专利名称：苏云金芽孢杆菌gl-1及在土壤解磷防病方面的应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种微生物及其应用，具体涉及一种苏云金芽孢杆菌(feciB^s thuringiensis)GL-l及其在土壤解磷防病(香蕉枯萎病和番茄青枯病)和改善土壤微生态结构等方面的应用。
背景技术：
磷是植物生长发育所必需的营养元素之一，作物吸收磷量与其生物量(r=0. 97)和产量(r=0. 75)呈显著的正相关。然而由于磷固定的存在形式使得土壤缺磷在世界范围内广泛存在，磷供给不足是世界农业生产中最重要的限制因素之一。从我国的情况来看，全国有74%耕地土壤缺磷。解决这一问题主要有两条途径一是增加磷源投入，二是提高难溶性磷的利用率。第一条途径存在一定的问题，首先，磷是一个不可再生资源，根据目前已探明的磷矿储量和开采速度，世界现有磷矿资源只能维持100年左右，而且我国磷矿资源并不丰富， 且品位较低，大量的磷肥依赖进口。其次，磷肥生产需要大量的硫酸或磷酸，能源消耗大，增加了农业生产的成本。再次，高水溶性磷肥施入固磷强的石灰性土壤中，土壤中95%以上的磷为难溶形态，植物难以吸收利用。并且磷肥施入土壤后极易被化学固定，形成溶解性极低的磷酸钙、铁、铝等化合物，作物的当季利用率一般只有59TlO%，加上作物的后效，也不超过 25%。因此，大部分磷肥作为无效态(难溶态)在土壤中积累。据报道，至少有709Γ90%的磷进入土壤而成为难以被作物吸收利用的固定形态。在这些土壤中，土壤有效磷含量很低而全磷含量较高，如据黄土高原7省区的调查，土壤全磷平均较有效磷高250倍；黄淮海平原黄潮土与风沙土全磷较有效磷高13(Γ500倍。我国自20世纪50年代施用化学磷肥以来， 储存累积在土壤中的难溶性磷高达6000万吨，超过目前全国磷肥10年消费量的总和。增施磷肥是一种“高投入，低产出”的途径。同时，我国的磷肥资源匾乏，生产能力难以满足需求。因此，提高磷肥利用效率，增强土壤磷素的活化与利用成为科学研究的重要任务。第二条途径的潜力则很大，包括三方面的内容一是发挥植物的自身潜力，通过育种技术的创新，定向地筛选培育磷高效植物品种来开发利用土壤难溶性磷素资源；二是在研究磷在土壤中的形态分布特征和作物吸磷特性的基础上，通过改进磷肥的施用技术等方式提高磷的潜在有效性；三是从土壤中筛选高效解磷微生物，研制成解磷菌剂拌种或直接施入土壤，将土壤中难溶性磷活化出来。溶磷微生物广泛分布于土壤，是一类能改进磷肥固定、提高磷肥利用率和溶解土壤难溶磷的微生物群，已经被世界公认为是一种廉价高效的环保型土壤磷活化生物措施。利用溶磷微生物对提高磷肥的有效性和土壤难溶磷的利用率、减少磷肥投入、发挥我国有限磷矿的增产作用和农业持续发展意义重大。鉴于不同种类的溶磷菌或不同菌株之间的溶磷能力有较大差异，高效溶磷菌的筛选工作尤为重要。香蕉枯萎病(Banana Wilt Disease)又名香蕉巴拿马病、黄叶病，是由尖孢镰刀菌 (.Fusarium oxysporum)侵染而引起的维管束坏死的一种毁灭性香蕉真菌病害和典型的土传病害。该病是目前香蕉产业的最大威胁，近年来在我国香蕉主产区持续暴发，造成严重损失。香蕉枯萎病菌根据鉴别寄主的不同分为4个生理小种，当今香蕉栽培品种Carvebdish 虽可抗1号及2号生理小种，然而4号生理小种几乎对所有香蕉栽培种均致病，严重威胁香蕉产业的可持续健康发展。因此，加强香蕉枯萎病的防治研究迫在眉睫。目前对香蕉枯萎病的防治主要是通过抗、耐病品种的选育、药剂防治、水旱轮作等方法和措施进行防治。虽然很多学者都针对香蕉枯萎病进行化学药剂的筛选，室内有些药剂对枯萎病菌有很好的抑制效果，然而化学药剂不但防治成本高，残留期较长，容易对环境中的其他非靶标生物产生不良影响，造成对生态环境的污染和破坏，且田间防治效果也不理想。利用微生物及其代谢产物、植物提取物等生物农药进行防治，使用对人体和生态环境无害的生防菌剂替代化学农药已成为世界范围内的研究发展方向。番茄青枯病(iTomatoBacterial Wilt)是由青枯假单胞 i、Ralstonia Solanacearum^引起的一种毁灭性土传病害。该菌菌系复杂，寄主广泛，高温高湿环境下生命力顽强，能侵染50多个科的450多种植物，防治难度大。虽然在抗病品种选育、化学防治、 农业防治等方面进行了大量的研究，但至今效果均不理想。生物防治一直是解决土传病害的重要途经，并且符合农业可持续发展的要求，已经成为防治该病害的重点发展方向。我国从60年代初就已开始研究青枯病的生物防治。