专利名称：人抗凝血酶Ⅲ转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法
技术领域：
本发明属于对转基因动物环境安全的检测和评价领域，具体涉及一种人抗凝血酶 III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法。
背景技术：
随着生物技术的快速发展，转基因动物研究的不断深入和加快，转基因育种成为培养新品种的重要途径，商业化转基因动物即将面世的同时，与转基因相伴而生的潜在的安全问题已引起世界各国的关注和重视[1_2]。转基因动物是通过基因工程技术使生物遗传信息发生了转移、替换、融合和表达的遗传工程体，由于外源基因的插入，打破了原有的育种规律，改变了物种多样性局面，可能发生潜在的生物环境安全问题，造成重大经济损失， 对人类生存造成威胁。因此，对转基因动物环境安全的检测和评价有利于保证人类健康和生态环境安全、促进转基因动物相关技术的快速健康发展。基因漂移是指转基因生物中转入的外来基因，转移到相邻的其他生物之中，从而改变其他生物的基因组成[3]。转基因植物发生基因漂移可能引起的生态环境安全性问题已经引起广泛关注，而转基因动物发生基因漂移的可能性一直没有被重视。因而研究转基因动物发生基因漂移的可能性对于评价转基因动物环境安全性具有重要的意义。本研究建立了实时荧光定量PCR技术检测抗凝血酶III的技术方法，并充分发挥了申请人青岛森淼实业有限公司的转基因羊资源优势M，开展抗凝血酶III (ATIII)转基因羊环境安全性评估的初步研究。
发明内容
本发明采用如下技术方案实施研究一种人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法，其特征是包括如下步骤引物及Taqman探针设计，血液基因组DNA的制备，ATIII基因的扩增，ATIII基因的克隆，荧光定量PCR检测和敏感性评价及定量分析；其中，(1)引物及Taqman探针设计①利用Primer Primer 5. 0软件分析人ATIII基因的序列NM_000488，设计并合成用于构建标准质粒的人ATIII特异性引物F5’ -gtgataggaactgtaacct-3' ；R 5' -cggccagcaatcacaacag-3',②利用 Applied Biosystems 公司的 Primer Express 3. 0 软件设计 Taqman 探针和引物F 5 ’ -TGTGATAGGAACTGTAACCTCTGG-3’，R 5，-GCTTGGCTGTGCAGATGTC-3，，Taqman 探针5，-(FAM)TGTCCTTGCTGCTCATTGGCTTCTG(Eclipse)-3，，③利用BLAST在线软件分析设计引物和探针序列的特异性；
(2)血液基因组DNA的制备血样采用EDTA抗凝，血液置于1. 5ml离心管中4°C保存备用；利用QIAGEN离心柱血液基因组提取试剂盒提取血液基因组；(3)ATIII基因的扩增①以编号A22的转ATIII基因羊血液基因组为模板；②PCR扩增体系如下DNA模板 10ng，IOXEx Taq bufer 2· 5μ l，dNTP 2. 5mM 5μ1，引物F IOpM ，引物 R IOpM ，Taq 酶 0. 2 μ 1，ddH20 补至Ij 25 μ 1。反应条件为 94°C 5min ;95°C 30S，55°C 30S， 72°C 1. 5min，25个循环；72°C IOmin ；扩增片段大小为1263bp,以琼脂糖凝胶电泳分析扩增效果并回收；G)ATIII基因的克隆利用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒将ATIII基因PCR扩增产物回收，胶回收产物连接到PMD18T载体中，转化E.coli DH5 α，挑取单克隆，PCR鉴定，并测序鉴定；(5)质粒标准品浓度的计算将上述质粒用紫外分光光度计测定260nm与280nm波长下的OD值，计算DNA浓度并判断其纯度，然后转换成质粒的拷贝数；(6)荧光定量PCR检测；(7)敏感性评价及定量分析；(8)特异性评价上述的人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法，其特征是所述的与标准品对照计算每微升质粒拷贝数的方法是①制备质粒标准品；标准品作10倍梯度稀释，_20°C保存备用；②样品质粒用紫外分光光度计测定^Onm与^Onm波长下的OD值，然后按照下面的公式转换成质粒的拷贝数每微升质粒拷贝数=(质量/ 分子量)X (6. 02 X IO23)=[质粒浓度(ng/Ι μ 1) X 1 μ ] X 10_9/2404697 ]X (6. 02 X IO23个/mol)，其中6. 02 X IO23是阿佛加德罗常数；2404697是标准质粒的分子
