专利名称：甲型/乙型流感病毒核酸双重荧光pcr检测试剂盒的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种同时检测甲型/乙型流感病毒核酸双重荧光PCR检测试剂盒，属于生物技术领域。
背景技术：
流感是一种季节性疾病，在温带地区，流感会在整个冬季流行，在热带地区，流感病毒一年四季均存在，雨季流行多见。常见的甲型流感，俗称伤风，是由病原体为甲型流感病毒引起的急性呼吸道传染病，主要传播方式是空气飞沫传播。流感发病严重程度与个体免疫状况有关。一般来说，仅约50%的感染病人会发展成典型流感临床症状。流感典型症状以突然发热、头晕头痛、肌痛、全身症状轻、同时可伴有喉咙痛和咳嗽、鼻塞、流涕、胸痛、 眼痛、畏光等症状。发热体温可达39 40°C，一般持续2 3天后渐退。甲型和乙型流感的临床症状相似，但是甲型流感病毒导致的住院率四倍于乙型流感病毒。乙型流感通常有肌炎及胃肠道症状。流感病毒是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒，属于正黏液病毒科， 其病毒基因组由8条负链RNA节段构成(如图1)。根据核蛋白(NP)和基质蛋白(M)不同， 分为甲型、乙型和丙型。甲型流感病毒根据表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同，分为16个HA亚型和9个NA亚型；乙型和丙型流感病毒不分亚型。甲型流感病毒最容易发生变异，流感大流行就是甲型流感病毒出现新亚型或旧亚型重现引起的；乙型和丙型流感仅在人之间转播，以局部暴发和散发流行为特征。引起流感大流行的主要是甲型流感病毒。流感病毒的检测方法主要有病毒的分离培养，免疫学诊断和分子生物学诊断。病毒的分离培养和免疫学诊断是流感的实验室诊断的常规方法，分子生物学诊断中出现了许多快速特异的方法，三种方法具有以下特点
1)病毒分离培养对技术要求较高，费用较昂贵，耗时长，且各实验室分离阳性率各不相同，无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要，目前仅用于实验研究。2)血清学方法不能高通量处理样本，不能准确反映当前是否感染或携带病毒。血清学的诊断还存在滞后性，该方法费时、费力，无法满足快速、早期诊断的要求。3)病毒核酸检测由于以上两种方法费时、费力，为了提高检测速度，可直接从临床标本(咽拭子、鼻拭子、鼻咽或气管抽取物、痰)中检测病毒的核酸。该方法具有快速性、准确性和高灵敏性等优点，能够对流感病毒感染作出早期诊断，给疫情的快速分析和控制提供有力的技术支撑。其中的实时定量RT-PCR检测平台已成为最简捷和可靠的流感病毒检测方法。目前产品大部分采取针对单一病毒的检测方法，对于临床检测多种病毒的要求， 必须对一个样本进行多管检测才能达到，增加了检测成本和操作繁琐度。从上面可见，常用的病毒分离法比较费时，血清学诊断方法存在滞后性，基因序列测定方法也较为复杂和繁琐的。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种甲型/乙型流感病毒核酸双重荧光PCR检测试剂盒。本发明的甲型/乙型流感病毒核酸双重荧光PCR检测试剂盒，包括RNA酶抑制剂、 RT-PCR反应液、酶混合液、甲型/乙型流感病毒双重反应液、阳性对照和阴性对照，
其中，
所说的RNA酶抑制剂为焦碳酸二乙酯(DEPC)水； 所说的RT-PCR反应液包括IOX缓冲液、MgC12和dNIPs ； 所说的甲型/乙型流感病毒双重反应液包括以下组分
组分(1)由一对检测甲型流感病毒的引物和一条检测甲型流感病毒的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示；探针的碱基序列为SEQ ID No. 3所示，该探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团；
组分(2)由一对检测乙型流感病毒的引物和一条检测乙型流感病毒的探针组成； 其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示；探针的碱基序列为 SEQ ID No. 6所示，该探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团； 所说的酶混合液包括Taq酶和逆转录酶。表1为上述甲型/乙型流感病毒引物和探针的序列。
表1‘'
名称.P序列甲型-FIVGACCRATCYTGTCACCTCTGAC ( SEQID No. 1)。甲型AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA (SEQIDNo.2)-φ 型-P^FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCAC-BHQ1 (SEQ ID No.3)乙型-FP,:CCCACCRAGCAACAAACG (SEQID No—4) ^乙型撒CCTTCCGACATCAGCTTCACT (SEQIDNo.5) ^乙型-P。HEX-CCCGGAACCCATCCCCGGA-BHQ1 (SEQIDNo.6) ^优选地，