目前，青枯病拮抗菌集中在无致病力青枯菌和内生菌的研究。迄今为止，筛选出的生防菌株主要有芽孢杆菌、假单胞菌、菌根真菌及链霉菌等少数放线菌。龙良鲲等和黎起秦等从番茄根内分离出青枯病的内生拮抗菌，有一定的防效；Lemessa F.通过根际微生物的筛选，得到效果较好的拮抗菌株APFl和B2G。这些进展为番茄青枯病的生物防治奠定了重要基础。目前，国内外对解磷菌、香蕉枯萎病和番茄青枯病拮抗菌的研究稳步开展，但这些研究大多局限于解磷菌单一的解磷能力、或者单一的枯萎病和青枯病拮抗功能。而在具有高效解磷作用的同时，并对香蕉枯萎病菌和番茄青枯病菌产生拮抗作用的多功能菌株却未曾报道。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术中的上述问题，提供一种兼具解磷与防病功能的苏云金芽孢杆菌。本发明的另一目的是提供上述菌株的应用。本发明通过以下技术方案实现上述目的
一种苏云金芽孢杆菌(Macillus thuringiensis )GL_1，简称GL-I菌。该菌株于2011年 6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号CGMCC No. 4923，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该GL-I菌是在广西壮族自治区兴安县漠川乡石灰岩母质发育的土壤中进行分离、纯化所得，属革兰氏阳性菌，有芽孢；菌体为杆状，有运动性，好养；在牛肉膏蛋白胨培养基上培养24h后形成的菌落为圆形或不规则状，4 后菌落全部为圆形，乳白色，直径约为2 3mm，边缘不整齐，扁平湿润。经过序列测定，该GL-I菌的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。GL-I菌的保藏方法，其保藏培养基的成分为牛肉膏3. 0g，蛋白胨5. Og,氯化钠 5. 0g，琼脂18. 0g，蒸馏水1000ml，或按照此比例配制成的培养基，pH值为7. (Γ7. 2。按常规菌种保藏温度保藏。一种生物肥，含有本发明的苏云金芽孢杆菌GL-I或其发酵产物。所述发酵产物的发酵培养基成分为麦麸5g，蛋白胨5g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml， 或按照此比例配制而成的培养基，PH值为7. (Γ7. 2。本发明所述苏云金芽孢杆菌GL-1，或上述生物肥，在分解难溶性磷中的应用。本发明所述苏云金芽孢杆菌GL-1，或上述生物肥，在增加土壤中微生物多样性和微生物丰度中的应用。本发明所述苏云金芽孢杆菌GL-1，或上述生物肥，在防治香蕉枯萎病和/或番茄青枯病中的应用。所述香蕉枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌(/^sari oxysporum).所述番茄青枯病的病原菌为青枯假单胞菌、Ralstonia Solanacearum)0与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
发明人经过大量实验研究，筛选出一株苏云金芽孢杆菌(feciBM thuringiensis ) GL-1。此菌株在提高土壤中难溶磷的有效性和磷肥利用率的同时，还可以对香蕉枯萎病菌和番茄青枯病菌均有较好的拮抗效果。
图1. GL-I菌革兰氏染色显微照片，菌体被染成深蓝色； 图2. GL-I菌芽孢染色显微照片，其中蓝色部分为芽孢；
图3.不同菌株在难溶无机磷培养基下产水溶性磷浓度的对比图； 图4.不同菌株在难溶无机磷培养基下产微生物磷浓度的对比图； 图5. GL-I菌对番茄青枯病菌的拮抗效果图，其中A为培养基平板上显示的番茄青枯病病原菌，B为加入GL-I菌片后对番茄青枯病菌形成抑菌圈；
图6. GL-I菌对香蕉枯萎病菌的拮抗效果图，其中A为培养基平板上显示的香蕉枯萎病病原菌，B为加入GL-I菌片后对香蕉枯萎病菌形成抑菌圈； 图7. GL-I菌促进玉米生长的实验照片；
图8.不同处理土壤微生物群落代谢活性AWCD值变化的曲线图，n=3，CK为未施菌土壤，B为GL-I菌株处理土壤。
具体实施例方式以下实施例中除特别说明外，均为本领域内的常规实验方法和操作步骤。实施例1菌株的分离、纯化 (1)分离