Mo上述的人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法，其特征是所述的荧光定量PCR检测的方法是上述的人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法，其特征是所述的敏感性评价及定量分析的方法是25 μ 1 反应体系包括 TaqMan Universal PCR Master Mix 缓冲液 12. 5 μ 1，血样 DNA模板10ng，引物为300nM、探针为250nM，体系用ddH20补齐；特异性反应条件为二温循环，即95°C IOmin ；95°C 15s,60°C lmin, 40个循环；用矩阵法筛选引物和探针的最佳使用量。上述的人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法，其特征是所述的敏感性评价及定量分析的方法是RNA标准品经1/10系列稀释，利用建立的检测体系对不同浓度的RNA标准品进行荧光定量PCR检测，以确定检测灵敏度；同时用标准品检测扩增曲线获得标准曲线，对检测样品进行定量分析。上述的人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法，其特征是所述的特异性评价的方法是利用建立的检测体系对编号为A22的转人ATIII基因羊血液基因组，非转基因羊血液基因组，和其它对照动物血液基因组，进行荧光定量PCR检测，以验证其特异性；上述的人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法，其特征是所述的采取动物血液基因组样品的方法是采用颈静脉取血的方法分别采集转ATIII基因羊血液基因组血液样品，转乙肝表面抗原基因羊血液样品，转干扰素转基因羊血液样品，野生型山羊血液样品，家养犬静脉血液样品，试验用小鼠静脉血液样品；以及采用翅静脉采血法采取家养鸡血液样品和家养鹅血液样品；建立上述各动物血液基因组，进行荧光定量PCR检测，以验证人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法的特异性。本发明的优点本发明的技术方案建立了灵敏、特异的实时荧光定量PCR检测人ATIII基因的技术方法，最低能检测到Icopy的ATIII基因，并且检测特异性高。在此基础上，开展了抗凝血酶III转基因羊环境安全性评估的初步研究。完成了与ATIII转基因羊密切接触的同种和异种动物血液基因组中ATIII基因的检测工作(共57 个样本)。结果表明人ATIII基因没有在转基因羊和非转基因羊及其它动物间发生漂移，提示转基因羊对于环境是安全的。
图1是实施例2的PCR克隆人ATIII基因片段示意图；图2是实施例3的荧光定量PCR检测ATIII标准质粒(1到1 X IO9Copy/ μ 1)的扩增曲线示意图；图3是实施例3的定量PCR检测ATIII的标准曲线示意图；图4是实施例3的定量PCR的特异性试验示意图；Α、转ATIII基因羊血液基因组为模板；B、以非转基因羊和小鼠血液基因组为模板；图5是实施例4的定量PCR检测野生型山羊、β -干扰素和乙肝表面抗原转基因羊血液样品中ATIII基因示意图；图6是实施例4的定量PCR检测狗、鸡和鹅血液样品中ATIII基因示意图；图7是实施例4的FQ-PCR检测ATIII转基因羊血液样品中ATIII基因示意图。图1中，泳道M :DL2000分子量标准品；泳道1 :ATIII基因PCR扩增片段；图中显示ATIII基因被成功克隆。图2中，纵坐标是相对荧光强度，横坐标是循环数；图中显示扩增曲线呈标准的S 型，表明PCR反应效率高。图3中，纵坐标是Ct值，横坐标是模板拷贝数的对数；图中显示荧光定量PCR的灵敏度可以达到lcopy/μ 1，但是当浓度为lcopy/μ 1时，Ct值的重复性较差；标准曲线的斜率为-3. 072，R2 为 0. 992.图4中，纵坐标是相对荧光强度，横坐标是循环数；图中显示只有转ATIII基因的羊血液基因组中能检测到ATIII基因。图5中，纵坐标是相对荧光强度，横坐标是循环数；图中显示野生型山羊血液中、 白介素6和乙肝表面抗原转基因羊血液中均未检测到AT3基因。图6中，纵坐标是相对荧光强度，横坐标是循环数；图中显示狗、鸡和鹅血样中也未检测到AT3基因的存在。图7中，纵坐标是相对荧光强度，横坐标是循环数；图中显示转ATIII基因羊血液中可以检测到ATIII基因。
