删除、提取、分离、突变和复制)产生衍生物。涉及DNA序列的术语“化学合成的”指部分核苷酸组分在体外装配。可使用已良好建立的方法(Caruthers，《DNA和RNA测序的方法》(Methodology of DNA and RNA Secquencing), (1983) ,Weissman 编，Praeger Publishers,New York,第 1 章)实现 DNA 的手工化学合成；可使用许多市售可得的机器的一种进行自动化学合成。可通过以下方法进行序列的最佳对比Smith和Waterman (Adv. Appl. Math. 2 482(1981))的局部同源性算法、Needleman 和 Wunsch (J. Mol. Biol. 48 :443(1970))的同源性算法、Pearson 和 Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. Α.) 85 :2444 (1988))的相似性检索方法、这些算法的计算机化的工具(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA 禾口 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. , Madison, Wis.)或通过检验。可从几种来源(包括生物信息国家中心(NCBI, Bethesda, Md.)和因特网)获得NCBI基础局部序列比对检索工具(BLAST) (Altschul等，1990)与序列分析程序blast、 blastn、blastx、tblastn 禾口 tblastx 联合使用。该工具可在 htp //www. ncbi. nlm. nih. gov/ BLAST/获得。如何使用该程序检测序列同一性描述于http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/ BLAST/blast help.html。本文使用并应用于氨基酸序列的术语“实质性氨基酸同一性”或“实质性氨基酸序列同一性”表示多肽的一种特性，其中与参考组在所翻译肽的细胞色素P450基序 GXRXCX (G/A)后的第一氨基酸到终止密码子的对应区域相比，所述肽含有至少70%的序列同一性、优选80%氨基酸序列同一性、更优选90%氨基酸序列同一性、最优选至少 99-100 %序列同一性的序列。本文使用并应用于核酸序列的术语“实质性核酸同一性”或“实质性核酸序列同一性”表示多核苷酸序列的一种特性，其中与参考组在所翻译肽的细胞色素P450基序 GXRXCX(G/A)后的第一核酸到终止密码子的对应区域相比，所述多核苷酸含有至少75%的序列同一性、优选81 %序列同一性、更优选91 %序列同一性、最优选至少99-100 %序列同一性的序列。核苷酸序列实质相同的另一个指标是两个分子在严格条件下是否可杂交。严格条件视序列而定，在不同情况下是不同的。严格条件一般选择比给定离子强度和PH时特定序列的热解链温度(Tm)低约5-20°C，通常是约10-15°C。Tm是在给定离子强度和pH时50% 靶序列与匹配的探针杂交的温度。严格条件通常是盐浓度为约0. 02摩尔，pH是7，温度是至少约60°C。例如，在标准的Southern杂交方法中，严格条件包括于42°C在6XSSC中初次洗涤，然后于至少约(通常是约601，更常见是约65°0在0.2\33(进行一次或多次额外洗涤。出于本发明的目的，当核苷酸序列编码的多肽和/或蛋白质实质性相同时，核苷酸序列也实质性相同。因此，当一条核酸序列与第二条核酸序列编码的多肽实质性相同时，这两条核酸序列是实质性相同的，即使由于遗传密码所允许的简并性造成它们在严格条件下不会杂交(对密码子简并性和遗传密码的解释参见Darnell等，(1990)《分子生物学》(Molecular Cell Biology),第二版，Scientific American Books W. H. Freeman and Company,New York)。可通过许多本领域熟知的方式，例如蛋白质样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后基于染色通过目测来表征蛋白质纯度或均一性。出于特定的目的，可能需要高分辨率并可利用HPLC或类似的装置。本文使用的术语“载体”指将DNA片段转移入细胞的核酸分子。