一种姜花萜类花香基因Hctps1及其应用的利记博彩app

专利名称：一种姜花萜类花香基因Hctps1及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种姜花萜类花香基因及其应用。
背景技术：
花香在植物繁殖过程中发挥了重要的作用，不仅可以提高作物的产量和质量，还可以增加观赏植物和切花的审美特性，而萜类化合物是组成花香的主要成分之一。萜类化合物是一类由数个异戊二烯(isoprene，C5)结构单位构成的化合物的统称，根据其数目不同可分为单临(monoterpene，C10)、倍半临(sesquiterpene, C15)禾口二临(diterpene， C20)等。萜类化合物种类繁多、结构多样，迄今在植物中发现了 25 000多种，是植物次生代谢物中种类最多的一类。萜类不仅是组成花香的主要成分，还有其它众多的生理生态作用。如，吸引授粉者；调节植物的生长和发育；调节植物耐热性；抵御光氧化胁迫；直接和间接的植物防御。除此之外，萜类还广泛应用于香料、化妆品、食物、药物和杀虫剂等行业，有非常大的商业价值。萜类合成酶(terpene synthase，TPQ是萜类合成的关键酶，按形成产物的不同， 可分为单萜合成酶、倍半萜合成酶和二萜合成酶等，它们分别以GPP或NPP、FPP和GGPP为直接前体底物合成相应的单萜、倍半萜、二萜。萜类合成酶蛋白一般是由550—850个氨基酸残基组成，相对分子质量为50—100 kDa。单萜合成酶的氨基酸长度在600—650之间，比倍半萜合成酶(550 -580个氨基酸)要长，这是因为单萜合成酶多出了一段用于定位质体的N末端信号肽，信号肽可以引导单萜合成酶进入质体。这段信号肽含有大量的丝氨酸和苏氨酸残基和较少的酸性氨基酸残基， 但没有发现共同的结构元件。研究表明，萜类合成酶在三维结构上有很高的相似性，由α -螺旋、短的连接环和拐角等立体结构组成，并含有两个明显的结构区域，即C-末端结构区域和N-末端结构区域。酶的活性中心是C-末端的一个疏水区域，由6个α-螺旋组成，这个疏水区域利于底物疏水烃基部分进入和结合。N-末端没有特殊的功能元件，突变分析显示，这个区域起到方便C-末端催化活性区域正确折叠的脚手架作用。几乎所有的萜类合成酶都含有一个天冬氨酸富集基序(DDxxD)，这个基序被认为起到结合金属离子的作用，它定位在活性位点的入口处，在引导底物催化时发挥重要的作用，若基序发生突变则会导致酶催化活性的下降或产生异常的产物。根据萜类合成酶氨基酸序列的相关性，将TPS家族分为七个亚家族，从 TPSa-TPSg,同一亚家族的不同成员之间有最小40%的同源性。萜类合成酶以异戊二烯焦磷酸(GPP，FPP和GGPP)为底物合成大量结构、功能多样的萜类化合物，由于大多数萜类化合物为环状，因此萜类合成酶也被称为环化酶。萜类合成酶以金属离子为辅因子，使异戊二烯焦磷酸发生亲电反应，首先，底物通过焦磷酸基团断裂或质子化的离子化过程，形成与酶结合的异戊二烯碳正离子中间体，由于酶活性位点的限制，碳正离子发生电子重排，然后经过一系列的异构化、环化或重排，最后经过去离子化或加水形成环状或非环状的萜类化合物。萜类合成酶是萜类化合物生物合成的关键酶，因此也成了萜类生物合成过程中研究最多和最深入的酶类，自1992年在烟草中克隆了两个倍半萜合成酶基因以来，科学家已在40多种植物中克隆了 200多个单萜和倍半萜合成酶基因，涉及农作物、针叶类植物、药用植物、香料植物和观赏植物以及拟南芥等模式植物。Dudareva等在仙女扇中克隆了一个花器官特异表达并受植物发育调控的单萜合成酶基因一沉香醇合成酶基因，这是第一次克隆到特异表达的花香基因。在拟南芥基因组中也发现了三个在花中特异表达的萜类合成酶基因，并且这三个酶催化产生了拟南芥花中主要的挥发性物质。挥发性萜类物质经常在特定的时期或发育阶段，从特定的植物组织中释放出来， 用来吸引授粉昆虫。在金鱼草中，两个主要的香气成分(月桂烯和罗勒烯)在花的上唇瓣和下唇瓣部位释放，并且受发育和昼夜节律的调控，这种昼夜节律可能与相应萜类合成酶基因在一天中的表达量不同有关。在烟草花瓣和柱头中的许多萜类物质在夜间释放，主要由于1，8-桉油醇合成酶基因在转录时受昼夜节律的调控。