具体实施例方式试验材料及仪器野生型山羊、转乙肝表面抗原基因羊、转β-干扰素转基因羊、转ATIII基因羊、 狗、鸡和鹅的血样采集于青岛森淼实业有限公司的转基因动物养殖基地；血液基因组提取试剂盒，购自美国QIAGEN公司；TaqMan Universal PCR Master Mix，_ 自__ Applied Biosystems ^W]；Taqman探针及引物由大连Takara公司合成；其它普通生化试剂均为国产分析纯。美国Applied Biosystems 公司 7500 荧光定量 PCR 仪和 9700 型 PCR 仪。实施例1引物及Taqman探针设计利用I^rimer 5. 0软件分析人ATIII基因的序列(NM_000488)，设计并合成用于构建标准质粒的人ATIII特异性引物(F :5’ -gtgataggaactgtaacct-3' ；R 5' -cggccagcaatcacaacag-3‘)。禾Ij用 Applied Biosystems 公司的 Primer Express 3. 0 软件设计 iTaqman 探针和引物(F:5，-TGTGATAGGAACTGTAACCTCTGG-3，；R :5，-GCTTGGCTGTGCAGATGTC-3，Jaqman 探针5，-(FAM)TGTCCTTGCTGCTCATTGGCTTCTG(Eclipse)-3，)。利用BLAST在线软件分析设计引物和探针序列的特异性。引物及探针委托大连Takara公司合成。实施例2转基因羊血液基因组DNA制备、DNA扩增及克隆1.转基因羊血液基因组DNA的制备血样采用EDTA抗凝，血液置于1. 5ml离心管中4°C保存备用。利用QIAGEN离心柱血液基因组提取试剂盒提取血液基因组。2.转基因羊ATIII基因的扩增以转ATIII基因羊(试验编号A2》血液基因组为模板。PCR扩增体系如下25 μ 1 的体系，DNA 模板 3 μ 1，IOXEx Taq bufer 2. 5 μ 1, dNTP(2. 5mM) 2. 5 μ 1, 引物 F(IOpM)，引物 R(IOpM)，Taq 酶 0.2 μ 1，ddH20 补到 25μ1。反应条件为 94°C 5min ； 95°C 30S，55°C 30S，72°C 1. 5min，25 个循环；72°C IOmin0 扩增片段大小为 U63bp，以琼脂糖凝胶电泳分析扩增效果并回收。3.转基因羊ATIII基因的克隆利用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒将ATIII基因PCR扩增产物回收(具体操作见试剂盒说明书)，胶回收产物连接到PMD18T载体中，转化E.coli DH5ci，挑取单克隆，PCR鉴定，并测序鉴定。4.质粒标准品浓度的计算将上述质粒用紫外分光光度计测定^Onm与^Onm波长下的OD值，判断其纯度 (0D :260nm/0D280nm > 1. 8者为纯品)，然后按照下面的公式转换成质粒的拷贝数每微升质粒拷贝数=(质量/分子量)X (6. 02 X IO23)=[质粒浓度(ng/Ι μ 1) X 1 μ ] X 10_9/240 4697] X (6. 02Χ，其中:6. 02 X IOm是阿佛加德罗常数；2404697是标准质粒的分子量。标准品作10倍梯度稀释，-20°C保存备用。实施例3荧光定量PCR检测及分析1.荧光定量PCR检测25 μ 1 反应体系包括 TaqMan Universal PCR Master Mix 缓7中液 12. 5 μ 1，血样 DNA模板10ng，引物和探针浓度按具体实验添加，体系用ddH20(双蒸水double distilled water)补齐。特异性反应条件为二温循环(95°C IOmin ；95°C 15s，60°C lmin, 40cycle)。用矩阵法筛选引物和探针的最佳使用量。2.敏感性评价及定量分析RNA标准品经1/10系列稀释，利用建立的检测体系对不同浓度的RNA标准品进行荧光定量PCR检测，以确定检测灵敏度。同时用标准品检测扩增曲线获得标准曲线，对检测样品进行定量分析。3.