载体可由于复制 DNA并可在宿主细胞中独立地复制。术语“运载体”有时可与“载体”互换使用。本文使用的术语“表达载体”指重组DNA分子，该分子含有所需的编码序列和用于在特定宿主生物体中表达操作性相连的编码序列所需合适的核酸序列。通常，原核生物中表达所需的核酸序列通常含有启动子、操纵子(任选)与核糖体结合位点，以及其它序列。已知真核细胞可利用启动子、增强子以及终止和聚腺苷酸化信号。为再生完全经遗传工程改造的具有根的植物，可在植物细胞中插入核酸，例如通过诸如体内接种的任何技术或通过任何已知的体外组织培养技术来产生可再生为完整植物的转化植物细胞。因此，例如可通过病原性或非病原性根瘤土壤杆菌(A. tumefacien)的体外接种来插入植物细胞。也可使用其它这样的组织培养技术。“植物组织”包括分化或未分化的植物组织，包括，但不限于根、芽、叶、花粉、种子、 肿瘤组织以及培养物中细胞的各种形式，例如单细胞、原生质体、胚和愈伤组织。植物组织可在植物中(in planta)或器官中，组织或细胞培养物中。本文使用的“植物细胞”包括植物中的植物细胞和培养物中的植物细胞和原生质体。“cDNA”或“互补DNA” 一般指核苷酸序列与RNA分子互补的单链DNA分子。cDNA 是通过逆转录酶在RNA模板作用形成的。获得核酸序列的方案根据本发明，从转化体和非转化体烟草谱系的烟草组织中提取RNA。提取的RNA然后用于产生cDNA。然后使用两种方案产生本发明的核酸序列。在第一方案中，从植物组织中提取富含polyA的RNA并通过逆转录PCR制备cDNA。 然后使用简并引物加上寡聚d(T)反向引物，用单链cDNA产生p450特异性PCR群。以高度保守的P450基序为基础设计引物。特定的简并引物的例子示于图1。进一步分析含有合适大小插入物的质粒的序列片段。这些插入物的大小一般是约300-800个核苷酸，视采用何种引物而定。在第二方案中，首先构建cDNA文库。使用简并引物加上在质粒上作为反向引物的 T7引物，使用质粒中的cDNA产生p450特异的PCR群。如第一方案中一样，进一步分析含有合适大小插入物的质粒的序列片段。已知产生高水平降烟碱的烟草植物谱系(转化体)和降烟碱水平检测不到的植物谱系可用作起始材料。然后可从植物上取下叶子并用乙烯处理以激活本文所定义的p450酶活性。示于本领域已知的技术提取总RNA。然后使用如图153所述的寡聚d(T)引物经PCR(RT-PCR)产生cDNA片段。然后可完全地构建本文实施例所述的cDNA文库。p450型酶的保守区域可用作简并引物(图75)的模板。可通过PCR使用简并引物扩增p450特异性条带。表示p450样酶的区带可通过DNA测序鉴定。可使用鉴定合适的候选对象的BLAST检索、算法或其它工具来表征PCR片段的特性。已鉴定片段的序列信息可用于开发PCR引物。这些引物与cDNA文库中的质粒引物联合用于克隆全长P450基因。进行大规模Sourthern反向分析来检测所有获得的片段克隆以及在一些情况中全长克隆的差别表达。在本发明的这个方面，为筛选所有克隆的插入物，可用不同组织的标记的总cDNA作为探针来与克隆的DNA片段杂交，进行大规模反向 Sourthern 测定。也用非放射性和放射性(P3》Northern印迹测定来鉴定克隆p450片段和全长克隆。通过衍生它们的氨基酸序列与选择抗原性和对其它克隆独特的肽区域来制造针对几种全长克隆的肽特异性抗体。制造了针对偶联于运载体蛋白的合成肽的家兔抗体。使用这些抗体对植物组织进行Western印迹分析或其它免疫学方法。可使用病毒诱导的基因沉默技术(VIGS，Baulcombe，CurrentOpinions in Plant Biology, 1999,2 :109-113)检测以上鉴定的核酸序列。通过衍生它们的氨基酸序列与选择可能的抗原性和对其它克隆独特的肽区域来制造针对几种全长克隆的肽特异性抗体。制造了针对偶联于运载体蛋白的合成肽的家兔抗体。使用这些抗体进行^festern印迹分析。在本发明的另一方面，使用干扰RNA(RNAi)技术在本发明的烟草植物中进一步鉴定细胞色素P450酶活性。