所说的检测甲型流感病毒的引物及探针的配比分别为SEQ ID No. 1:SEQ ID No. 2: SEQ ID No. 3为600nM: 600nM: 200nM ；所说的检测乙型流感病毒的引物及探针的配比分别为=SEQ ID No. 4: SEQ ID No. 5: SEQ ID No. 6 为 400nM: 400nM: 400nM。所说的荧光报告基团选自FAM、HEX、R0X、CY3或CY5荧光报告基团；所述的荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2或BHQ3荧光淬灭基团。所说的逆转录酶为M-MLV逆转录酶，所说的Taq酶为热启动Taq酶。所说的阳性对照为灭活的病毒培养液；所说的阴性对照为去RNA酶水。本发明的试剂盒采用双重荧光定量PCR技术，设计甲型/乙型流感病毒探针，在同一反应体系中实现同时检测是否存在甲型和乙型流感病毒。引物和探针的设计采用primer 5.0专用软件设计，将设计的引物和探针在NCBI的GeneBank进行比对，检测引物和探针的特异性。引物和探针在专业合成公司合成，采用紫外分光光度计测定光密度值(A^Onm/ A280nm在1. 8-2. 0之间为合格)
目前国内的核酸诊断中应用最为广泛的是以荧光标记探针为基础的实时荧光PCR技术。检测探针为包括5’端报告基团和3’端淬灭基团的寡核苷酸。当探针完整时，由于淬灭基团靠近报告基团而极大降低了报告基团发出的荧光。引物延伸时，与模板结合的探针被Taq酶(3' -5'外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号。在每次PCR循环中，都有新的报告基团被剪切，因此荧光信号强度的增加与扩增产物的数量成正比。双重荧光定量PCR技术则是在同一反应体系中加入两条不同荧光标记的探针(针对靶基因1的探针标记FAM，针对靶基因2的探针标记HEX)。PCR反应过程中，若待检样本包含靶基因1，则标记FAM的探针产生荧光信号；若待检样本包含靶基因2，则标记HEX的探针产生荧光信号。这样，同一管反应则可确定两个靶基因(如图2所示)。本发明的甲型/乙型流感病毒核酸检测试剂盒具有如下技术效果
1)本试剂盒操作简便且能有效防止污染，PCR荧光检测时间(从标本处理开始)仅为2-3 小时，而且在同一反应体系中实现同时检测是否存在甲型或乙型流感病毒。PCR荧光检测是全封闭操作，加入样本抽提产物之后可以不再打开管盖，减少了污染产生的机会。2)能够同时检测出甲型、乙型流感病毒，解决了现有产品只能在一管中检测一种流感病毒的问题。本发明还具有灵敏度高、特异性好、可重复性强、检测结果快速客观等优点，在流感病毒体外诊断领域具有极大的应用前景。
图1是流感病毒的结构。图2是双重荧光定量PCR技术原理。图3是本发明试剂盒检测样本的曲线图。图4是本发明试剂盒检测甲型流感病毒的灵敏度试验结果。图5是本发明试剂盒检测乙型流感病毒的灵敏度试验结果。图6是本发明试剂盒检测甲型流感病毒的特异性试验结果。图7是本发明试剂盒检测乙型流感病毒的特异性试验结果。
具体实施例方式实施例1 甲型/乙型流感病毒核酸检测试剂盒
本实施例的甲型/乙型流感病毒核酸双重荧光定量PCR检测试剂盒，包括RNA酶抑制剂、RT-PCR反应液、酶混合液、甲型/乙型流感病毒双重反应液、阳性对照和阴性对照， 其中，RNA酶抑制剂为DEPC水；RT-PCR反应液包括IOX缓冲液、MgC12和dNIPs ； 甲型/乙型流感病毒双重反应液包括以下组分
组分(1)由一对检测甲型流感病毒的引物和一条检测甲型流感病毒的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示；探针的碱基序列为SEQ ID No. 3所示，该探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团；检测甲型流感病毒的引物及探针的配比分别为:SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 2: SEQ ID No. 3为600nM:600nM: 200nM ；
组分(2)由一对检测乙型流感病毒的引物和一条检测乙型流感病毒的探针组成； 其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示；探针的碱基序列为 SEQ ID No. 6所示，该探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团；检测乙型流感病毒的引物及探针的配比分别为SEQ ID No. 4:SEQ ID No. 5: SEQ ID No. 6为 400nM: 400nM: 400nMo荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX、CY3或CY5荧光报告基团；荧光淬灭基团选自 BHQ1、BHQ2或BHQ3荧光淬灭基团。酶混合液包括Taq酶和逆转录酶，逆转录酶为M-MLV逆转录酶，所说的Taq酶为热启动Taq酶。阳性对照为灭活的病毒培养液；所说的阴性对照为去RNA酶水。本试剂盒的使用方法包括下列步骤 1、提取样本RNA
1.1 取 200 ul 流感病毒临床样品，加入 400 ul Binding Buffer supplemented with Poly (A)，充分混勻后转入高纯化过滤管，8000 rmp离心15 s，弃去收集管中的废液。1.2 加入 500ul Inhibitor Removal Buffer 至过滤管，8000 rmp 离心 1 min，弃
去收集管中的废液。1.3 加入450ul Washing Buffer至过滤管，8000 rmp离心1 min，弃去收集管中
的废液。1. 4重复步骤1. 3，然后高速离心10 s，此步骤务必将废液去除干净.