特异性评价利用建立的检测体系对转ATIII基因羊血液基因组(试验编号A22)、非转基因羊血液基因组(转基因羊养殖基地外采集)和小鼠血液基因组等进行荧光定量PCR检测，以验证其特异性。实施例4样品检测利用一次性注射器，采用颈静脉取血的方法采集山羊血液样品。共采集野生型山羊血样9个(山羊编号为11、64、82、83、86、87、2-5、3-10)；采集转乙肝表面抗原基因羊血样10个(编号为H11、H16、H17、H26、H42、H48、H50、 H55、H65、H66)；采集转β-干扰素转基因羊血样10个(编号为Β5、Β10、Β17、Β18、Β19、Β20、 Β21、Β22、Β23、Β24)；采集转ATIII 基因羊血样 8 个(编号为 Α08、Α23、Α38、Α39、Α41、Α43、Α46、Α54)；采用腿静脉采血方法，采集狗静脉血样4个；采用翅静脉采血方法，采集鸡血样8个、鹅血样8个。提取血液基因组，做模板，进行荧光定量PCR检测，以评价ATIII基因是否发生漂移。结果与分析1人ATIII标准质粒的构建以转ATIII基因羊(试验编号Α22)血液基因组为模板，PCR扩增得到1300bp的片段参见附图1，胶回收后克隆到PMD18T载体中。转化E. coli DH5 α，挑取2个单克隆，PCR 鉴定均为阳性(结果未给出)，进一步测序证明序列完全正确。2引物和探针浓度的优化以相同量的阳性核酸为模板，引物和探针的浓度分别选取了 100、150、200、250和 300ηΜ五个浓度梯度，反应条件为二温循环(95°C IOmin ；95°C 15s，60°C lmin，40cycle)，利用矩阵法对引物和探针的浓度进行优化，以阈值(Ct值)最小的条件为最佳反应条件。在试验设计的范围内，当引物和探针的浓度增加，Ct值相应减小，而引物和探针的浓度在250 和300nM时Ct值没有明显变化。因而我们选择引物为300nM、探针为250nM作为后续的试验条件。3.标准曲线及荧光定量PCR灵敏度以十倍稀释的标准质粒(1到lX109cOpy/y 1，共十个梯度)为模板进行扩增的扩增曲线参见附图2，标准曲线参见附图3。结果表明，FQ-PCR的灵敏度可以达到lcopy/μ 1，但是当浓度为lcopy/μ 1时，Ct 值的重复性较差；标准曲线的斜率为-3. 072，R2为0. 992。附图4定量PCR的特异性试验中，1 以转ATIII基因羊血液基因组为模板；2 以非转基因羊血液基因组为模板；3 以小鼠血液基因组为模板。为了研究FQ-PCR检测人ATIII基因的特异性，同时检测了转ATIII基因羊血液基因组(试验编号A22)、非转基因羊血液基因组和小鼠血液基因组，每个反应加入IOng基因组DNA。如附图4所示，只有转ATIII基因的羊血液基因组中能检测到ATIII的表达，证明了 FQ-PCR的特异性。附图5中显示，定量PCR检测野生型山羊、β-干扰素和乙肝表面抗原转基因羊血液样品中ATIII基因利用QIAGEN离心柱血液基因组提取试剂盒提取血液基因组，提取的基因组利用紫外分光光度计测定0拟eOnm/OD^Onm，确定基因组DNA的纯度和浓度，通过琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。检查结果表明，提取的基因组DNA无RNA、蛋白污染，无降解。利用上面建立的转基因羊血液中人ATIII实时荧光定量PCR检测方法，检测血液基因组中ATIII基因DNA的含量。检测结果显示，野生型山羊血液中、β-干扰素和乙肝表面抗原转基因羊血液中均未检测到ATIII基因；同法，附图6中显示，定量PCR检测狗、鸡和鹅血样中也未检测到ATIII基因的存在；同法，附图7中显示，所有ATIII转基因羊血样中均检测到ATIII基因。结果表明，ATIII转基因羊的外源基因(人ATIII基因)在种内和种间均未发生基因横向转移。参考文献(References)[1]Adow D A, Zwahlen C. Assessing environmental risks oftransgenic plants[J], Ecology Lette，2006，(9) :196-214[2]施巧婷，魏成斌，李建林，等.转基因生物的安全性[J].