配制难溶无机磷培养基葡萄糖lO.Og，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，七水硫酸亚铁0. 03g，硫酸锰0. 03g,酵母膏0. 4g，磷酸钙5g，蒸馏水IOOOml，PH 7. 0 7· 5。以广西壮族自治区桂林市兴安县漠川乡石灰岩母质发育的土壤为筛选土样，采用平板涂布法准确称取筛选土样10. Og,放入装有90ml无菌水的250ml三角瓶中(加玻璃珠)，摇床振荡30min，使细胞充分分散，静置2(T30s，取上清液进行10倍递减稀释，采用10，105稀释度，用移液枪分别移取稀释液0. lmL，涂布在难溶无机磷平板上，28°C倒置培养7d，逐日观察溶磷圈，记录溶磷菌菌落(d)和溶磷圈直径(D)。筛选出有解磷圈的细菌菌株编号为a-3, a-4, a~5, a~7, a~15, a~16, b_17和B，其中B的解磷效果最强，d/D值为5。经分子生物学鉴定和生理生化鉴定后，确定B菌株为苏云金芽孢杆菌imcillus iAtfriZ^ieesis)，本发明中简称GL-I菌。(2)纯化
营养琼脂培养基牛肉膏3. 0g，蛋白胨5. Og,氯化钠5. Og,琼脂18. Og,蒸馏水1000ml， pH值7. (Γ7. 2。将筛选出的GL-I菌利用平板划线法纯化后，保存于营养琼脂斜面培养基上。实施例2特性鉴定 (1)菌体形态特性
革兰氏阳性菌，有芽孢。菌体为杆状，有运动性，专性需氧。菌体革兰氏染色显微照片见图1，芽孢染色照片见图2。(2)菌落形态特性
在牛肉膏蛋白胨培养基上培养24h后形成的菌落为圆形或不规则状，4 后菌落全部为圆形，乳白色，直径约为2 3mm，边缘不整齐，扁平湿润。(3)生长特性
在牛肉膏5g，蛋白胨5g，氯化钠5g，水IL的液体培养基中，转速113 rpm，温度30°C， 起始PH值为7. 0的条件下，培养18小时，测得活菌数为2. 91 士0. 60 X 108cfu/ml。(4)生理、生化特性
采用Biolog Ecoplate微平板培养方法，分析此菌株在好氧条件下对31种不同碳源的利用情况，结果见表1。表1 GL-I菌对31种不同碳源的利用情况
权利要求
1.苏云金芽孢杆菌GL-I，保藏编号CGMCCNo. 4923，于2011年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.根据权利要求1所述苏云金芽孢杆菌GL-1，其特征在于其16SrDNA核苷酸序列如 SEQ ID NO :1 所示。
3.权利要求1或2所述苏云金芽孢杆菌GL-I的保藏方法，其特征在于保藏培养基的成分为牛肉膏3. Og,蛋白胨5. Og,氯化钠5. Og,琼脂18. Og,蒸馏水IOOOml，或按照此比例配制成的培养基，PH值为7. (Γ7.2。
4.一种生物肥，其特征在于含有权利要求1或2所述苏云金芽孢杆菌GL-I或其发酵产物。
5.根据权利要求4所述生物肥，其特征在于所述发酵产物的发酵培养基成分为麦麸5g，蛋白胨5g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，或按照此比例配制而成的培养基，pH值为 7. 0 7· 2。
6.权利要求1或2所述苏云金芽孢杆菌GL-I在分解难溶性磷中的应用。
7.权利要求1或2所述苏云金芽孢杆菌GL-I在增加土壤微生物群落多样性和增加微生物丰度中的应用。
8.权利要求1或2所述苏云金芽孢杆菌GL-I在防治香蕉枯萎病和/或番茄青枯病中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌引起的。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述番茄青枯病是由青枯假单胞菌引起的。
全文摘要
本发明公开了苏云金芽孢杆菌GL-1及在土壤解磷防病方面的应用。该菌株保藏编号为CGMCCNo.4923，于2011年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。本发明的苏云金芽孢杆菌GL-1能够提高土壤中难溶磷的有效性和磷肥利用率，在减少磷肥施用的同时能够促进植物生长。另外，该菌株对香蕉枯萎病和番茄青枯病的病原菌均具有很好的拮抗效果，可有效抑制病原菌尖孢镰刀菌和青枯假单胞菌的生长繁殖，作为生物农药加以利用。而且，该菌株还能够增加土壤中微生物多样性和增加微生物丰度。利用该菌株制备的生物肥，既可以防土传病害又能促进植物生长，应用前景广阔。
文档编号C12N1/20GK102321551SQ20111022402
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月5日 优先权日2011年8月5日
发明者孔德颖, 李永涛, 蔡燕飞, 蔺中 申请人:华南农业大学