专利名称：一种Gallinacin-6基因工程抗菌肽生产方法
技术领域：
本发明属于生物技术制药工业中基因工程生产蛋白药物领域，尤其涉及一种利用基因工程重组法方法生产抗菌肽Gallinacin-6的生产方法。
背景技术：
目前养殖业中，由于抗生素泛滥使用，破坏动物肠道微生物菌群平衡，致使潜伏在体内的有害菌群大量繁殖会引起内源感染，并且还导致耐药微生物产生，致使药物剂量加大、治疗周期延长、死亡率增高等问题，而且细菌的耐药性还会向人类的转移，给人类的健 康造成巨大影响。特别在肉鸡养殖中，由于抗生素破坏肠道菌群平衡，产气荚膜梭菌过量繁殖，导致坏死性肠炎病情越发严重。产气荚膜梭菌还是引起人类的食物中毒的主要病原菌之一，目前禽肉加工过程中检出率都较高，高达84%，造成巨大的食品安全问题。抗菌肽被认为是新一代抗生素的理想替代者。抗菌肽是生物体内经诱导产生的一类具有生物学活性的小分子多肽，存在于多种生物体中，是宿主免疫防御系统的一个重要组成部分，具有广谱抗菌、无耐药性及毒副作用等优点。随着研究的不断深入，越来越显示出了其在医学、兽医学等相关领域的独特应用价值。防御素(Defensin)是一类富含半胱氨酸的内源性阳离子多肽，具有较强的杀菌功能，能有效地杀灭细菌、真菌、螺旋体和囊膜病毒，是机体抵御外界病原微生物入侵的最初防御屏障[4-6]。抗菌肽Gallinacin-6,—种鸡β-防御素,前体肽由67个氨基酸残基组成，其cDNA全长为20 Ibp，其成熟肽由40个氨基酸构成，分子量
4.3KD。Gallinacin-6具有抗革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌的能力，能够有效抑制空肠弯杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌等主要食物源性病原体，特别对产气荚膜梭菌抑制效果尤为显著(MIC = 8μ g/mL)，同时具有良好热稳定性和耐酸碱能力，这些特点使得Gallinacin-6在动物疾病防治和饲料添加剂等方面显露出很好的应用前景。然目前从肉鸡提取抗菌肽Gallinacin-6工艺复杂，获取量少，同时还收提取材料限制，无法满足市场需求，提高抗菌肽Gallinacin-6产量是一个急需解决的问题。
发明内容
鉴于上述状况，有必要提供一种工艺简单、产量高的抗菌肽Gallinacin-6的生产方法。一种Gallinacin-6基因工程抗菌肽生产方法,包括下列步骤，抗菌妝Gallinacin-6基因合成根据GENBANK，Gallinacin-6 的氨基酸序列(NCBI 序列号ΝΡ_001001193· I)，选用酵母偏爱密码子设计Gallinacin-6基因，人工合成优化的Gallinacin-6抗菌肽基因；Gallinacin-6基因5’和3’端分别引入Eco RI.Not I内切酶位点，设计合成一对引物F1，R1，用于重组载体及重组酵母菌的鉴定；抗菌肽Gallinacin-6重组酵母表达载体的构建PCR产物和pPIC9K均用Eco RI、Not I双酶切，T4DNA连接酶连接，连接产物转化E. coli DH5 α，重组表达质粒进行PCR、缺失酶切位点鉴定；PCR以及酶切鉴定为阳性的质粒测序，构建正确的重组表达质粒命名为PPIC9K-G6 ；pPIC9K-G6表达载体的转化感受态Pichia pastorisGS115与SacI线性化pPIC9K_G6相混合，转移至预冷的O. 2cm电转杯中，电击，立即加ImL预冷的lmol/L山梨醇，涂布于MD和丽平板，30°C孵化4 5d至平板出现乳白色的酵母转化菌落，筛选都能生长良好的Mut+的菌落，然后依次转移含G418的不同浓度YH)平板上筛选转化子，目的基因高拷贝的重组菌株；采用PCR方法分析Pichia pastoris转化子，以Fl, Rl为引物，以能扩增出149bp的克隆定为阳性转化子；重组Pichia pastoris的诱导表达将筛选到的阳性酵母菌接种到5mL BMGY中，30°C、230r/min振荡培养约22h至0D600达到3 6 ;室温3000r/min离心2min，收集菌体重悬于25mL BMMY培养基，进行诱导表达；28°C、250r/min培养100h，期间每24h补加终浓度为1% (V/V)的甲醇；120h后5000r/min离心IOmin ;收集培养液上清，即获得抗菌肽Gallinacin-6蛋白，分子量4. 3kD,