中国农学通报，2009，25 66-70Shi Qiao-ting, Wei Cheng-bin,Li Jian-Lin, et al. The Safety of Transgenic Biology[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，2009，25 :66-70[3]Top E，Mergeay M，Springael D，et al. Gene escape model transfer of heavy metal resistance genes from Escherichia coli to Alcaligenes eutrophus on agar plates and in soil samples[J]. Applied and environmental microbiology, 1990, 56 :2471-2479[4]邹贤刚，袁三平，鲜建，et al.转基因克隆奶山羊大量生产重组人的抗凝血酶 III 蛋白质(rhATIII) [J].生物工程学报，2008，M :117-123Xou Xian-gang，Yuan San-ping, Xian Jian，et al. Large Scale Production of Recombinant Human Antithrombin III (rhATIII)in Transgenic Cloned Goats[J]. Chinese Journal of Biotechnology，2008，24 :117-123[5] Singh 0V, Ghai S，Paul D，et al. GeneticalIy modified crops success，safety assessment，and public concern[J]. Applied microbiology and biotechnology，2006，71 :598-607[6]Lee D，Natesan E. Evaluating genetic containment strategies for transgenic plants[J]. Trends in biotechnology,2006, 24 :109-114[7]Velkov W, Medvinsky AB, Sokolov MS, et al. Will transgenic plants adversely affect the environment ？ [J]. Journal ofbiosciences，2005，30 :515-548 。
权利要求
1.一种人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法，其特征是包括如下步骤引物及Taqman探针设计，血液基因组DNA的制备，ATIII基因的扩增，ATIII基因的克隆，荧光定量PCR检测和敏感性评价及定量分析；其中，(1)引物及Taqman探针设计①利用PrimerPrimer 5. 0软件分析人ATIII基因的序列NM_000488，设计并合成用于构建标准质粒的人ATIII特异性引物F5’ -gtgataggaactgtaacct-3' ；R 5' -cggccagcaatcacaacag-3',②利用AppliedBiosystems公司的Primer Express 3· O软件设计Taqman探针和引物F :5’ -TGTGATAGGAACTGTAACCTCTGG-3，，R 5' -GCTTGGCTGTGCAGATGTC-3，，Taqman探针5，-(FAM)TGTCCTTGCTGCTCATTGGCTTCTG(Eclipse)-3，，③利用BLAST在线软件分析设计引物和探针序列的特异性；(2)血液基因组DNA的制备血样采用EDTA抗凝，血液置于1. 5ml离心管中4°C保存备用；利用QIAGEN离心柱血液基因组提取试剂盒提取血液基因组；(3)ATIII基因的扩增①以编号A22的转ATIII基因羊血液基因组为模板；②PCR扩增体系如下DNA 模板 10ng，IOXEx Taq bufer 2. 5 μ 1, dNTP 2. 5mM 5 μ 1，引物 F ΙΟρΜ，引物 R ΙΟρΜ, Taq 酶 0· 2μ 1，ddH20 补到 25 μ 1。反应条件为 94 °C 5min ； 95 °C 30S，55°C 30S, 72°C 1. 5min，25个循环；72°C IOmin ；扩增片段大小为1263bp,以琼脂糖凝胶电泳分析扩增效果并回收；G)ATIII基因的克隆利用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒将ATIII基因PCR扩增产物回收，胶回收产物连接到 PMD18T载体中，转化E. coli DH5 α，挑取单克隆，PCR鉴定，并测序鉴定；(5)质粒标准品浓度的计算将上述质粒用紫外分光光度计测定260nm与^Onm波长下的OD值，判断其纯度，然后转换成质粒的拷贝数；(6)荧光定量PCR检测；(7)敏感性评价及定量分析；(8)特异性评价。