描述该技术的以下参考文献纳入本文作为参考，Smith等， Nature,2000,407:319-320 ；Fire 等，Nature,1998,391 :306-311 ；Waterhouse 等，PNAS, 1998,95 :13959-13964 ；Stalberg 等，Plant Molecular Biology，1993，23:671-683 ； Baulcombe, Current Opinions in Plant Biology，1999，2 :109-113 禾口 Brigneti 等，EMBO Journal, 1998,17(22) :6739_6746。可使用RNAi技术、反义技术或所述的各种其它方法来转化植物。有几种技术将外来遗传物质引入植物细胞并获得稳定地维持和表达所引入基因的植物。这种技术包括加速包裹在微粒上的遗传物质进入细胞(授予Cornell的美国专利 4，945，050和授予DowElanco的美国专利5，141，131)。可使用土壤杆菌技术来转化植物， 参见授予 University of Toledo 的美国专利 5，177，010 ；授予 iTexas A & M 的 5，104,310; Schilperoot的欧洲专利申请01316MB1、欧洲专利申请120516、159418B1、欧洲专利申请 120516、159418B1 和 176，112 ；授予 Schilperoot 美国专利 5，149，645 ；5，469，976 ； 5，464，763 ；4，940，838 和 4，693，976 ；MaxPlanck 的欧洲专利申请 116718、290799、320500 ； Japan Nicotiana的欧洲专利申请604662和627752 ；Ciba Geigy的欧洲专利申请0267159、 0292435和美国专利5，231，019 ；授予Calgene的美国专利5，463，174和4，762，785 ；授予 Agracetus的美国专利5，004，863和5，159，135。其它转化技术包括whiskers技术，参见， 例如授予kneca的美国专利5，302，523和5，464，765。电穿孔技术也用于转化植物，参见， Boyce Thompson Institute 的 WO 87/06614、Dekalb 的 5，472，869 和 5，384，253 ；PGS 的 W09209696和W09321335。所有这些转化专利和出版物引作参考。除了许多转化植物的技术以外，与外来基因接触的组织的类型也可变。这种组织包括，但不限于胚胎发生组织、I 和II型愈伤组织、下胚轴、分生组织等。使用技术人员已知的合适的技术几乎可转化所有分化过程中的植物组织。引入植物的外来遗传物质可包含选择标记。具体的标记可由技术人员判断，但以下选择标记可与任何其它可用作选择标记的本文未列出的基因一起使用。这种选择标记包括，但不限于编码抗生素卡那霉素、新霉素和G418抗性的转座子Tn5(Aph II) 的氨基糖苷磷酸转移酶基因，以及编码对N-膦酰甲基甘氨酸、潮霉素、氨甲喋呤、草铵膦 (phosphinothricin) (bar)、咪唑啉酮、磺酰脲和三唑并嘧啶除草剂，例如chlorosulfuron、 溴苯腈、茅草枯等具抗性或耐受性的那些基因。除了选择标记以外，可能需要使用报道基因。在一些例子中，可使用报道基因而无需选择标记。报道基因是通常不存在于或不表达于受者生物体或组织中的基因。报道基因通常编码提供一些表型改变或酶性能的蛋白质。这种基因的例子见纳入本文作为参考的 K. Weising等，Ann. Rev. Genetics, 22，421 (1988)。优选的报道基因包括，但不限于葡糖醛酸酶(GUS)基因和GFP基因。一旦引入植物组织后，可通过任何本领域已知的方法来评价结构基因的表达，可以mRNA转录、蛋白质合成或发生沉默基因的量来检测表达(参见纳入本文作为参考的美国专利号5，583，021)。用于体外培养植物细胞和在许多情况中，用于再生完整植物的技术是已知的(欧洲申请号88810309.0)。本领域的技术人员已知将引入的表达复合物变为商业有用品种的方法。一旦获得表达所需水平的p450酶的植物细胞，可使用本领域熟知的方法和技术再生植物组织和完整的植物。再生的植物可通过常规方法繁殖，引入的基因可通过常规植物育种技术转入其它品系或品种。以下实施例描述了实施本发明的方法并且应理解为是说明性的，而非基于此来限制本发明在权利要求中所定义的范围。