许多植物花的开放和花中萜类物质的释放都遵循昼夜节律，萜类释放的这种特异改变可能与授粉昆虫的出现时间有关系。 例如，由夜间活动昆虫授粉的花卉可能在傍晚时候香气释放量达到最大，使其与夜间活动昆虫的最大传粉时期相一致，这都是植物为适应外界环境而逐渐进化来的。近年来，植物萜类生物合成的基因操作已成为一个热门的研究领域。Lucker等通过基因工程手段将三个不同的柠檬单萜合成酶转入到萜类挥发量很少的烟草中，结果在转基因烟草的叶和花中，单萜混合物((+)_柠檬烯、Y-萜品烯，菔烯)的含量得到了明显的提高，组分得到了改变，并且人类的嗅觉可以感知到转基因烟草释放的单萜挥发性物质。

发明内容
目前，国内对萜类的研究主要集中在药用、香料提取等方面，对萜类合成酶对花香形成的影响鲜见报道，直到本专利申请前没有发现对姜花花香基因报道。克隆花香基因是对姜花花香形成机理研究的前提，揭示姜花花香和诱导防御反应的分子机理可以增加花香和增强其抗性。这为采用基因工程的方法培育具浓郁花香植物新品种提供了一条崭新的途径。本发明的目的是分离克隆白姜花中携带的一个控制萜类花香成分沉香醇的基因。本发明另一目的在于提供上述基因编码的蛋白质。本发明另一目的在于提供含有上述基因的载体。本发明另一目的在于提供含有上述载体的转基因植物。本发明还有一个目的在于提供上述基因在产生分子标记及其在选育对花香品种中的应用，以及上述基因编码的蛋白质在制备香精和药物中的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现
本发明涉及分离和应用一种包含论尔W基因的DNA片段(如SEQ ID Ν0:1所示)，该片段赋予姜花花朵沉香醇香味。本发明所示的DNA片段在有香味的姜花花组织表达，在无香味的姜花品种中不表达，并且其表达与花发育进程有关，同时在姜花叶片中受伤害诱导表达。该基因cDNA全长18^bp，基因编码区共1737bp，推测其编码578个氨基酸，蛋白分子量为64. 5 kDa。在这个基因序列中有DDX)(D和RRX8W两个保守序列，并且基因的系统进化树表明属于植物萜类合成酶基因家族中的Tps-b亚族，DNA全长核苷酸序列长度为2^8bp， 包含6个内含子和7个外显子，且剪切位置均符合“GT-AG法则”。其中，6个内含子分别位于第 222-305 位、第 578-667 位、第 1050-1136 位、第 1356-1425 位、第 1568-1637 位和第1884-2043位，大小分别为83bp、89bp、86bp、69bp、69bp和159b ；7个外显子分别位于第 1-221 位、第 306-577 位、第 668-1049 位、第 1137-1355 位、第 1426-1567 位、第 1638-1883 位和第 2044-2298 位，大小分别为 221bp、272bp、382bp、219bp、142bp、246bp 和 255bp。通过原核表达并用反应底物GPP反应体外生成主产物为沉香醇(占总挥发量的71. 3%)。本发明同样包括将花香基因的主要结构部分有效地连接上合适的调节序列所形成的嵌合基因，以及在基因组中包含这种基因的植物和这种植物的种子。如这种基因可以是天然的或是嵌合的。例如，将包含该基因的片段和一个组成型表达的启动子连接，该启动子可以在任何条件下和细胞发育的任何时期表达。这种组成型表达的启动子包括花椰菜花叶病毒35S的启动子等。另一方面，也可以将该基因和一个组织特异性表达的启动子或发育时期特异性表达的启动子或精确环境诱导的启动子连接，这些启动子称之为诱导型启动子。这样，环境的改变，发育时期的不同都可以改变该基因的表达，同样，也可以将该基因的表达限定在某一个组织内，使由该基因诱导的抗性反应得到人为的控制。 其中环境条件包含病虫害的攻击、高低温和光等，组织和发育时期包括叶、果实、种子和花等。根据本发明提供的基因序列信息，本领域技术人员可以通过以下方法容易地获得与等同的基因(1)通过数据库检索获得；(2)以基因片段为探针筛选姜花或其它植物的基因组文库或cDNA文库获得；(3)根据基因序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增的方法从姜花或其它植物的基因组、mRNA和cDNA中获取；(4)在 Hctpsl基因序列的基础上用基因工程方法改造获得；(5)用化学合成的方法获得该基因。