专利名称：胃癌靶向STAT3基因的siRNAs表达载体的构建、筛选及其用途的利记博彩app
技术领域：
^^ ^STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3)基因的胃癌的基因治疗药物，具体涉及靶向胃癌STAT3基因的siRNAs表达载体的构建、 筛选及其用途，属于生物医药技术领域。
背景技术：
胃癌是常见的癌症之一，全世界每年新诊断病例约930000例，每年死于胃癌的患者约700000人。虽然手术治疗和辅助化疗技术不断改进，胃癌患者的生存率仍然不能令人
两意。近年来，信号传导途经在肿瘤的发病机制和防治手段的研究中越来越受到人们的重视。其中，信号转导子和转录激活子家族(STATs)信号传导途经的研究尤为突出。JAK/ STATs信号转导通路与细胞的增殖、分化及凋亡密切相关，该通路异常活化可导致细胞异常增殖与恶性转化。STAT 由 STATl、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b 及 STAT6 等 7 个成员组成，其中STAT3与肿瘤的关系最为密切。研究显示，STAT3过度激活后将生成同源二聚体，进入细胞核，识别并结合到靶基因DNA特异的反应元件上，进而调控抗凋亡基因Bcl-XL、Survivin和细胞周期控制基因 c-Myc和cyclinDl以及血管内皮生长因子(VEGF)等的表达，从而有利于肿瘤细胞的生长。 有研究发现，STAT3是EGFR、IL-6/JAK、Src等多个致癌性酪氨酸激酶信号汇聚的焦点，因此理论上阻断肿瘤细胞STAT3信号传导通路就有可能起到治疗肿瘤的作用。尽管STAT3也参与正常细胞因子信号的调节，但是在正常细胞中阻断STAT3信号通路后并不影响正常细胞的增殖和存活。因而阻断STAT3途径可以抑制肿瘤细胞的生长而对正常细胞呈现出低毒性的损害，这使STAT3成为肿瘤治疗的新靶点。多项研究表明STAT3与胃癌的关系十分密切。Jackson等证实胃癌细胞胞浆和胞核中都存在STAT3的过表达。Kim等也发现STAT3的表达与胃癌局域淋巴结转移密切相关。 Bronte-Tinkew DM等发现STAT3信号路径的异常活化促进了胃癌的发生发展。Deng J等人认为STAT3与胃癌发展和预后密切相关，是预测胃癌预后的一个重要的分子生物学指标。 我们的前期工作也证实胃癌组织中存在STAT3高表达，并与胃癌的 Μ分期、浸润深度、淋巴结转移及肿瘤分级密切相关。RNA干扰是由双链RNA(dsRNA)诱导的在植物、动物和许多真菌中均存在的序列特异性基因沉默现象。RNA干扰具有高度特异性，在RNAi过程中，dsRNA能够特异性诱导其同源基因mRNA的降解，形成21 23个核苷酸(21 23nts)的小核苷酸片段，再在此基础上进一步降解，其他基因几乎不受影响。此外，RNA干扰具有高效性，研究发现，细胞仅需要几个分子的小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)，即可产生类似于缺失突变体表型的RNAi效应。RNAi可能的作用机制如下不同来源的dsRNA通过各种转基因技术转入植物或线虫细胞内，与Dicer的C末端结构域结合产生21 23nt siRNAs片段。每个片段的3'端都有2nt核苷酸突出；Dicer通过PAZ结构域与含有PAZ结构域的Argonaute蛋白互相作用，核酸内外切酶、解旋酶与Argonaute蛋白相连进而与siRNA —起形成具有多个亚单元的核糖核苷酸蛋白复合物(RNA-inducing silencing complex，RISC)。RISC中的解旋酶应用ATP解开siRNA双链，使其反义链互补结合到靶向mRNA上与之相匹配的特异性序列， RISC中的核酸酶降解mRNA，降解的mRNA随后迅速的被细胞其他的RNA酶所降解。从而使目的基因沉默，产生RNAi现象。Brummelkamp等发现通过向细胞质导入可以表达siRNA的质粒，可以使RNA干扰稳定地维持2个月。肿瘤是多基因疾病，在基因治疗领域RNA干扰特别适合用于某个基因过度表达或由于体内突变基因表达所致的疾病。利用RNA干扰相关技术可以针对在细胞癌变过程中发挥重要作用的原癌基因、抑癌基因、凋亡相关基因、生长因子及其受体以及部分关键酶等， 在不影响正常基因功能的前提下抑制突变基因表达或基因的过量表达，从而达到治疗肿瘤的目的。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种胃癌靶向STAT3基因的siRNAs表达载体构建、筛选及其用途。术语说明STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3)信号转导子禾口转录激活子3。本发明以利用RNA干涉技术为主，针对STAT3基因的不同靶序列，构建了两个能在哺乳动物细胞中表达siRNA的表达质粒pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vectorl/2，以下简称STAT3-siRNAl/2。其示意图谱见
