专利名称：一种蛇毒类凝血酶蛋白的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种蛇毒类凝血酶蛋白的制备方法。
背景技术：
心脑血管疾病如脑中风、冠心病以及外周血管血栓等严重影响人们生活质量、并造成沉重经济负担。作为自然界的野生资源之一，毒蛇毒液中含有许多生物活性多肽和蛋白质，包括对机体循环系统有重要影响的组分。利用蛇毒研制开发新的治疗血栓的药物，成为国内外研究的热点之一。基于天然蛇毒资源以及产品纯度方面的限制，单纯依靠改进工艺已经不能满足需要，而通过现代基因工程技术可获得大量的蛇毒重组蛋白，这也符合现代生物药物的发展趋势。同时随着地区城市化及农村经济的发展，蛇类栖息地受到越来越多的破坏，有些蛇类也许在我们获得其基因信息之前就灭绝了。利用宝贵的蛇毒资源造福人类，是具有广泛应用前景。在蝰亚科、蝮亚科等蛇类蛇毒中含有能直接溶解纤维蛋白或纤维蛋白原的酶，如纤维蛋白(原)溶酶(简称纤溶酶)(Fibrinolytic enzyme)、类凝血酶(Thrombin-Iike enzyme)。纤溶酶可以作用于纤维蛋白和纤维蛋白原的A α和Ββ亚基，将纤维蛋白和纤维蛋白原水解成片段而可起到抗凝、溶栓作用。类凝血酶可以水解纤维蛋白原的A链或 B链，且不激活XIII因子，因此产生了非交联的可溶性纤维蛋白单体，使其不能形成血栓， 同时可以大量消耗纤维蛋白原而达到抗凝效果。临床上已经应用的类凝血酶有Ancrod、 Crotalase λ Batroxb in λ Flavoxob in λ Bothromb in 及 Defibrase 等。有的类凝血酶除有抗凝血活性外还有其它活性如出血活性、神经毒性等。研究表明蝮蛇纤溶酶和类凝血酶是一组蛋白水解酶的混合体。由于各种抗凝组分的理化性质比较接近，给分离提纯工作带来一定的困难。目前对蛇毒蛋白的分离纯化方法是利用色谱技术获得单一组分，然后通过不同的生化实验来确定所得蛋白组分的生物学特性。抛开烦琐的蛋白质纯化不言，就是确定所得蛋白的生化特性也颇为困难。因此有必要应用基因工程方法，来获得具有重要生物活性的蛇毒蛋白。
发明内容
为了实现上述目的，本发明提供一种利用生物工程方法制备出具有活性的蛇毒类凝血酶。本发明提供了上述方法制备的类凝血酶蛋白在制备治疗心血管疾病药物中的应用。为了实现上述目的，本发明提供一种蛇毒类凝血酶蛋白的制备方法，包括如下步骤1)制备蛇毒类凝血酶基因；所述的蛇毒类凝血酶基因如SEQ ID NO=I所示；2)将蛇毒类凝血酶基因克隆入质粒载体中，构建原核表达载体；3)用原核表达载体转化大肠杆菌；
4)挑取含表达载体的单克隆菌株在37°C下过夜振荡培养至A600 = 0. 6-0. 8，加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为0. 7mmol/L，18°C振荡培养8小时，诱导表达蛇毒类凝血酶蛋白；5)收集菌体，-80°c冻存；重新取出菌体，加入裂解液，搅勻，冰上超声破菌；6)在4°C，SOOOg下离心10分钟，收集上清，进一步纯化制备类凝血酶蛋白。所述的蛇毒类凝血酶基因是通过下述方法获得的a)小心分离新鲜蛇毒毒腺，提取组织RNA，并进一步提取分离m RNA,反转录获得 cDNA ；b)cDNA双链进行末端补平，补平后的cDNA末端加上EcoR I和Hind III酶切位占.c)已加酶切位点的cDNA双链片段用EcoR I和Hind III限制性内切酶酶切，酶切片段连入T7载体，连接产物加入到包装蛋白中进行噬菌体体外包装；d)以纤维蛋白原作为特异性底物淘选噬菌体将纤维蛋白原稀释至浓度为 10 μ g/ml，用封闭液将其包被在ELISA板上；包被好的ELISA板，每孔加入包装好的噬菌体 100 μ 1，室温孵育2小时；用TBST溶液洗板5次，加洗脱液在室温孵育20分钟，从ELISA板上洗脱噬菌体，完成第一轮淘选；再按上述方法以第一轮淘选噬菌体为基础，再进行两轮淘选，获得强亲和性的含目的基因的噬菌体群；e)从上述噬菌体群中分离培养单个的噬菌体，以SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4为引物，PCR扩增获得蛇毒类凝血酶基因。本发明提供的技术方案具有如下的优点1.传统cDNA文库以带有PolyA的mRNA为模板，反转录合成cDNA第一条链。cDNA 第二条链合成可通过自身引导法或置换合成法或引导合成法，通过分级分离去除小分子 dscDNA并对其进行修饰，切平端，接上接头或衔接头，磷酸化后，克隆到能在细菌中扩增的载体中。