本发明提供的姜花花香基因具有重要的应用价值。应用之一是将所述的 Hctpsl基因序列连接到任何一种植物转化载体，用任何一种转化方法将花香基因导入姜花或其他植物细胞，可获得表达所述基因的转基因花香或抗性品种，从而应用于生产。本发明所述的基因构建到植物转化载体中，可以对所述基因或其调控序列适当修饰，也可以在其转录起始密码子前用其它启动子取代所述基因原有的启动子，从而拓宽和增强植物产生花香和增强抗性的能力。本发明提供的花香和抗性基因的另一个应用是根据所述基因序列信息产生特异性的分子标记，包括但不限于SNP (单核苷酸多态)、SSR (简单序列重复多态)、RFLP (限制性内切酶长度多态)、CAP (切割扩增片段多态)。用这些标记可鉴定姜花或其它植物的花香基因型，用于分子标记辅助选择育种，从而提高育种的选择效率。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本发明将克隆的花香基因转入无花香的植物，有助于产生新的花香植物。特别是可以用转化技术在植物中累加多个花香基因，而不会产生传统育种技术中伴随出现的基因组中不良基因的连锁问题，并且可以缩短育种时间。花香基因的克隆是克服传统育种中不能在植物种间转移花香基因的问题的前提。另外，本发明能够进一步提供或应用利用上述DNA 片段获得的花香的转基因植株和相应的种子，以及用本发明的基因或基于该基因的重组体转化的植株或由这类植株获得的种子。可以用有性杂交的方式将本发明的基因转入其他的
5植株。


图1为论组织表达特异性；
戰2为Hctpsl在花器官不同发育时期的表达； 图？·为Hctpsl重组蛋白体外酶催化反应； 图A^Hctpsl转基因烟草植株的PCR检测图。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1 Hctpsl基因cNDA和DNA全长的获得
姜花材料姜花选用白姜花盛花期花瓣。称取IOg左右样品于研钵中，用液氮速冻研磨成粉末状后转入无菌的50 mL离心管中；立即添加20mL80°C预热的硼酸缓冲液于42°C 下保温并轻微振荡提取池；加入1/3体积的2. 4 mol/L KCl溶液于4°C下冰浴Ih以上；以 20000rpm、4°C离心30 min ；取上清液，加入8mol/L LiCl溶液，使LiCl的终浓度变成2 mol/ L，在4°C下冰浴过夜沉淀RNA ； IOOOOrpm离心30 min后去除上清液；用2mol/L LiCl溶液洗涤沉淀1-3次；加入lOmmol/L Tris-HCl (pH7. 5)缓冲液溶解沉淀；加入2mol/L KOAc溶液混合后冰浴30min，以去除RNA中的多糖等杂质；10000 rpm离心15min后，将上清液转移至干净离心管中；加入已有液体体积2. 5倍的无水乙醇，在一 80°C下沉淀池；10000 rpm离心30min，沉淀RNA ；弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀；离心并去除上层乙醇，真空干燥；用灭菌超纯水溶解RNA，于一 80°C冰箱中保存备用。以姜花盛开期的花瓣总RNA作为模板，用生工M-MuLV First cDNA Synthesis Kit 合成第一链cDNA。据GenBank核酸数据库中报道的相关基因序列设计引物，上游引物为如 SEQ ID N0:4所示，下游引物为如SEQ ID NO: 5所示，并交由上海生物工程公司合成。以上述合成的cDNA为模板采用TaKaRa PCR Amplification Kit进行PCR扩增反应，具体方法按照说明书进行。PCR程序为94°C预变性^iin ；94°C变性45s、复性4 (温度具体而定)、 72°C延伸lmin，30个循环；然后72°C延伸lOmin。在一 20°C下保存备用。PCR反应结束后， 用1. 0%琼脂糖凝胶电泳初步检测PCR产物中是否含有目的片段条带。