实施例实施例1植物组织的发育和乙烯处理植物生长将植物种在盆中，在温室中生长4周。将4周龄的幼苗移到单独的盆中，温室中生长2个月。生长过程中，每天给植物浇水2次，水中含有150ppm的WK肥料。将展开的绿叶与植物分离，以进行下面所述的乙烯处理。细胞系78379由肯塔基大学发放的烟草品系78379用作植物材料的来源，它是一种白肋 (burley)烟草品系。用本领域种植烟草的标准方法培养100株植物，移植，并且用不同的数字(1-100)给它们贴注标签。用推荐的方法施肥和进行田间管理。100株植物中的3/4将20-100%的烟碱转化为降烟碱。100株中的1/4将小于5% 的烟碱转化为降烟碱。植株87转化率最低)，而植株21的转化率为100%。将转化率小于3%的植株分类为非转化株。对植株87和21自花授粉的种子以及杂交Ql χ 87和 87 χ 21)的种子进行遗传差异和表型差异的研究。来自植株21自花授粉种子的植物是转化株，99%的来自植株87自花授粉种子的植物是非转化株。剩余的来自植株87自花授粉种子的植物有较低的转化率(5-15% )。杂交种均为转化株。
细胞系4407烟草品系4407用作植物材料来源，它是一种白肋品系。选择均一的并且具代表性的植物(100)并贴上标签。在这100株植物中，97株是非转化株，3株是转化株。植株56 的转化率最低(1. 2% )，植株58的转化水平最高(96% )。将这两株植物进行自花授粉和杂交。来自植株58自花授粉种子的植株产生3 1的分离比(转化株非转化株= 3:1)。植株58-33和58-25分别被鉴定为纯合转化株和非转化株植物品系。植株58-33 下一代后裔中的分析确证了该植株的稳定转化率。细胞系PBLBOlPBLBOl是由ftOfiGen，Inc.研究开发的一种白肋品系，用作植物材料的来源。从 PBLBOl的第一代(foundation)种子中选择转化株植株。乙烯处理方法将绿色叶片从温室生长2-3个月的植物分离，喷施0. 3%的乙烯溶液(商品名 Kkphon(Rhone-Poulenc))。将每片经喷施的叶子悬挂在配有加湿器的养护架(curing rack)上，覆盖塑料膜。在处理期间，用乙烯溶液定期喷施样品叶片。乙烯处理后约M-48 小时，收集叶子提取RNA。取同一组样品的另外一份(sup-sample)用于代谢成分分析以测定叶片代谢物的浓度以及感兴趣的更具体的成分如多种生物碱的分析。例如，可如下进行生物碱分析。样品(0. 1克)和0. 5毫升2N NaOH以及含有喹啉 (作为内标)和甲基叔丁基乙醚的5毫升提取液在150rpm振荡。在配有FID检测器的HP 6890GC上分析样品。250°C的温度用于检测器和上样器(injector)。使用含有与5%苯酚和95%甲基硅酮(methyl silicon)交联的熔融硅石的HP柱(30m_0. 32nm_lm)，温度梯度为每分钟10°C，110-185°C。该柱在100°C工作，用氦气作为运载气体，流速为1. 7cm3min-l, 分流比为40 1，上样体积为2 · 1。实施例2 分离RNA对于RNA的提取，如上所述用乙烯处理2月龄温室植物的中等大小的叶片。0和 M-48小时的样品用于RNA提取。在有些情况下，从打顶(flower-head removal)后10天的植物取处于衰老过程的叶片样品。这些样品也用于提取。用foieasy Plant Mini Kit (Qiagen, Inc.，Valencia, California)按照生产商的方法分离总 RNA。用DEPC处理过的研钵和杵在液氮中将组织样品研磨为细粉。将约100毫克磨碎的组织转移到灭菌的1. 5毫升印pendorf管中。将样品管置于液氮中，直到收集完所有样品。然后，将试剂盒中提供的450 μ 1 RLT缓冲液加入各管中。剧烈振荡样品，然后在56°C 温育3分钟。将裂解物加在放于2毫升收集管中的QIAshredderTM旋转柱上，最大速度离心 2分钟。收集流出液，加0.5体积的乙醇到澄清的裂解液中。充分混合样品，转移到放在2 毫升收集管中的小旋转柱中。10，OOOrpm离心样品1分钟。然后，吸取700μ1 RWl缓冲液到Rneasy 柱上，10，OOOrpm离心1分钟。吸取RPE缓冲液到置于新收集管中的Rneasy 柱上，10，OOOrpm离心1分钟。再将RPE缓冲液加到Rneasy 旋转柱上，以最大速度离心 2分钟以使膜干燥。为了除掉残留的乙醇，将膜置于一空收集管上，再以最大速度离心1分钟。将'Rneasy 柱转移到一个新的1. 5毫升收集管中，将40 μ 1不含RNA酶的水直接吸到 Rneasy 膜上。该最终洗脱物在10，OOOrpm离心1分钟。