具有明显抑菌活性。本发明抗菌肽Gallinacin-6是一种性能优良抗菌肽，具有抗革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌的能力，对产气荚膜梭菌抑制效果尤为显著，同时具有良好热稳定性和耐酸碱能力，这些特点使得Gallinacin-6在动物疾病防治和饲料添加剂等方面显露出很好的应用前景。通过采用pPIC9K/Pichia pastoris GS115系统，构建高效表达抗菌肽Gallinacin-6基因工程菌株，大量获得抗菌肽Gallinacin-6，可以减少抗生素使用，健康养殖、食品安全提供强有力的保障。
图I是以重组质粒pPIC9K-G6为模板，用F1、R1引物进行PCR扩增目的基因片段，所得电泳图谱；图2是重组质粒pPIC9K-G6的酶切分析图；图3是重组菌株的PCR分析图；图4是表达蛋白SDS-PAGE电泳图谱；图5是抑菌试验对照图。
具体实施例方式本发明公开一种Gallinacin-6基因工程抗菌肽生产方法，其详细过程如下。抗菌肽基因序列的优化和获得抗菌肽基因序列的优化外源基因的内在特性如密码子偏好性是影响外源蛋白的有效表达重要因素。本发明根据毕赤酵母密码子偏好性，将抗菌肽基因的酵母低频密码子优化成高频密码子，以提高目的蛋白的翻译速度和表达量。抗菌肽基因优化情况如下GAATTCAAA AGAGACACAT TAGCCTGTAG ACAATCTCAT GGATCCTGTA GTTTTGTTGCATGCAGAGCT CCTTCTGTTG
ATATAGGAAC TTGTAGAGGT GGAAAATTGA AGTGCTGCAA ATGGGCTCCA TCAAGTCAATGAGCGGCCGC通过软件分析，在基因序列的5’端和3’端分别加上EcoR I、Not I两个酶切位点。抗菌肽基因序列的合成抗菌肽基因序列由人工完成。合成的抗菌肽基因全序列为GAATTCAAA AGAGACACAT TAGCCTGTAG ACAATCTCAT GGATCCTGTA GTTTTGTTGCATGCAGAGCT CCTTCTGTTGATATAGGAAC TTGTAGAGGT GGAAAATTGA AGTGCTGCAA ATGGGCTCCA TCAAGTCAAT·GAGCGGCCGC毕赤酵母表达载体的构建设计引物根据新合成的序列设计上下游引物F1、R1，及合成通用引物A0X1，新合成的引物序列如下F1 GAATTCAAA AGAGACACAT ；R1 GCGGCCGCTCATTGACTT ；5 ' AOXl GACTGGTTCCAATTGACAAGC ；3/ AOX I :GCAAATGGCATTCTGACATCC。G6基因的克隆首先以合成G6基因为模板，用F1、R1引物进行PCR扩增。PCR反应体系如下
ddH209. 05 μ L
~10XPCR buffer I. 5μ LMg2+0. 9 μ L
dNTP0. 6μ L
~ ΙO. 375 μ L
O. 375 μ L Taq DNA 聚合酶 O. 2 μ L PUC18-T-G62. 0μ L
总体积15 μ L反应条件PCR反应条件94 °C 5min ；94°C 45s，50°C 45s, 72 °C 45s, 25 个循环；72 °C 5min。PCR产物跑0.8%琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带，然后用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收。
PCR产物的纯化与回收将经过初步鉴定后剩余的PCR产物全部跑O. 8%琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带，采用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒进行纯化回收，操作方法如下(I)用琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，然后用干净的手术刀割下含所要回收DNA的琼脂块，放入I. 5mL离心管中。判定DNA片段的位置时，要尽可能使用长波长紫外光，在紫外光下照射的时间应尽可能短。