专利名称：基于克鲁斯假丝酵母的甘油生产工艺的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及的是一种微生物发酵生产甘油技术领域的方法，具体是一种基于克鲁斯假丝酵母的甘油生产工艺。
背景技术：
甘油，作为化学产品的重要副产品，又是其他化学产品的重要原料，主要用途有医药、化妆品、个人护理产品，香烟及食品。随着我国国民经济的不断发展，作为国计民生重要化工产品的甘油市场需求量不断增长，尤其是在食品、化妆品工业和医药工业的需求在逐年增加。因此，开发国内甘油的生产和应用，对我国社会的发展意义重大。甘油又名丙三醇，为无色粘稠液体，是重要的轻化工原料，用途很广，常用于个人护理、牙膏、医药、化妆品、食品等品种中。目前甘油来源主要为制皂工业和生物柴油的副产物、化学合成甘油、发酵法生产甘油三方面。但由于制皂工业的萎缩，皂化甘油的产量也大幅度下降，且化学合成甘油由于工艺复杂，技术难度大及其应用范围受限等因素制约其发展。随着人民生活水平不断的提高，各国对食品、日用品的安全限制和质量标准越来越高， 特别是几年前美国“毒甘油”事件之后，全球都在致力于不断的提高食品与药品的质量和安全性。这种社会趋势之下，发酵法生产甘油这种方法应该重新被人们认识和重视，发酵法生产甘油是以淀粉类物质作为原料，通过糖化后经微生物菌种发酵后提取制得。首先其原料来源广泛、价格低廉，其次经微生物发酵生产过程中安全性比化学合成和皂化甘油更高，生产出的甘油产品应用面更广，因此可以作为解决我国高品质甘油短缺状况的一条重要的工艺路线。但近年来，发酵法生产的成品甘油质量普遍不高、且生产成本和污染较大，在市场中逐渐地失去了其应有的竞争力。主要为以下几点首先，没有稳定的高产甘油菌株作为发酵生产的坚实基础，现有发酵法生产甘油的菌种主要包括细菌、酵母、霉菌、原生动物和藻类等，已经被研究过的甘油生产菌株很多， 但酵母菌居多。亚硫酸盐法发酵生产甘油的菌种为酿酒酵母S. cerevisiae，28°C发酵甘油转化率为20% -25%，发酵液中亚硫酸盐法含量高，使得甘油提取困难。碱性法发酵生产甘油使用的菌种为粉状毕赤酵母Pichia farinosa，30°C发酵甘油转化率38% -45%，发酵时间少于120h，发酵液中含盐量多，影响甘油提取。耐高渗酵母法发酵生产甘油，耐高渗透压假丝酵母发酵，甘油转化率为40% -50%，发酵时间96h，发酵液中含盐量少，利于甘油提取。除酵母菌之外，Rohr利用黑曲霉Aspergillus niger发酵甘油的转化率仅为 6%。Neish报道枯草芽胞杆菌B. subtilis发酵生产甘油的转化率为30%左右。Ben-Amotzl 报道利用藻类Dimalielle经光合作用藻内积累的甘油可达4. 4mol/L，但甘油很少向外分泌，生产角度并无优势。其次，甘油发酵过程中的较高能耗也一直是发酵法甘油成本居高不下的原因之一，主要表现在发酵过程中的动力系统和冷热系统使用，动力系统包括压缩空气和搅拌系统的使用，发酵时间越长，动力系统的能耗越大。冷热系统包括蒸汽和冷却水的使用，发酵培养温度要求越低，所使用的冷却水越多，生产成本越高。再次，与其他甘油生产方法相比，发酵法生产的甘油发酵液中含有胶体物质、蛋白质、多糖及单糖等物质，使得减压蒸馏过程中会出现严重结焦、变黑情况，成品甘油质量不高。其提取工艺一般是将成熟发酵液通过板框压滤后，进行适当的浓缩得到粗甘油，进而减压条件下进行蒸馏，脱色脱臭后得到成品甘油。此法得到的成品甘油质量一般只能达到工业甘油的质量标准。经过对现有技术的检索发现，中国专利文献号CN101658M3，
公开日2010_3_3，记载了一种用于调控牛羊围产期能量代谢障碍的微生物饲料添加剂，该技术通过将无机硒源加入到菌剂生产培养基中，使培养基中硒浓度为2 10mg/kg，将克鲁斯假丝酵母、产朊假丝酵母和嗜热链球菌种子液按13 1 2接种于培养基中，培养液与适量的玉米粉混合， 35 40°C烘干即得。但是该现有技术具有以下特点(1)在200g/L初糖的基础上发酵后得甘油含量为67. 26g/L-71. 75g/L，发酵转化率为34% -36%，糖甘转化率较低，( 发酵培养温度为 33°C，时间为120h，培养时间略显较长，发酵过程中的水电成本较高，( 发酵培养基中添加了 40g/L的NaCl，对提高甘油产量会有一定的帮助，但如需对甘油提纯，则会严重影响甘油的提取收率，(4)此技术的最终产品并非成品甘油，发酵后甘油不需要提取，对甘油品质无要求。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种基于克鲁斯假丝酵母的甘油生产工艺，除提高发酵过程中甘油的转化率及最终成品甘油的质量外，还可做到生产过程中节约能源消耗、减少污染物的排放，从而做到节能、减排地生产安全性更高的高品质甘油。