用变性甲醛凝胶和分光光度计分析总RNA的质量和数量。按照生产商的方法用OligotexTM poly A+RNA纯化试剂盒^liagen he.)分离 Poly (A) RNA。使用溶于最大为250 μ 1体积的约200 μ g总RNA。将250 μ 1 OBB缓冲液和 15 μ 1 OligotexTM悬浮液加到250 μ 1总RNA中。通过吸打使这些物质彻底混合，在加热器 (heating block)上70°C保温3分钟。然后，将样品置于室温约20分钟。最大速度离心2 分钟得到oligotex :mRNA复合物团块。从微离心管中除去全部上清液，仅剩约50 μ 1。再用OBB缓冲液处理样品。通过涡旋将oligotex :mRNA团块重新悬浮在400 μ 1 0W2缓冲液中。将该混合物转移到置于新管中的小旋转柱上，以最大速度离心1分钟。将旋转柱移到新管中，再往该柱中加入400 μ 1 0W2缓冲液。然后，以最大速度离心该管。将旋转柱转移到最终的1.5毫升微量离心管中。用60 μ 1热的(70°C)0EB缓冲液洗脱样品。用变性甲醛凝胶和分光光度计分析Poly A产物。实施例3:反转录-PCR按照生产商的方法用Superscript反转录酶(Invitrogen，Carlsbad, California)制备第一链cDNA。富集了 poly A+RNA的寡聚dT引物混合物由少于5 μ g的总 RNAU μ 1 IOmM dNTP 混合物、Ιμ Oligo d (T) 12-18 (0. 5 μ g/μ 1)和至多 10 μ 1 的经DEPC 处理的水组成。各样品在65°C温育5分钟，然后置于冰上至少1分钟。按顺序加入下列各组分，以制备反应混合物2 μ 1 IOX RT缓冲液、4 μ 1 25mM MgC12、2 μ 1 0. IM DTT禾Π 1 μ 1 去除 RNA 酶的重组 RNA 酶抑制剂(Rnase OUT Recombinant RNase hhibitor)。吸取 9 μ 1 反应混合物到各RNA/引物混合物，轻柔混合。42°C温育2分钟，在各管中加入1 μ 1 Super Script IITM RT，42°C温育50分钟。在70°C终止反应15分钟，冰上冷却。离心收集样品， 在各管中加入1 μ 1 RNase H，37°C温育20分钟。用200pmoles正向引物(如图75所示的变性引物，SEQ ID N0. 149-156)和lOOpmoles反向引物(18碱基的寡聚d(T)，接一个随机碱基)进行第二次PCR。反应条件是94°C 2分钟；然后进行40个循环的PCR -MV 1分钟，45_60°C 2分钟， 720C 3分钟；最后72°C再延伸额外的10分钟。用的琼脂糖凝胶电泳分析10微升的扩增样品。将大小正确的条带从琼脂糖凝胶上纯化出来。实施例4 =PCR片段群体的产生按照生产商的方法将实施例3得到的PCR片段连接到pGEM-T Easy Vector (Promega，Madison，Wisconsin)中。用连接产物转化JM109感受态细胞，涂在LB培养基平板上，进行蓝/白选择。选择克隆，置于96孔板上在1. 2毫升LB培养基中37°C生长过夜。对于所有选出的集落保留冻存管。用Beckman' s Biomeck 2000小制备机器人技术(minipr印robotics)以Wizard SVMinipr印试剂盒(Promega)从平板上纯化质粒。用 100 μ 1水洗脱质粒DNA，存贮于96孔板中。用EcoIU消化质粒，并用1 %琼脂糖凝胶分析以确证DNA的量和插入片段的大小。用CEQ 2000测序仪(Beckman，Fullerton，California) 测序含有400-600bp插入片段的质粒。用BLAST搜索将测得的序列与Genbank数据库进行比对。鉴定与P450相关的片段并进一步分析。或者，将p450片段从差减文库中分离出来。 如上所述分析这些片段。实施例5 ⑶NA文库的构建