图1，能高效的特异性的抑制STAT3基因表达，可用于制备治疗高表达STAT3基因的胃癌的基因药物。本发明的技术方案如下靶向STAT3基因的siRNAs表达载体，其特征是，以pGPU6/GFP/Neo siRNA ExpressionVector为载体，针对信号转导子和转录激活子3 (STAT3)编码区上游、中游的两段序列，在可较高表达STAT3胃癌细胞系HGC-27中发挥RNA干扰作用。这两段 STAT3特异性RNA干涉靴序列分别为①5，-GCAACAGATTGCCTGCATTGG-3，，起始于956位； ②5，-GCGTCCAGTTCACTACTAAAG-3，，起始于1M3位，是用于STAT3基因相关性胃癌的治疗性物质，由以下方法制得(I)RNA干涉靶序列的选择及插入序列的设计与合成选择STAT3 基因编码区的两段序列① 5，-GCAACAGATTGCCTGCATTGG-3，② 5，-GCGTC CAGTTCACTACTAAAG-3’，设计并分别体外合成两对互补的寡核苷酸序列，序列如下①STAT3寡核苷酸序列1 :正义链5 ’ -CACCGCAACAGATTGCCTGCATTGGTTCAAGAGACCAATGCAGGCAATCTGTTGCTTTTTTG-3’反义链5’ -GATCCAAAAAAGCAACAGATTGCCTGCATTGGTCTCTTGAACCAATGCAGGCAATCTGTTGC-3’
②STAT3寡核苷酸序列2
正义链5’ -CACCGCGTCCAGTTCACTACTAAAGTTCAAGAGACTTTAGTAGTGAACTGGACGCTTTTTTG-3’反义链5’ -GATCCAAAAAAGCGTCCAGTTCACTACTAAAGTCTCTTGAACTTTAGTAGTGAACTGGACGC-3’(2)合成的寡核苷酸分别与线性载体 PGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector 连接、转化、扩增及质粒的提取。首先将步骤(1)合成的两对寡核苷酸等量混勻，95°C作用3分钟后缓慢冷却至室温，然后将结合的双链寡核苷酸与线性化的pGPTO/GFP/Neo siRNA Expression Vector质粒载体连接，最后转化到JM109大肠杆菌，经卡那霉素筛选，挑选单个菌落大量培养。用质粒提取试剂盒提取纯化质粒DNA ；质粒的提取纯化按照试剂盒说明书进行操作。(3)质粒的鉴定将步骤( 提取的质粒DNA琼脂糖凝胶电泳，紫外分光光度计分析测定质粒DNA 的浓度和纯度，并进行插入片断测序，以确定合成的寡核苷酸是否已正确转入pGPTO/GFP/ Neo siRNAExpression Vector 质粒中。本发明的胃癌靶向STAT3基因的siRNAs表达载体在制备治疗表达STAT3的胃癌的基因药物中的应用。为了对STAT3基因siRNAs表达质粒对STAT3基因的抑制效果及对胃癌细胞的抑制作用进行鉴定，脂质体转染细胞，提取总RNA，RT-PCR法测定对STAT3mRNA表达水平的抑制作用，western blotting测定抑制STAT3后对STAT3蛋白表达水平的影响，MTT法检测抑制STAT3基因后对肿瘤细胞生长的影响。本发明针对STAT3基因构建的两种siRNAs表达质粒是可用于高表达STAT3的胃癌的治疗物质，其中STAT3-siRNAl抑制胃癌细胞STAT3表达的效率较高，可用于进一步研究STAT3基因的功能及在实验动物体内进行基因治疗研究。下面详细说明本发明制备方法中各步骤的具体操作方法(1) RNA干涉靶序列的选择及插入模板的设计与合成沿mRNA序列寻找连续两个AA 及后面的19个核苷酸，通过同源性比较，选择与其他任何基因无同源性的序列即作为潜在的siRNA靶位点(靶位点不含有3个以上的相同序列，GC含量在30% -50%左右)。