1.5 加入50ul Elution Buffer至过滤管中，室温静置2 min,8000 rmp离心1 min, 离心所得溶液即为纯化的RNA。2 在每个PCR反应管放入组分如表2中所示的甲型/乙型流感病毒检测试剂和 RNA样本，其中甲型/乙型流感病毒双重反应液按照表3配制
权利要求
1.甲型/乙型流感病毒核酸双重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括RNA酶抑制剂、RT-PCR反应液、酶混合液、甲型/乙型流感病毒双重反应液、阳性对照和阴性对照，其中，所说的RT-PCR反应液包括IOX缓冲液、MgC12和dNIPs ；所说的甲型/乙型流感病毒双重反应液包括以下组分组分(1)由一对检测甲型流感病毒的引物和一条检测甲型流感病毒的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示；探针的碱基序列为SEQ ID No. 3所示，该探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团；组分(2)由一对检测乙型流感病毒的引物和一条检测乙型流感病毒的探针组成； 其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示；探针的碱基序列为 SEQ ID No. 6所示，该探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团；所说的酶混合液包括Taq酶和逆转录酶。
2.根据权利要求1所述的甲型/乙型流感病毒核酸双重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所说的检测甲型流感病毒的引物及探针的配比分别为SEQ ID No. 1:SEQ ID No. 2: SEQ ID No. 3为600nM: 600nM: 200nM ；所说的检测乙型流感病毒的引物及探针的配比分别为SEQ ID No. 4: SEQ ID No. 5: SEQ ID No. 6 为 400nM: 400nM: 400nM。
3.根据权利要求1所述的甲型/乙型流感病毒核酸双重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所说的荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX、CY3或CY5荧光报告基团；所述的荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2或BHQ3荧光淬灭基团。
4.根据权利要求1所述的甲型/乙型流感病毒核酸双重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所说的逆转录酶为M-MLV逆转录酶，所说的Taq酶为热启动Taq酶。
5.根据权利要求1所述的甲型/乙型流感病毒核酸双重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所说的阳性对照为灭活的病毒培养液；所说的阴性对照为去RNA酶水。
全文摘要
本发明提供了一种甲型/乙型流感病毒核酸双重荧光PCR检测试剂盒，包括RNA酶抑制剂、RT-PCR反应液、酶混合液、甲型/乙型流感病毒双重反应液、阳性对照和阴性对照，其中，所说的甲型/乙型流感病毒双重反应液包括以下组分组分(1)由一对检测甲型流感病毒的引物和一条检测甲型流感病毒的探针组成；组分(2)由一对检测乙型流感病毒的引物和一条检测乙型流感病毒的探针组成；所说的酶混合液包括Taq酶和逆转录酶。本发明能够同时检测出甲型、乙型流感病毒，解决了现有产品只能在一管反应中检测一种流感病毒的问题。本发明具有操作简便、可重复性强、检测结果快速客观等优点，在流感病毒体外诊断领域具有极大的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK102251061SQ20111022391
公开日2011年11月23日 申请日期2011年8月5日 优先权日2011年8月5日
发明者严浩荣, 刘中华, 张旭, 王国强, 魏赵延 申请人:江苏硕世生物科技有限公司