(2)每IOOmg琼脂糖凝胶中或100 μ L的DNA溶液中加入400 μ LBinding Buffer,置于50-60°C水浴中lOmin，每2min混匀一次，以保证凝胶全部融化。(3)将融化的胶溶液转移到套放于2mL收集管的UNIQ-IO柱中，室温放置2min。8000rpm室温离心lmin。适当降低离心转速有助于提高DNA结合率。(4)取下UNIQ-IO柱，倒掉收集管中废液，将UNIQ-IO柱放回收集管中，加入500 μ LWash Solution, IOOOOrpm 室温离心 30s。(5)重复步骤⑷一次。(6)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中废液，将UNIQ-10柱放回收集管中，IOOOOrpm室温尚;L·、15s οG6基因与pPIC9K载体连接将G6基因与pPIC9K载体连接，连接体系如下
权利要求
1.一种Gallinacin-6基因工程抗菌肽生产方法,包括下列步骤， 51:抗菌肽Gallinacin-6基因合成； 52:抗菌肽Gallinacin-6重组酵母表达载体的构建，且构建正确的重组表达质粒命名为 pPIC9K-G6 ； 53pPIC9K-G6表达载体的转化； 54:重组Pichia pastoris的诱导表达。
2.根据权利要求I所述的一种Gallinacin-6基因工程抗菌肽生产方法，其中所述SI过程中包括根据GENBANK，Gallinacin-6的氨基酸序列，其NCBI序列号为NP_001001193. I，选用酵母偏爱密码子设计Gallinacin_6基因，人工合成优化的Gallinacin-6抗菌妝基因；Gallinacin_6基因5’和3’端分别引入Eco RI> Not I内切酶位点，设计合成一对引物Fl，R1，用于重组载体及重组酵母菌的鉴定。
3.根据权利要求2所述的一种Gallinacin-6基因工程抗菌肽生产方法，其中所述S2过程中包括PCR产物和pPIC9K均用Eco RI、Not I双酶切，T4DNA连接酶连接，连接产物转化E. coli DH5 α，重组表达质粒进行PCR、缺失酶切位点鉴定；PCR以及酶切鉴定为阳性的质粒测序，构建正确的重组表达质粒命名为PPIC9K-G6。
4.根据权利要求3所述的一种Gallinacin-6基因工程抗菌肽生产方法，其中所述S3过程中包括感受态Pichia pastorisGSl 15与SacI线性化pPIC9K_G6相混合,转移至预冷的O. 2cm电转杯中，电击，立即加ImL预冷的lmol/L山梨醇，涂布于MD和丽平板，30°C孵化4 5d至平板出现乳白色的酵母转化菌落，筛选都能生长良好的Mut+的菌落，然后依次转移含G418的不同浓度YPD平板上筛选转化子，目的基因高拷贝的重组菌株；采用PCR方法分析Pichia pastoris转化子，以Fl，Rl为引物，以能扩增出149bp的克隆定为阳性转化子。
5.根据权利要求4所述的一种Gallinacin-6基因工程抗菌肽生产方法，其中所述S4过程中包括将筛选到的阳性酵母菌接种到5mL BMGY中，30°C、230r/min振荡培养约22h至0D600达到3 6 ;室温3000r/min离心2min，收集菌体重悬于25mL BMMY培养基，进行诱导表达；28°C、250r/min培养100h，期间每24h补加终浓度为1% (V/V)的甲醇；120h后5000r/min离心IOmin ;收集培养液上清，即获得抗菌肽Gallinacin-6蛋白，分子量4. 3kD,具有明显抑菌活性。
全文摘要
本发明公开一种Gallinacin-6基因工程抗菌肽生产方法，包括下列步骤，S1抗菌肽Gallinacin-6基因合成；S2抗菌肽Gallinacin-6重组酵母表达载体的构建，且构建正确的重组表达质粒命名为pPIC9K-G6；S3pPIC9K-G6表达载体的转化；S4重组Pichia pastoris的诱导表达。本抗菌肽Gallinacin-6的生产方法工艺简单、产量高。
文档编号C12N15/12GK102952804SQ20111025213
公开日2013年3月6日 申请日期2011年8月30日 优先权日2011年8月30日
发明者孙同毅, 张大伟, 王希辉 申请人:青岛根源生物技术集团有限公司