按照载体试剂盒说明，针对STAT3基因的编码序列，为找到具有最佳沉默效果的靶位点，选取两段靶序列，分别从中上游选择两个符合条件的靶位点，分别为①STAT3-1 956 GCAACAGATTGCCTGCATTGG②STAT3-2 1243 GCGTCCAGTTCACTACTAAAG设计并合成两对互补的寡核苷酸序列，每一正向单链寡核苷酸内，21nt的寡核苷酸以正反向组合，以UUCAAGAGA为发夹环序列间隔，使寡核苷酸形成发夹结构，每对寡核苷酸的核心序列反向互补；每对寡核苷酸两端分别带有与线性化载体(pGPTO/GFP/Neo siRNAExpression Vector)上相互补BamH I和BbsI限制性酶切位点，这是连接线性化载体所必需的。按以上所述，两个靶序列设计后的寡核苷酸序列如前所述。(2)合成的寡核苷酸分别与线性载体 pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector 连接、转化、扩增及质粒的提取。首先将合成的两对寡核苷酸等量混勻，95°C作用3分钟后慢慢冷却至室温，然后将结合的双链寡核苷酸与线性化的pGPTO/GFP/Neo siRNA Expression Vector质粒载体连接，最后转化到JM109大肠杆菌，经卡那霉素筛选，挑选单个菌落大量培养。质粒的提取纯化按照试剂盒说明书进行操作。连接反应体系
权利要求
1.靶向STAT3基因的siRNAs表达载体，其特征是，以pGPTO/GFP/Neo si RNA ExpressionVector为载体，针对信号转导子和转录激活子3 (STAT3)编码区上、中游的两段序列，在较高表达STAT3的胃癌细胞系HGC-27中发挥RNA干扰作用；这两段STAT3 特异性RNA干涉靶序列分别为①5’ -GCAACAGATTGCCTGCATTGG-3’，起始于956位； ②5，-GCGTCCAGTTCACTACTAAAG-3，，起始于1M3位，是用于STAT3基因相关性胃癌的治疗性物质，由以下方法制得(1)RNA干涉靶序列的选择及插入序列的设计与合成选择 STAT3 基因编码区的两段序列① 5，-GCAACAGATTGCCTGCATTGG-3，② 5，-GCGTCCAGT TCACTACTAAAG-3’，设计并分别体外合成两对互补的寡核苷酸序列，序列如下①STAT3寡核苷酸序列1:正义链5 ’ -CACCGCAACAGATTGCCTGCATTGGTTCAAGAGACCAATGCAGGCAATCTGTTGCTTTTTTG-3’反义链5 ’ -GATCCAAAAAAGCAACAGATTGCCTGCATTGGTCTCTTGAACCAATGCAGGCAATCTGTTGC-3’②STAT3寡核苷酸序列2正义链5’ -CACCGCGTCCAGTTCACTACTAAAGTTCAAGAGACTTTAGTAGTGAACTGGACGCTTTTTTG-3’反义链5 ’ -GATCCAAAAAAGCGTCCAGTTCACTACTAAAGTCTCTTGAACTTTAGTAGTGAACTGGACGC-3’(2)合成的寡核苷酸分别与线性载体pGPTO/GFP/NeosiRNA Expression Vector连接、 转化、扩增及质粒的提取将步骤(1)合成的两对寡核苷酸等量混勻，95°C作用3分钟后缓慢冷却至室温，然后将结合的双链寡核苷酸与线性化的pGPTO/GFP/Neo siRNA Expression Vector质粒载体连接，最后转化到JM109大肠杆菌，经卡那霉素筛选，挑选单个菌落大量培养；用质粒提取试剂盒提取纯化质粒DNA ；(3)质粒的鉴定将步骤( 提取的质粒DNA琼脂糖凝胶电泳，紫外分光光度计分析测定质粒DNA的浓度和纯度，并进行插入片断测序，以确定合成的寡核苷酸是否已正确转入pGPTO/GFP/Neo siRNAExpression Vector 质粒中。
2.权利要求1的靶向STAT3基因的siRNAs表达载体在制备治疗表达STAT3的胃癌的基因药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及胃癌靶向STAT3基因的siRNA表达载体的构建、筛选及其用途。本发明利用RNA干扰技术为主，针对STAT3基因的不同靶序列，构建了两个能在哺乳动物细胞中表达siRNA的表达质粒STAT3-siRNA1/2。本发明胃癌靶向STAT3基因的siRNAs表达载体能高效的特异性的抑制STAT3基因表达，可用于制备治疗高表达STAT3基因的胃癌的基因药物。
文档编号C12N15/63GK102304538SQ20111022432
公开日2012年1月4日 申请日期2011年8月5日 优先权日2011年8月5日
发明者汪运山, 童书青, 肖东杰, 郏雁飞, 郑燕, 马晓丽 申请人:汪运山