2.按照权利要求1所述的人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法， 其特征是所述的与标准品对照计算每微升质粒拷贝数的方法是①制备质粒标准品；标准品作10倍梯度稀释，_20°C保存备用；②样品质粒用紫外分光光度计测定260nm与^Onm波长下的OD值，然后按照下面的公式转换成质粒的拷贝数每微升质粒拷贝数=(质量 / 分子量)X (6. 02 X IO23)=[质粒浓度(ng/Ι μ 1) X 1 μ ] X 10"9/2404697] X ( 6. 02 X IO23个/mol)，其中:6. 02 X IO23是阿佛加德罗常数；2404697是标准质粒的分子量。
3.按照权利要求1所述的人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法， 其特征是所述的荧光定量PCR检测的方法是25 μ 1 反应体系包括 TaqMan Universal PCR Master Mix 缓冲液 12. 5 μ 1，血样 DNA 模板10ng，引物为300nM、探针为250nM，体系用ddH20补齐；特异性反应条件为二温循环，即95°C IOmin ；95°C 15s,60°C lmin，40个循环；弓丨物和探针的用量为矩阵法优化得到的结果。
4.按照权利要求1所述的人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法， 其特征是所述的敏感性评价及定量分析的方法是RNA标准品经1/10系列稀释，利用建立的检测体系对不同浓度的RNA标准品进行荧光定量PCR检测，以确定检测灵敏度；同时用标准品检测扩增曲线获得标准曲线，对检测样品进行定量分析。
5.按照权利要求1所述的人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法， 其特征是所述的特异性评价的方法是利用建立的检测体系对编号为A22的ATIII转基因羊血液基因组，非转基因羊血液基因组，和其它对照动物血液基因组，进行荧光定量PCR检测，以验证其特异性。
6.按照权利要求1所述的人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法， 其特征是所述的采取动物血液基因组样品的方法是采用颈静脉取血的方法分别采集转ATIII基因羊血液基因组血液样品，转乙肝表面抗原基因羊血液样品，转干扰素转基因羊血液样品，野生型山羊血液样品，家养犬静脉血液样品，试验用小鼠静脉血液样品；以及采用翅静脉采血法采取家养鸡血液样品和家养鹅血液样品；提取各种动物血液基因组，进行荧光定量PCR检测，以验证人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法的特异性。
全文摘要
人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法。包括如下步骤引物及Taqman探针设计，血液基因组DNA的制备，ATIII基因的扩增，ATIII基因的克隆，荧光定量PCR检测和敏感性评价及定量分析。为了能够灵敏的检测到微量的ATIII基因，本研究建立了灵敏、特异的实时荧光定量PCR检测人ATIIII基因的技术方法，最低能检测到1copy的ATIII基因，并且检测特异性高。在此基础上，开展了抗凝血酶III转基因羊环境安全性评估的初步研究。完成了与ATIII转基因羊密切接触的同种和异种动物血液基因组中ATIII基因的检测工作(共57个样本)，结果表明人ATIII基因没有在转基因羊和非转基因羊及其它动物间发生漂移，提示转基因羊对于环境是安全的。
文档编号C12Q1/68GK102321761SQ20111025214
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月30日 优先权日2010年9月7日
发明者袁三平, 赵雅琳, 邹贤刚, 顾玉超 申请人:青岛森淼实业有限公司