随着分子生物学的发展，cDNA文库的构建方法有了很大的改进。但传统cDNA文库仍存在不足第一，低丰度表达序列在文库中出现的几率很低，因此，要想得到低丰度表达基因，至少要筛选106克隆；第二，构建传统cDNA文库所需的mRNA量大，达数微克第三， 筛选传统cDNA文库的工作复杂，需要很长时间，限制了基因克隆的速度。基于上述原因我们选择了 T7噬菌体cDNA文库，T7噬菌体比传统的Ml3噬菌体更为有效、便利，使噬菌体展示所用的载体得到了扩展，而且已经得到了很好的应用，与传统的M13相比，T7克服了丝状噬菌体只能通过穿膜分泌展示蛋白的局限性，使文库的信息量更大，同时具有噬菌体稳定性好、筛选周期短等优点。T7能够展示低拷贝数(0. 1-1拷贝每一个噬菌体)的、大片段的、最长1200个氨基酸的肽或蛋白，也可以展示高拷贝数015拷贝每一个噬菌体)大小为50个氨基酸的肽或蛋白。T7能够比丝状噬菌体或者λ噬菌体更容易生长、复制。在感染到宿主菌1-2小时后就能够形成培养物溶解，37°C 3小时内形成噬菌斑，T7能够在很艰难的环境下生长，因而扩大了在下一步筛选的过程中可以使用的试剂成分，在噬菌体肽库中，由于呈现在噬菌体表面的多肽已经事先与某种外壳蛋白的N端连接，因而可以在预先不知道多肽结构的情况下，利用ELISA等技术检测噬菌体与靶分子的亲和力，从包含上亿种噬菌体的肽库内进行高效筛选同时富集特异的融合型多肽。筛选出的噬菌体克隆可通过再次感染细菌得到扩增，所呈现多肽的相应结构和功能信息，可以通过对阳性噬菌体克隆的DNA测序获得。本发明首次构建了尖吻蝮蛇毒腺的T7噬菌体展示文库，建立了以纤维蛋白原为底物来筛选蛇毒毒腺T7噬菌体展示文库的淘选方法，经过三轮亲和淘选，得到了一个新的类凝血酶基因，测序鉴定，BLAST同源性搜索，结果发现与已知的类凝血酶家族核酸与氨基酸序列相似程度很高，GenBank登陆号AY861138. 1。此类凝血酶有完整的开放阅读框和终止密码子，编码260个氨基酸。2.类凝血酶融合表达后怎样纯化蛋白是现有技术中存在的问题，很多文献中得到的蛋白是以包涵体形式存在，再经纯化、酶切、重折叠等，蛋白的活性会大大下降。本发明用融合表达，而且是上清表达的方式得到了重组类凝血酶蛋白。我们构建了 pET-32 (a) -TLE原核表达系统，在克隆时保留N端 χ-Tag和6个His-Tag两个标签，之后在克隆位点插入蛇毒类凝血酶基因(TLE基因)并在其3端加入终止密码子。转化大肠杆菌E. coliBL21 (DE;3)pLysE，经IPTG诱导，18°C下表达(区别于其他表达系统温度)，全菌破菌后发现重组类凝血酶表达量达到30%以上，运用HPLC等方法纯化得到了纯度95%以上的重组类凝血酶，通过重组类凝血酶的生物学功能检测实验发现其具有很好的生物学活性。
图1 尖吻蝮蛇蛇毒毒腺T7噬菌体展示文库。原始库滴度为IO6级，PCR鉴定证实能够得到大小不一 PCR片段，符合文库构建要求。图2 噬菌体文库的淘选示意3 尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶基因序列表图4 尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶基因(以TLE2示)与其它几种类凝血酶的氨基酸序列同源性比较图5 尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶各基团的亲/疏水活性分析结果图6 同源模建，尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶跟其它类凝血酶模型比较，其有三个结构域，信号肽，类胰岛素丝氨酸蛋白酶，内在的结构，从第M个氨基酸到第246个氨基酸之间是类凝血酶的功能区图7 尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶基因原核表达质粒pET-32 (a) -TLE的构建流程。图8 低温诱导表达尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶蛋白结果。图中M为蛋白分子量Maker， 1为诱导前，2为诱导后。图9 尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶蛋白HPLC纯化结果。图10 尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶蛋白纯化后的Western分析结果。