本发明是通过以下技术方案实现的本发明涉及一种耐高温的克鲁斯假丝酵母菌株TS1008 (Candida krusei TS1008)，于2011年8月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No: M2011285。保藏地址为中国武汉大学430072。本发明涉及上述突变菌株的获得方式，通过诱变与训育方法的结合，经筛选得到。所述的诱变是指采用紫外灯照射进行诱变，具体步骤为将IOOmL种子培养基 /250mL三角瓶中，挑斜面培养基上保存的克鲁斯假丝酵母菌1环，30-350C，90-120r/min培养16-20h，离心收集菌体，无菌生理盐水洗涤数次，稀释后备用，取4mL菌悬液，15-20W紫外灯功率，照射10-20s。所述的种子培养基的组分含量为葡萄糖30_45g/L，酵母10_16g/L，植物蛋白 12-22mL/L，余量为水，pH 4. 0-5. 5。所述的训育是指将诱变后的菌悬液接入含400_500g/L葡萄糖和70_90g/L渗透剂的筛选培养基中，黑纸包皿，350C -45°C恒温培养46-52h，重复3次。所述的筛选培养基的组分含量为400-500g/L葡萄糖或70_90g/L渗透剂，麦芽汁 200-300mL，琼月旨 15_20g/L，余量为水，pH 5. 0-6. 5。所述的筛选是指挑选大菌落摇瓶发酵，测定生物量、糖甘转化率、发酵时间以及残糖量，综合筛选确定甘油高产突变菌株，用斜面培养基上进行菌种短期保藏。
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所述的斜面培养基的组分含量为麦芽汁200_300mL/L，琼脂15_20g/L，余量为水；本发明涉及上述耐高温克鲁斯假丝酵母突变菌株的甘油生产应用，通过将所述突变菌株好氧发酵得以实现。所述的好氧发酵是指通过培养突变菌株得到成熟发酵液后通过膜过滤系统逐级除去杂质，再使用反渗透进行脱水浓缩，得到粗甘油，经减压蒸馏提取，脱味、脱色得到成品甘油。所述的培养是指将突变菌株接种于种子培养基中在35°C _45°C的环境下培养 16h得到种子液，然后转接到发酵培养基中好氧发酵50-80h，得到成熟发酵液。所述的接种是指接种量8% -15% (ν/ν)。所述的发酵培养基的组分含量为葡萄糖200_400g/L，酵母6_12g/L，植物蛋白 200-300mL/L，余量为水，pH 4. 0-5. 5。所述的好氧发酵是指在20%-40%糖液浓度，通风比0. 5-l，35°C_45°C温度下发酵 50-80h。所述的减压蒸馏是指真空度为2mmHg-120mmHg的减压蒸馏提取。本发明的有益效果主要体现在(1)本发明所使用菌种为耐高温克鲁斯假丝酵母 (Candidakrusei TS1008)，为独立开发菌种，该菌种具有耐高温、耐高渗透，在低糖的情况下对甘油的同化作用不强等优良特性。(2)发酵工艺35°C _45°C温度下发酵培养，不易发生染菌，发酵时间降低为50-80h，同时发酵过程有效的节约了用电量和冷却水用量。成熟发酵液中甘油含量达到10%-16%，糖甘转化率为45%-65%，残糖降为0.2%以下，甘油基本无同化现象出现。(3)后提取工段膜过滤浓缩过程无废水排放，降低了环境成本；浓缩温度为室温，无化学反应，成熟发酵液残糖降为0.2%以下，减少了蒸馏结焦现象，对成品甘油品质有保障。成品甘油的质量符合美国和欧洲药典级甘油标准(甘油含量不低于99.7%)， 较以往发酵法生产的甘油质量更高。
图1传代次数对TS1008生产甘油发酵性能的影响示意图。
具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1 耐高温克鲁斯假丝酵母的获得高产甘油突变菌株的筛选(1)菌悬液制备与诱变处理100mL种子培养基/250mL三角瓶中，挑斜面菌1环， 30-35 V，90-120r/min培养16_20h，离心收集菌体，无菌生理盐水洗涤数次，稀释后备用。 取4mL菌悬液，15-20W紫外灯功率，照射10_20s。(2)初筛与复筛将诱变后的菌悬液接入含400_500g/L葡萄糖和70_90g/L渗透剂的筛选培养基中，黑纸包皿，35°C _45°C恒温培养46-52h，重复3次。挑选大菌落摇瓶发酵，测定生物量、糖甘转化率、发酵时间以及残糖量，综合筛选确定甘油高产突变菌株。(3)突变菌株的遗传稳定性对选择出的突变株传代10代，分别测定1、2、4、6、8、10代的糖甘转化率、发酵时间以及残糖量，以确定其遗传稳定性。结果如图1所示，Candida krusei TS1008的发酵性能
遗传稳定。考察出发菌株与突变菌株的生产甘油的发酵性能(糖甘转化率、发酵时间及残糖量)。结果如表1所示，突变株的产甘油能力要强于出发菌株，糖甘转化率提高了 25%，且发酵时间大大降低，残糖量也降为小于0. 5%。表1出发菌株与突变菌株发酵甘油性能比较
权利要求