如下所述从乙烯处理的叶片中制备总RNA以构建cDNA文库。首先，用改良的酸酚和氯仿提取方法从乙烯处理的烟草品系58-33叶片中提取总RNA。改良的方法是用1克组织进行研磨，随后在5毫升加入了 5毫升苯酚(pH5. 5)和5毫升氯仿的提取缓冲液(IOOmM Tris-HCl,pH 8. 5 ；200mM NaCl ；IOmM EDTA ；0. 5% SDS)中涡旋。将提取的样品离心，保留上清。该提取步骤再重复2-3次直到上清变得澄清。加入约5毫升氯仿以除去痕量的苯酚。 加入3倍体积的ETOH和1/10体积的3M NaOAc (pH5. 2)以从混合的上清组分中沉淀RNA， 在-20°C存贮1小时。转移到Corex玻璃容器中以后，在4°C 9，000RPM离心RNA组分45分钟。离心下来的团块用70%乙醇洗涤，4°C 9，000RPM离心5分钟。团块干燥以后，将RNA团块溶解在0. 5毫升不含foiase的水中。RNA团块溶解在0. 5毫升不含foiase的水中。分别用变性甲醛和分光光度计分析总RNA的质量和数量。以下述步骤用Oligo (dT)纤维素方法(Invitrogen)和微离心旋转柱 (Invitrogen)从得到的总RNA中分离poly A+RNA。约20mg总RNA进行两次纯化以获得高质量的poly A+RNA。用变性甲醛和随后的已知全长基因的RT_PCR(确保高质量的mRNA)来分析PolyA+RNA产物。接着，以poly A+RNA作模板用cDNA合成试剂盒、ZAP-cDNA 合成试剂盒和ZAP-cDNA Gigapack III 金克隆试剂盒(gold cloning kit) (Stratagene, La Jolla, California)来产生cDNA文库。其中的方法按照生产商规定的步骤来进行。用约 8μ g polyA+RNA来构建cDNA文库。初级文库的分析显示约有2. 5X 106-1 X 107pfu。用 IPTG和X-gal进行了互补分析，以检测文库的质量背景，其中重组噬菌斑的表达高出背景反应100倍以上。用随机PCR对文库进行的更为定量的分析表明，插入的cDNA的平均大小约为 1.21Λ。该方法采用了如下所述的两步法PCR。对于第一步，反向引物的设计是基于从p450 片段获得的初级序列信息。设计的反向引物和T3(正向)引物用于从cDNA文库中扩增相应的基因。PCR反应物进行琼脂糖凝胶电泳，切割高分子量的相应条带，纯化、克隆并测序。 在第二步中，用根据Ρ450的5' UTR或翻译起始区域设计的新引物作为正向引物，和反向引物一起(根据Ρ450的3' UTR设计)用于下一步的PCR以获得全长ρ450克隆。如实施例3所述(反向引物除外)从构建的cDNA文库中用PCR扩增获得ρ450片段。用位于质粒上cDNA插入片段下游(见图75)的T7引物作为反向引物。如实施例4所述分离、克隆和测序PCR片段。从构建的cDNA文库中用PCR方法分离全长p450基因。用基因特异性反向引物 (根据P450片段的下游序列设计)和正向引物(位于文库质粒上的T3)来克隆全长基因。 分离、克隆并测序PCR片段。如果需要，可进行第二步PCR。在第二步PCR中，用根据克隆的P450的5' UTR设计的新正向引物和根据p450的3' UTR设计的反向引物来进行下一步的PCR反应，以获得全长p450克隆。然后对克隆测序。实施例6 克隆片段的鉴定-反向SOUTHERN印迹分析在以上实施例中鉴定的所有p450克隆上进行非放射性大规模反向southern印迹试验以检测差异性表达。观察到不同P450基因簇之间的表达水平非常不同。在高水平表达的克隆上又进行了实时检测。非放射性southern印迹方法按如下所述进行。
1)如实施例2所述用Qiagen Rnaeasy试剂盒从乙烯处理和未处理的转化株 (58-33)和非转化株(58-25)叶片提取总RNA。2)用生物素加尾标记从上述步骤产生的富含poly A+的RNA中衍生的单链 cDNA来制备探针。该标记的单链cDNA是如实施例3所述用转化株和非转化株的总 RNA(Invitrogen)进行RT-PCR产生的，但用了生物素化的寡聚dT作为引物(Promega)。这些用作探针与克隆的DNA杂交。3)用限制性内切酶EcoIU消化质粒DNA，进行琼脂糖凝胶电泳。将这些凝胶同时干燥并转到两个尼龙膜上(BiodyneB )。一个膜与转化株探针杂交，另一个膜与非转化株探针杂交。在杂交之前将膜进行紫外线交联(自动交联设备，2Mnm，Stratagene, Stratal inker) 0或者，用位于p-GEM两臂上的序列，T3和SP6作为引物从各质粒中PCR扩增插入片段。PCR产物在96孔的即时(Ready-to-rim)琼脂糖凝胶上电泳以进行分析。经确证的插入片段点到两个尼龙膜上。一个膜与转化株探针杂交，另一个膜与非转化株探针杂交。4)按生产商的说明书将这些膜杂交并洗涤，其中对洗涤的严格性进行了改变 (Enzo MaxSenceTM 1 ^, Enzo Diagnostics, Inc, Farmingdale, NY)。