PCR扩增产物经1% 琼脂糖凝胶电泳检测后，用手术刀在紫外灯下切出含有目的片段的胶块，用DNA凝胶回收试剂盒(Agarose Gel DNA Purification Kit, TaKaRa)进行回收，回收方法基本参照试剂盒说明书。之后要对回收产物进行1%琼脂糖电泳检测，看其回收效果及大致浓度，以便保证后续试验的进行。根据回收的目的片段大小及其有效浓度，取适量回收纯化的产物与克隆载体连接，载体选用TaKaRa pMD18_T载体，目的DNA与克隆载体的摩尔比控制在3 :1左右，具体操作按说明书进行。在16°C下恒温连接!3h-6h，连接时间的长短视目的片段的长度而定。提前将感受态细胞DH5 α (TaKaRa)从一 80°C冰箱取出，并置于冰盒中待其自然融化，将IOPL连接液全量加入感受态细胞的离心管中，冰浴30min后，42°C水浴热激50s，迅速冰上放置2-5min，然后加入37°C预温的SOC液体培养基890μ 补足到lmL，混勻后37°C下 ISOrpm振荡培养lh。在含100 μ g/mL氨苄青霉素的LB固体培养基平板表面上涂30μ 的X-gal (20mg/mL)和3(^LIPTG (20mg/mL)，然后涂布适量转化液，待转化液完全被吸收后倒置于37°C恒温箱中过夜培养，约IMi后观察结果，通过X-gal/IPTG蓝白斑筛选白色菌落， 并初步鉴定重组质粒，平板置于4°C保存。通过蓝白斑初步筛选后，通常选6个菌斑摇菌后提取质粒，用于进一步鉴定。用灭菌的牙签从LB平板培养基上挑取白色单菌落接种于含有 100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于控温震荡水浴摇床上37°C、240rpm振荡过夜培养，用质粒DNA小抽试剂盒(上海博亚生物有限公司)提取质粒，步骤按说明书上方法进行。对所提质粒进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测，比较质粒大小并将明显滞后的质粒进行双酶切I /历^i/III,TaKaRa)分析。在37 °C下酶切Ih后，对酶切产物进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测。随意选送酶切鉴定后含目的片段的重组质粒进行DNA序列测定。测序工作交由上海英骏生物技术有限公司完成，采用美国ABI377序列分析仪。所得的序列在NCBI 进行比对和同源性分析。根据已得到的cDNA片段序列，利用生物软件I^rimer Premier 5. 0在靠近片段序列的3'端设计两个特异引物，3' -RACE 1st Primer如SEQ ID N0:6所示；3' -RACE 2nd I^rimer如SEQ ID NO: 7所示，经生物软件Oligo 6. 0分析后交由上海生物工程公司合成。 以01igo(dT)-3'末端锚定引物为引物，反转录合成cDNA第一链。将合成的cDNA第一链作为模板，用3' —回引物与3'末端锚定引物进行3'末端PCR扩增。PCR程序为94°C预变性3min ；94°C变性30s、复性30s (温度视具体而定)、72°C延伸Imin, 30个循环；然后72°C 总延伸lOmin。第一次PCR反应液稀释10-100倍后作为模板，用3' 二回巢式引物进行第二次PCR反应。PCR反应结束后，用1.0%琼脂糖凝胶电泳初步检测PCR产物中是否含有目的片段条带。经过回收、检测，随机选送酶切鉴定后含目的片段的重组质粒进行DNA序列测定。测序工作交由上海英骏生物技术有限公司完成，采用美国ABI377序列分析仪。把测序结果与cDNA片段的序列进行拼接分析，判断其是否是cDNA片段序列3'的延伸。同样利用已知的cDNA片段序列，在靠近其5'末端的位置设计五个引物，包括一个特异的反转录引物如SEQ ID N0:8所示(需进行5'端磷酸化标记)和四个特异引物 5' -RACE 1st UP Primer 如 SEQ ID NO:9所示，5' -RACE 1st Dff Primer 如 SEQ ID NO: 10 所示，5' -RACE 2nd UP Primer 如 SEQ ID NO: 11 所示，5' -RACE 2nd Dff Primer 如 SEQ ID NO: 12 所示。