图中M为蛋白分子量Maker，泳道1的绿色荧光为类凝血酶蛋白图11 尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶凝血活性。最少为4. 4 μ g的重组类凝血酶能使正常人的血浆0. 2ml在65秒钟凝固；随着加入的重组类凝血量的增加，凝固时间呈下降趋势； 当重组类凝血酶的达到10. 5μ g以上后凝固时间基本保持不变。图12 重组尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶纤维蛋白原水解活性。M为蛋白Maker，对照为纤维蛋白原(sigma公司，美国)，其余三个泳道为三个时间段重组类凝血酶与纤维蛋白的作用结果。
具体实施例方式尖吻蝮蛇是我国特有的一种蝰蛇科蛇种，为了得到蛇毒毒液中的抗凝血蛋白组分，本发明构建了尖吻蝮蛇毒腺的T7噬菌体展示文库。以纤维蛋白原作为特异性底物，通过生物学淘选的方法来淘选噬菌体。经过三轮 “吸附一洗脱一扩增”，递呈特异多肽的噬菌体得到了高度富集，筛选到了特异性结合的噬菌体。由此建立了使用纤维蛋白/纤维蛋白原淘选抗凝组分的方法在固相介质(ELISA 板)上包被纤维蛋白原后，洗去非特异性结合的噬菌体后，将特异性结合的噬菌体洗脱下来进行下一轮淘选，经过三轮“吸附一洗脱一扩增”，富集了特异性结合的噬菌体。噬菌体洗脱后用PCR方法来扩增目的基因并测序，测序结果经Blast比对，发现了一个与Genebank Accession Number为AF159060的类凝血酶基因同源性达到97%的新的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶基因，如SEQ ID N0:1所示，基因长78;3bp，编码260个氨基酸，如SEQ ID NO 2所示，GenBankAccessionNumber为AY861138。分析此凝血酶基团的亲疏水性，发现具有明显的亲水性。同源建模分析，发现其具有三个结构域信号肽，类胰岛素丝氨酸蛋白酶，内在结构域。为了用基因工程的方法表达制备类凝血酶蛋白，本发明构建了原核融合表达系统，选用了 Novagen公司的pET-32(a)-c(+)质粒作为载体，转入Ε. coli BL21(DE3) PLysE (Novagen公司，德国)中，在浓度为0. 7mmol/L的IPTG (异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷，sigma公司，美国)和温度18°C条件下诱导蛋白表达，得到了高效融合表达的类凝血酶，进一步纯化得到了纯度95 %以上的重组类凝血酶蛋白。在上述适宜浓度IPTG和适宜温度诱导下，大大降低了类凝血酶蛋白的包涵体表达，利于后续简便快捷地纯化蛋白。通过体外凝血和纤维蛋白原降解实验来检测所获蛋白的活性，发现得到的蛋白具有很好的抗凝血活性，为后续大规模生产和制备治疗心血管疾病药物奠定了基础。以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子可隆实验指南》(第三版)(Cold Spring Harbor laboratory I^ess)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《RNA实验技术手册》(科学出版社，北京，中国，2004年)、《免疫检测技术》(科学出版社，北京，中国，1991)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施，正如在本文完整引用一样。除非特别说明，各实施步骤及方法按照所用试剂盒使用说明进行，所涉及的百分比单位为重量百分比，份数比为重量份数比。实施例1 尖吻蝮蛇毒腺噬菌体展示文库构建尖吻蝮蛇毒腺噬菌体展示文库构建示例性地采用如下技术方案1.蝮蛇蛇毒毒腺RNA的提取小心分离新鲜广西尖吻蝮蛇蛇毒毒腺，剥离肌肉组织后称重(约0. 18-0. 20mg/ 个)，于_80°C保存。将尖吻蝮蛇蛇毒毒腺组织置于液氮预冷的研钵中，小心研磨至粉末状。Mj^ffiTrizolti(CHC)MCZYNSKI P. A reagent for the single2step simultaneous isolation of RNA, DNA andproteins from cell and tissue samples[J]. Bio Techniques, 1993，15 :53225371)提取组织RNA。