1.一种克鲁斯假丝酵母菌株TS1008 (Candida krusei TS1008)，其特征在于，于2011 年8月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No :M2011285。
2.一种根据权利要求1所述的耐高温克鲁斯假丝酵母菌株的制备方法，其特征在于， 通过诱变与训育方法的结合，经筛选得到。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述的诱变是指采用紫外灯照射进行诱变。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征是，所述的诱变为将IOOmL种子培养基/250mL三角瓶中，挑斜面培养基上保存的克鲁斯假丝酵母菌1环，30-350C，90-120r/min 培养16-20h，离心收集菌体，无菌生理盐水洗涤数次，稀释后备用，取4mL菌悬液，15-20W紫外灯功率，照射10-20s。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述的训育是指将诱变后的菌悬液接入含400-500g/L葡萄糖和70-90g/L渗透剂的筛选培养基中，黑纸包皿，35°C _45°C恒温培养46-52h，重复3次。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是，所述的筛选培养基的组分含量为 400-500g/L葡萄糖或70-90g/L渗透剂，麦芽汁200_300mL，琼脂15_20g/L，余量为水，pH 5. 0-6. 5。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是，所述的种子培养基的组分含量为葡萄糖 30-45g/L，酵母 10-16g/L，植物蛋白 12_22mL/L，余量为水，pH 4. 0-5. 5。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是，所述的筛选培养基的组分含量为 400-500g/L葡萄糖或70-90g/L渗透剂，麦芽汁200_300mL，琼脂15_20g/L，余量为水，pH 5. 0-6. 5。
9.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征是，所述的斜面培养基的组分含量为 麦芽汁200-300mL/L，琼脂15_20g/L，余量为水。
10.一种根据上述任一权利要求所述耐高温克鲁斯假丝酵母突变菌株的应用，其特征在于，将该突变菌株用于甘油生产，通过将所述突变菌株好氧发酵得以实现。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征是，所述的好氧发酵是指通过培养突变菌株得到成熟发酵液后通过膜过滤系统逐级除去杂质，再使用反渗透进行脱水浓缩，得到粗甘油，经减压蒸馏提取，脱味、脱色得到成品甘油。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征是，所述的培养是指将突变菌株接种于种子培养基中在35°C _45°C的环境下培养16h得到种子液，然后转接到发酵培养基中好氧发酵 50-80h，得到成熟发酵液。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征是，所述的接种是指接种量8%-15%(ν/ν) O
14.根据权利要求12所述的应用，其特征是，所述的发酵培养基的组分含量为葡萄糖 200-400g/L，酵母 6-12g/L，植物蛋白 200_300mL/L，余量为水，pH 4.0-5.5。
15.根据权利要求12所述的应用，其特征是，所述的好氧发酵是指在20%-40%糖液浓度，通风比0. 5-1, 350C _45°C温度下发酵50_80h。
16.根据权利要求11所述的应用，其特征是，所述的减压蒸馏是指真空度为 2mmHg-120mmHg的减压蒸馏提取。
全文摘要
一种微生物甘油生产技术领域的基于克鲁斯假丝酵母的甘油生产工艺，该克鲁斯假丝酵母菌株TS1008(Candida krusei TS1008)于2011年8月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M2011285；本发明除提高发酵过程中甘油的转化率及最终成品甘油的质量外，还可做到生产过程中节约能源消耗、减少污染物的排放，从而做到节能、减排地生产安全性更高的高品质甘油。
文档编号C12N13/00GK102277307SQ20111025567
公开日2011年12月14日 申请日期2011年8月31日 优先权日2011年8月31日
发明者史其峰, 姜耀明 申请人:上海天源植物制品有限公司