5' -RACE所用试剂盒为大连宝生物工程有限公司出品的5' Full RACE Core Set Kit，以5'末端磷酸标记引物为引物，反转录合成cDNA第一链后进行环化反应，然后将环化的单链cDNA连接产物稀释10倍后作为模板，以一回5'引物对，进行第一次PCR扩增。 PCR程序为:94°C预变性3 min ；94°C变性30s、复性30s、72°C延伸lmin，30个循环；然后 72°C总延伸IOmin0电泳检测。经回收、检测，随机选送酶切鉴定后含目的片段的重组质粒进行DNA序列测定。测序工作交由上海英骏生物技术有限公司完成。把测序结果与cDNA片段的序列进行拼接分析，判断其是否是cDNA片段序列5'的延伸。对所得到的片段序列、3 ‘和5 ‘序列进行Blast分析后，利用DNAstar软件包的 SeqMan程序将三个片段进行比对拼接，拼接所得序列即为萜类合成酶基因cDNA全长序列。拼接所得的cDNA全长序列再在NCBI上对核苷酸序列及推导的蛋白质序列进行同源性比较和分析。
基因cDNA全长序列的获得
根据已经得到的基因cDNA全长，设计并合成上下游引物，Pl如SEQ ID N0:13所示，P2 如 SEQ ID NO: 14 所示，
以姜花cDNA为模板，采用TaKaRa PCR Amplification Kit进行PCR扩增反应。反应条件为94°C预变性^iin ；94°C变性30s、复性30s(温度视具体而定)、72°C延伸3min，35个循环；然后72°C总延伸lOmin。取5PLPCR产物在含溴化乙锭0. 8%的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，紫外光下观察实验结果。应用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. O(TaKaRa)，按照操作说明，将 PCR产物纯化回收，回收产物溶解于25PLElution Buffer中。取纯化回收产物4gL、pMD20_T Vector μ 、连接液Solution I 5μ ，组成10μ 的连接体系，16°C下连接过夜。转化大肠杆菌菌株DH5ci感受态细胞，涂布于含有X-gal、IPTG、氨苄青霉素的LB固体培养基上，37°C 培养过夜；然后挑选白色克隆斑20个于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C、240rpm 扩大培养16-24h ；用质粒DNA小抽试剂盒(上海博亚生物有限公司)提取质粒，琼脂糖凝胶电泳比较质粒大小并将明显滞后的质粒进行酶切鉴定。从鉴定出的阳性重组质粒中随机挑选，送上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。获得Hctpsl基因的全长cDNA序列和全长DNA序列，根据cDNA序列推测出其蛋白序列。实施例2论尔W基因的表达分析
取总RNA液WL稀释100倍后，在Eppendorf Biophotometer核酸蛋白测定仪上测定其浓度，计算取IOPgRNA所用的RNA溶液体积，用灭菌超纯水补足到ΙΟμ ，加入ΙΟμ 含EB 的RNA电泳上样缓冲液，于70°C变性lOmin，迅速于冰中冷却，用含甲醛的1.洲琼脂糖凝胶进行变性凝胶电泳(50V，60min)。电泳结束后，在凝胶成像系统下观察条带深浅情况是否一致，不一致的要在总RNA上样量上做调整。调到总RNA条带基本一致后，将胶块放于2 X SSC 的溶液中，室温脱色摇床上震荡浸洗两次，每次20min左右。采用上行毛细管转移方法以 20 X SSC作为转移缓冲液，将变性RNA从凝胶转移到尼龙膜上(Biodyne B 0. 45 μ m, PALL)。 具体操作参照《分子克隆实验指南(第三版)》(黄培堂等，2002)，过夜转移16-20h后，取下尼龙膜置于干净的培养皿中，80°C烘烤池，紫外交联后用保鲜膜包住，于4°C下保存备用。转膜后的琼脂糖凝胶要在紫外凝胶成像仪下观察条带是否转完全，凝胶上几乎看不到有RNA 的痕迹。