取2μ 1 RNA，稀释25倍后，在紫外分光光度计下测260nm和^Onm波长下的OD值，计算提取的总RNA的浓度。用DEPC (焦碳酸二乙酯)水配制的IXTAE制备的1. 0%琼脂糖凝胶电泳，检测所获得的RNA的完整性。2.尖吻蝮蛇毒腺mRNA的提取分离选用 Novagen 公司的 Straight A，s mRNA Isolation system 试剂盒来提取分离 m RNA。最后用25 μ 1的DEPC水溶解得到mRNA。3.尖吻蝮蛇毒腺mRNA反转录cDNA取第2步提纯的mRNA4 μ g，以OligodT作为引物，用Novagen公司的Orient ExpressRandom Primer cDNA Synthesis Kits 试剂盒进行反转录。4. cDNA双链进行末端补平补平反应体系取22 μ 1上述合成的cDNA双链，3 μ IlOXFlush Buffer, 1. 5μ 1 100mMDTT,0. 3 μ 1 IOmM dNTP mix, 1. 5U T4DNA 连接酶。5. cDNA末端加上酶切位点。反应体系，在PCR管中，加入以下成分10 μ 1上述末端补平的cDNA，2 μ 1 IOXligation Buffer, 2 μ 1 ImM ATP, 2 μ 1 Directional EcoR I/Hind III Linkers, 5 μ 1 T4Polynucleotidekinase,1. 5 μ 1 Nuclease-free water。6.已加酶切位点的DNA双链片段用EcoR I和Hind III限制性内切酶酶切。7.第6步的酶切片段连入T7载体。8.噬菌体体外包装。5 μ 1的连接产物加入到25 μ 1的包装蛋白中，用枪头缓慢混勻。22°C室温下，孵育 2小时。转移至已消毒的1.5ml EP管中，用含有羧卞青霉素浓度为40 μ g/ml的LB液终止包装反应。9.测定包装好的噬菌体的滴度，结果如图1。5支灭菌好的15ml管中，每管加入100 μ 1不同稀释度的噬菌体液、250 μ 1新摇好的细菌、3ml预热并保温55°C的顶层琼脂，迅速摇勻后，倒入至保温37°C的LB板中。待冷却后，倒放在37°C隔水式电热恒温培养箱，孵育4小时。取出各平皿，取可见噬菌斑的稀释度最低的平皿，计数噬菌斑。滴度=噬菌斑个数XlOX稀释度。原始库滴度为IO6级，PCR鉴定证实能够得到大小不一 PCR片段，符合文库构建要求。10.尖吻蝮蛇蛇毒毒腺噬菌体文库的淘选(参见图2)。(1)用去离子水冲洗ELISA板数次，去除孔多余的水分。(2)用TBS将靶蛋白纤维蛋白原(Fibrinogen)稀释，使其浓度为10 μ g/ml。(3)每孔中加入100μ 1稀释的靶蛋白，4°C过夜，将孔封闭好防止液体挥发。(4)使用IXTBS洗去未结合的蛋白质，300μ1/次，洗三次。(5)用去离子水把封闭液(Blocking Reagent)稀释到5 %，每孔中添加溶液 200 μ 1。(6)板子放在4 °C过夜。(7)用去离子水洗板5次，每次200 μ 1/孔，包被板子放在4°C保存。(8)包被好的ELISA板中，每孔加入步骤8中的噬菌体100 μ 1，室温孵育2小时。⑶)用TBST溶液洗板5次，每次200 μ 1/孔，稍加孵育，将液体甩出，用纸巾把残余液珠吸出。(10)加200 μ 1 Τ7洗脱缓冲液(Elution Buffer)在室温孵育20分钟，从ELISA 板上洗脱噬菌体。(11)将洗脱的噬菌体转移到一个15ml离心管中。(12)将250 μ L洗脱的噬菌体添加到50ml 0D_为0. 8的BLT5403细菌中，37°C培养1-3小时，直至观察到裂解的发生。(13)将裂解液转移到50ml的干净离心管中，8000g离心10分钟，将上清转移至一个灭菌的管中，第一轮淘选结束，4°C保存到下一轮淘选。(14)再按上述方法以第一轮淘选为基础，再进行两轮淘选，得到的噬菌体4°C保存，或者加入0. 1倍体积的80%的甘油，保存于-80°c。尖吻蝮蛇T7噬菌体展示文库经3轮亲和淘选后，获得强亲和性的含目的基因的噬菌体群。实施例2 尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶基因序列和蛋白结构分析1.尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶基因的获得。(1)按前述方法，3轮筛选后的噬菌体液用LB液体培养基1 IO8稀释后，取 100 μ 1噬菌体液、250 μ 1新摇好的BLTM03细菌(Novagen公司，德国)，3ml保温55°C的顶层琼脂，混勻后立刻倒入铺有LB的平皿中，冷却后，37°C温箱孵育2小时。可见有单个的噬菌斑形成。(2)从LB上把单个的噬菌斑刮下来，放入EP管中，加入100 μ IlOmM EDTA (乙二胺四乙酸二钠)，PH 8.0的溶液。(3)涡旋离心管，65°C加热10分钟。(4)冷却至室温，14000g离心3分钟。(5)吸上清做PCR，首先在80°C下，酶热启动三分钟；94°C 50sec，50°C lmin, 72°C lmin 35cycles ；72°C 6min。PCR反应体系如下
