专利名称：革胡子鲶生长激素基因表达定量pcr分析中用于内参基因扩增的引物序列的利记博彩app
技术领域：
本发明属于机理研究的分子生物学技术领域。特别涉及一种革胡子鲶(Clarias gariepinus)在养殖过程中与生长相关的重要内分泌因子——革胡子鲶生长激素基因表达定量PCR分析中用于内参基因扩增的引物序列。
背景技术：
革胡子鲶具有耐低氧能力强、生长快、疾病少等特点，是一种发展前景良好的水产养殖品种，在国内外养殖非常普遍。在食用价值上该鱼具有蛋白质含量高、营养丰富、肉味鲜美，刺少肉多的特点，并且具有滋补功效，对于手术伤口愈合有显著的辅助治疗作用。国内外对革胡子鲶的研究主要集中在人工繁殖和苗种培育、养殖模式及其养殖技术的研究， 而对革胡子鲶的基础生物学方面的研究报道极少，主要有对其性激素、组织对氨的积累、对水中某些化学物质的组织病理学反应以及对水中重金属离子的积累等研究。而对革胡子鲶生长迅速、抗逆性强的机理的基础研究未见报道。鱼类的生长与其他脊椎动物相同，是一个复杂的生物代谢过程，受基因型、激素、 营养、环境等多方面的影响。对动物生长机理的研究其首选是从生长轴入手，生长轴是动物体内从下丘脑——垂体——靴器官的一系列激素及其受体所组成的神经内分泌系统。其中，生长激素(GH)是调控脊椎动物生长的重要内分泌因子，也是研究动物生长最重要的因子。GH除了对鱼类的生长有很强的促进作用外，同时对鱼类的免疫系统、生殖生理及海水适应性也有着重要的影响。此外还有研究显示GH基因多态性与动物的生产性能有关。从鱼类生长轴中的关键因子GH入手，通过GH基因表达的实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)分析，探讨高密度养殖革胡子鲶快速生长的机理。对于基因表达的qPCR分析，既要有拟分析的目标基因，又要有适宜的内参基因。常用的内参基因有beta-actirulSS rRNA和GAPDH基因。在qPCR中，引物序列对产物的特异性和有效扩增来说至关重要。只有适宜的寡核苷酸序列，在qPCR中同时满足下述3个条件第一，利用较高浓度cDNA (如反转录后稀释5 10倍的cDNA)在进行qPCR时Ct值应小于18 20 ；第二，每个反应的熔解曲线应为1个峰；第三，通过建立标准曲线得出的扩增效率应在90 105% (标准曲线的R2 值应大于0. 98，重复样本Ct值的标准差应彡0. 5)。此时的寡核苷酸序列才能作为qPCR的引物。尽管qPCR技术已经成熟，目前已成为不同样本间进行基因表达水平定量差异比较的权威性方法。在过去的10年间，该方法迅速流行，出版的文章超过2万余篇，涉及医学、 环境和农业研究。但在应用此技术的实验过程中，需要研究人员自己设计并检测引物是否可用于qPCR。目前没有革胡子鲶相关目标基因表达qPCR分析适宜的引物核苷酸序列，特别是用于内参基因扩增的弓I物核苷酸序列。
发明内容
本发明目的是提供一种革胡子鲶生长激素基因表达定量PCR(qPCR)分析中用于内参基因扩增的引物核苷酸序列，提供有利于对革胡子鲶生长迅速的机理的基础研究的工具。本发明设计并检测了 2对目标基因(GH)和4对内参基因(beta-actin和18S rRNA 各2对)弓丨物序列，其中1对目标基因和2对内参基因的引物符合qPCR的要求。本发明的优点在于内参基因扩增的引物应用广，不仅可以用于革胡子鲶的GH基因表达分析，理论上可用于该种鱼类的任一基因的qPCR分析；此外，GenBank检索认为，申请的2对内参基因的扩增引物，还可用于其他一些鲶形目鱼类的基因表达的qPCR分析。这一发明为革胡子鲶以及几种鲶形目鱼类的基础研究奠定了基础。本发明具体内容一种革胡子鲶GH基因表达qPCR分析时用于内参基因(18S rRNA)扩增的2对引物的核苷酸序列，其特征见表1表1申请专利的引物核苷酸序列信息
引物对引物名称引物序列5’—3’引物的碱基数bp第1对q-18SFlATTACCCATTCCCGACAC18q-18S RlACGCTCATTCCGATTACA18第2对q-18S F4 q-18SR4GCCGTCAAACTCGCCTGAATACCT AAATGCTTTCGCTTTCGTCCGTCT24 24表中的两对引物不仅可作为革胡子鲶GH基因表达qPCR分析时内参基因(18S rRNA)的扩增引物，而且可作为革胡子鲶所有待检目标基因表达qPCR分析时，以18S rRNA 为内参基因的扩增引物。表中的两对引物不仅可应用于革胡子鲶的研究，还可应用于其它一些鲶形目鱼类的待检目标基因表达qPCR分析时以18S rRNA作为内参基因的研究。革胡子鲶GH基因表达qPCR分析时用于内参基因(18S rRNA)扩增的2对引物核苷酸序列的利记博彩app一、总体RNA的提取应用Trizol试剂提取单个垂体的总RNA，经琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测， 分析其完整性和纯度。