(2x SSC缓冲的甲酰胺，含有去垢剂和杂交增强剂)在42°C预杂交30分钟，与10 μ 1变性的探针42°C杂交过夜。然后室温用IX杂交洗涤缓冲液洗涤杂交膜一次，10分钟 ’68V洗浲 15分钟，4次。然后可以对杂交膜进行检测。5)按生产商提供的检测方法(Enzo Diagnostics, Inc.)，经洗涤的膜用碱性磷酸酶标记，然后用NBT/BCIP颜色检测方法进行检测。用IX封闭液室温封闭杂交膜1小时，用 IX检测试剂洗涤10分钟(3次)，用IX预显影反应缓冲液洗涤5分钟O次)，然后在显影液中显影直到出现点状印迹。所有的试剂都由生产商提供(Enzo Diagnostics, Inc) 0此夕卜， 还用KPL southern杂交和检测试剂盒 按生产商的方法(KPL，Gaithersburg, Maryland) 进行了大规模反向Southern试验。实施例7 克隆的鉴定-NORTHERN印迹分析除Southern印迹分析之外，如Northern印迹分析的实施例所述，一些膜进行了 Northern杂交和检测。如下所述，采用Northern杂交检测烟草中差异表达的mRNA。采用随机引发方法从克隆的p450制备探针(MegaprimeTM DNA标记系统， Amersham Biosciences)。混合下述组分25ng变性的DNA模板；未标记的dTTP、dGTP和dCTP各4 μ 1 ； 5 μ 1 反应缓冲液；Ρ32标记的dATP和2ul Klenow I ；以及水，使反应体系达到50 μ 1。该混合物在37°C温育1-4小时，然后以2 μ 10. 5Μ的EDTA终止。使用前，95°C温育5分钟使探针变性。从几对烟草品系经乙烯处理和未经处理的新鲜叶片中制备RNA样品。在有些情况下，使用了富含 poly A+的 RNA。用 DEPC 水(5-10 μ 1)使约 15 μ g总 RNA 或 1. 8 μ g mRNA (RNA 或mRNA提取方法如实施例5所述)的体积相同。加入等体积的上样缓冲液(1 χ MOPS； 18. 5% 甲醛；50% 甲酰胺；4% FiColl 400 ；溴酚蓝)和 0. 55 μ 1 KBr (0. 5 μ g/μ 1)。将样品变性，准备用电泳分离RNA。将样品用1ΧΜ0Ρ缓冲液(0. 4Μ吗啉苯磺酸；0. IM乙酸钠_3χ Η20 ；IOmM EDTA ；用NaOH调pH至7. 2)在甲醛凝胶(1%琼脂糖，Ix M0PS，0.6M甲醛)上电泳。用毛细方法在IOX SSC 缓冲液(1.5M NaCl ；0. 15M 柠檬酸钠)中将 RNA 转移到 Hybond-N+上(Nylon，Amersham WiarmaciaBiotech)^小时。在杂交前，将有RNA样品的膜紫外交联(自动交联设备，2Mnm， Stratagene, Stratal inker)。膜和5-10毫升预杂交缓冲液(5x SSC ；50%甲酰胺；5x Denhar dt' s_溶液； SDS ； 100g/ml热变性的平端非同源DNA)在42°C预杂交1_4小时。将旧的预杂交缓冲液弃去，加入新的预杂交缓冲液和探针。杂交在42°C过夜进行。用& SSC室温洗涤膜15分钟， 然后用h SSC洗涤一次。本发明的一个主要焦点是发现了可被乙烯处理诱导的新基因或者在烟草叶片的质量和成分中起主要作用的新基因。如下表所示，Northern印迹和反向Southern印迹可用于测定哪些基因受乙烯处理的诱导(相对于不受诱导的植株)。令人感兴趣的是，在转化株和非转化株植株中并非所有的片段都受到相似的影响。对感兴趣的细胞色素P450片段部分测序以确定它们的结构相关性。该信息被用于后续分离和鉴定感兴趣的全长基因克隆。