权利要求
1.一种蛇毒类凝血酶蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)制备蛇毒类凝血酶基因a)小心分离新鲜蛇毒毒腺，提取组织RNA，并进一步提取分离mRNA，反转录获得cDNA；b)cDNA双链进行末端补平，补平后的cDNA末端加上EcoR I和Hind III酶切位点；c)已加酶切位点的cDNA双链片段用EcoRI和Hind III限制性内切酶酶切，酶切片段连入T7载体，连接产物加入到包装蛋白中进行噬菌体体外包装；d)以纤维蛋白原作为特异性底物淘选噬菌体将纤维蛋白原稀释至浓度为10yg/ml， 用封闭液将其包被在ELISA板上；包被好的ELISA板，每孔加入包装好的噬菌体100 μ 1，室温孵育2小时；用TBST溶液洗板5次，加洗脱液在室温孵育20分钟，从ELISA板上洗脱噬菌体，完成第一轮淘选；再按上述方法以第一轮淘选噬菌体为基础，再进行两轮淘选，获得强亲和性的含目的基因的噬菌体群；e)从上述噬菌体群中分离培养单个的噬菌体，以SEQID NO :3和SEQ ID NO :4为引物， PCR扩增获得蛇毒类凝血酶基因，如SEQ ID NO 1所示；(2)将蛇毒类凝血酶基因克隆入质粒载体中，构建原核表达载体；(3)用原核表达载体转化大肠杆菌；(4)挑取含表达载体的单克隆菌株在37°C下过夜振荡培养至A600= 0. 6-0. 8，加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为0. 7mmol/L，18°C振荡培养8小时，诱导表达蛇毒类凝血酶蛋白；(5)收集菌体，-80°C冻存；重新取出菌体，加入裂解液，搅勻，冰上超声破菌；(6)在4°C，SOOOg下离心10分钟，收集上清，进一步纯化制备类凝血酶蛋白。
2.一种克隆获得蛇毒类凝血酶基因的方法，其特征在于包括如下步骤(1)小心分离新鲜蛇毒毒腺，提取组织RNA，并进一步提取分离mRNA，反转录获得 cDNA ；(2)cDNA双链进行末端补平，补平后的cDNA末端加上EcoR I和Hind III酶切位点；(3)已加酶切位点的cDNA双链片段用EcoRI和Hind III限制性内切酶酶切，酶切片段连入T7载体，连接产物加入到包装蛋白中进行噬菌体体外包装；(4)以纤维蛋白原作为特异性底物淘选噬菌体将纤维蛋白原稀释至浓度为IOyg/ ml，用封闭液将其包被在ELISA板上；包被好的ELISA板，每孔加入包装好的噬菌体 100 μ 1，室温孵育2小时；用TBST溶液洗板5次，加洗脱液在室温孵育20分钟，从ELISA板上洗脱噬菌体，完成第一轮淘选；再按上述方法以第一轮淘选噬菌体为基础，再进行两轮淘选，获得强亲和性的含目的基因的噬菌体群；(5)从上述噬菌体群中分离培养单个的噬菌体，以SEQID NO :3和SEQ ID NO :4为引物，PCR扩增获得蛇毒类凝血酶基因。
全文摘要
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种蛇毒类凝血酶蛋白的制备方法，首先分离广西尖吻蝮蛇毒腺组织，构建噬菌体展示文库，以纤维蛋白/纤维蛋白原为底物，经过三轮淘选，获得了一个新的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶基因。本发明还构建了尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶基因的原核表达载体pET-32(a)-TLE，诱导表达、亲和纯化和分子筛纯化后，获得了具有生物学活性的重组蛇毒类凝血酶蛋白。该酶可用于制备心血管溶栓药物。
文档编号C12N15/10GK102296055SQ20111024120
公开日2011年12月28日 申请日期2011年8月22日 优先权日2011年8月22日
发明者孙树汉, 王俊杰, 王凯慧, 胡振林, 陆一鸣, 魏玉保 申请人:中国人民解放军第二军医大学