图1琼脂糖凝胶电泳结果显示RNA样本的^S/18S rRNA的条带亮度的比值在1 2之间，提示RNA样本的完整性较好；而表2中RNA样本的0D26_D28(1和OD26tl/ OD230的比值均在1. 8 2. 0之间，表明这两个RNA样本没有蛋白和酚的污染，均可用于qPCR 实验。表2总RNA的分光光度计检测结果
权利要求
1. 一种革胡子鲶生长激素基因表达定量PCR分析中用于内参基因扩增的引物序列，其特征是引物对引物名称引物序列5’—3’引物的碱基数bp第1对q-18SFlATTACCCATTCCCGACAC18q-18S RlACGCTCATTCCGATTACA18第2对q-18S F4 q-18SR4GCCGTCAAACTCGCCTGAATACCT AAATGCTTTCGCTTTCGTCCGTCT24 24
2.根据权利要求1所述的革胡子鲶生长激素基因表达定量PCR分析中用于内参基因扩增的引物序列，这两对引物不仅可作为革胡子鲶GH基因表达qPCR分析时内参基因(18S rRNA)的扩增引物，而且可作为革胡子鲶所有待检目标基因表达qPCR分析时，以18S rRNA 为内参基因的扩增引物。
3.根据权利要求1所述的革胡子鲶生长激素基因表达定量PCR分析中用于内参基因扩增的引物序列，这两对引物不仅可应用于革胡子鲶的研究，还可应用于其它一些鲶形目鱼类的待检目标基因表达qPCR分析时以18S rRNA作为内参基因的研究。
4.革胡子鲶GH基因表达qPCR分析时用于内参基因(18SrRNA)扩增的两对引物核苷酸序列的利记博彩app一、总体RNA的提取应用Trizol试剂提取单个垂体的总RNA，经琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测，分析其完整性和纯度。琼脂糖凝胶电泳结果显示RNA样本的^S/18S rRNA的条带亮度的比值在 1 2之间，提示RNA样本的完整性较好；分光光度计检测两个RNA样本的0D26_D28(1和OD26tl/ OD230的比值分别为1. 89和1. 99以及1. 96和2. 00，即两个RNA样本的OD26qaii28q和0D26(1/。D23。 的比值均在1. 8 2. O之间。表明这两个RNA样本没有蛋白和酚的污染，均可用于qPCR实验。二、RNA的反转录将上述1个RNA样本反转录成cDNA第一条链(RevertAid cDNA第一条链合成试剂盒)，用于所设计引物的评估。三、引物的设计与常规PCR评估1). GH、18S rRNA和beta-actin基因片段扩增引物的设计本试验中待检目标基因为GH，拟用18S rRNA或beta-actin作为内参基因。GH基因扩增引物根据本实验室克隆的革胡子鲶GH全长cDNA(GenBank检索号FJ823972)、18S rRNA和beta-actin基因的扩增引物分别根据GenBank检索的18S rRNA (GenBank检索号 AJ876383)和 beta-actin(GenBank 检索号腿76拟99)序列，应用软件 Primer 5. O 设计。 根据qPCR引物设计的基本原则，从设计的数十对引物中预选出GH、18S rRNA和beta-actin 扩增的引物各2对，并由上海生工生物工程有限公司合成；其引物信息如下表。
全文摘要
一种革胡子鲶GH基因表达qPCR分析时用于内参基因(18S rRNA)扩增的2对引物的核苷酸序列，两对引物不仅可作为革胡子鲶GH基因表达qPCR分析时内参基因(18S rRNA)的扩增引物，而且可作为革胡子鲶所有待检目标基因表达qPCR分析时，以18SrRNA为内参基因的扩增引物。两对引物不仅可应用于革胡子鲶的研究，还可应用于其它一些鲶形目鱼类的待检目标基因表达qPCR分析时以18S rRNA作为内参基因的研究。
文档编号C12Q1/68GK102321624SQ201110252308
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月30日 优先权日2011年8月30日
发明者何静慧, 徐敏, 王晓梅, 王茜, 郭永军 申请人:天津农学院