片段诱导的mRNA表达乙烯处理转化林D56-AC7 (SEQ ID NO:35)+D56-AG11 (SEQ ID NO:31)+D56-AC12 (SEQ ID NO:45)+D70A-AB5(SEQ ID NO:95)+D73-AC9 (SEQ ID NO:43)+D70A-AA12 (SEQ ID NO: 131)+D73A-AG3 (SEQ TD NO: 129)+D34-52 (SEQ ID NO:61)+D56-AG6 (SEQ TD NO:51)+用全长克隆在从乙烯处理诱导的转化株和非转化株白肋品系获得的烟草组织上进行Northern分析。目的是鉴定在乙烯诱导的转化株植株中(相对于乙烯诱导的转化株品系相对于乙烯诱导的非转化株白肋品系)表达有所提高的那些全长基因克隆。用这种 Northern分析方法，可以通过比较转化株和非转化株品系之间叶片组成的生化差异来确定全长克隆的功能关系。如下表所示，6个克隆在乙烯处理的转化株植物组织中(标记为++ 和+++)显示出比在乙烯处理的非转化株植物组织中(标记为+)表达显著升高。在未经乙烯处理的转化株和非转化株品系中所有这些克隆显示出很少的表达或不表达。
2权利要求
1.一种分离的烟草核酸分子，该核酸分子含有选自SEQ. ID. No. :299-357的核酸序列。
2.—种转基因植物，该转基因植物含有如权利要求1所述的核酸分子。
3.如权利要求2所述的转基因植物，其特征在于，所述植物是烟草植物。
4.一种产生转基因植物的方法，该方法包括以下步骤(i)将如权利要求1所述的核酸分子与在所述植物中具有功能的启动子操作性相连以产生植物转化载体；( )用步骤的所述植物转化载体转化所述植物；(iii)选择用所述转化载体转化的植物细胞；和(iv)从所述转化的植物细胞再生转化植物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述核酸分子处于反义方向。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述核酸分子处于有义方向。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述核酸分子处于RNA干扰方向。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述核酸分子表达为双链RNA分子。
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述双链RNA分子长度为约15-25个核苷酸。
10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述转基因植物是烟草植物。
11.一种选择含有核酸分子的植物的方法，其中分析所述植物中是否存在选自 299-357的核酸序列。
12.如权利要求11所述选择植物的方法，其特征在于，通过DNA杂交分析所述植物。
13.如权利要求11所述选择植物的方法，其特征在于，所述DNA杂交是Southern印迹分析。
14.如权利要求11所述选择植物的方法，其特征在于，所述DNA杂交是Northern印迹分析。
15.如权利要求11所述选择植物的方法，其特征在于，通过PCR检测分析所述植物。
16.如权利要求11所述选择植物的方法，其特征在于，所述植物是烟草植物。
17.一种增加或降低植物中降烟碱水平的方法，所述方法包括以下步骤(i)将如权利要求1所述的核酸分子与在所述植物中具有功能的启动子操作性相连以产生植物转化载体；( )用步骤(i)所述植物转化载体转化所述植物；(iii)选择用所述转化载体转化的植物细胞；和(iv)从所述转化的植物细胞再生转化植物。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述核酸分子处于反义方向。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述核酸分子处于有义方向。
20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述核酸分子处于RNA干扰方向。
21.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述核酸分子表达为双链RNA分子。
22.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述转基因植物是烟草植物。
全文摘要
本发明涉及P450酶和在烟草中编码P450酶的核酸序列，以及使用这些酶和序列来改变植物表型的方法。
文档编号C12N9/02GK102321641SQ20111027703
公开日2012年1月18日 申请日期2004年10月15日 优先权日2003年10月16日
发明者D.徐 申请人:美国无烟烟草有限责任公司