在靠近姜花萜类合成酶基因cDNA 3'端设计合成探针引物，用经碱处理的目的质粒DNA作为模板，先跑一个普通PCR反应以确认所设计的探针引物论-ipW-DIG-Up引物如 SEQ ID N0:15所示，i - /Λs7-DIG-Dw如SEQ ID N0:16所示，是否可行。经电泳检测确认后，再用 PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Applied Science, Mannheim, Germany) 制备带有DIG标记的探针，取5PLPCR产物用1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测，判断是否扩出预期带DIG标记的探针DNA (探针DNA的位置应在目标片段位置的后面)。若探针制备成功，则可用于制备杂交液。将上述合成的探针全量转入1. 5mL离心管中，沸水浴IOmin后，迅速冰浴冷却，短暂离心收集到管底，全量吸入已装有20mL预杂交液的50mL离心管中，混合均勻，于65°C保温几分钟，-20°C下保存备用。探针与预杂交液的浓度基本是1/1000，预杂交液包含以下成分50 %去离子甲酰胺、5XSSC、7%SDSJ%阻断剂、50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 7. 0)和0. 1% N-Iauroylsarcosine sodium salt (w/v)。将紫外交联后的结合有总RNA的尼龙膜放入杂交袋中，注AMripping Solution [5%SDS、50 mmol/L Tris-HCl (pH7. 5)和50%去离子甲酰胺]，赶尽气泡后封口，于80°C的杂交箱中以最大转速润洗尼龙膜lh，重复此步骤1次。用适量的2 X SSC溶液漂洗去掉甲酰胺后，将尼龙膜放入新的杂交袋，加入65°C预热的预杂交液，于45°C的杂交箱中进行预杂交3-3.证。预杂交完成后，将预杂交液换成杂交液于45°C的杂交箱中过夜杂交。次日，将尼龙膜置于37°C预热的2 X SSC (含0. 1%SDS)溶液中，在脱色摇床上室温漂洗2次，每次lOmin，洗去表面未结合的探针。随后于62°C预热的0. IXSSC(含0. 1%SDS) 溶液中，在63°C下洗膜两次，每次30min，洗掉背景。经过抗原抗体结合后的膜用Tween-20 洗去未结合的抗体，然后用CDPItarTM通过化学发光原理检测杂交信号的强弱。基因表达分析结果见图1和图2。实施例3 Hctpsl基因原核表达
根据所得到cDNA全长，去除信号肽片段，用包含5kl I和AbtI酶切位点的特异引物进行PCR扩增。PCR产物用Takara回收试剂盒回收，回收产物直接用^alI和AbtI限制性内切酶进行双酶切，琼脂糖凝胶回收目的片段。pET-28a原核表达载体用5kl I和AbtI限制酶进行双酶切琼脂糖凝胶回收大片段。于16°C连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌 (.E. coli)])ma感受态细胞；提取质粒经酶切和测序鉴定后，获得重组原核表达载体。用经鉴定的重组质粒DNA转化大肠杆菌(BL21)感受态细胞，挑取单菌落接种于 5ml LB (含25 mg /L Kan, 34 mg /L Chl)培养基中，37°C震荡培养过夜。转接100 μ 种子液于新鲜的100ml (含25 mg /L Kan, 34 mg /L Chl)的LB培养基中，37°C 180rpm培养 4h-6h，测 OD 值至 0. 4-0. 6 后用一定量的 IPTG (0. ImM-O. 2mM)在 UV _18°C诱导 14 16h。同时取另一对照组其中未加IPTG诱导。离心收集菌体，用5ml裂解buffer (50mM磷酸buffer pH 8.0)悬浮细胞，将菌体冷却，置于冰上超声波破碎细胞。12000rpm，4°C离心 lOmin，将上清移至新的离心管中，用双蒸水清洗沉淀一次，再用5ml裂解buffer悬浮沉淀。 分别取上清和沉淀各50 μ ，保存与_20°C，进行SDS-PAGE电泳分析。配制12. 5%SDS聚丙烯酰胺凝胶，按照顺序上样。分别用60V和120V的电压对浓缩胶和分离胶的进行电泳。电泳完毕，考马斯亮蓝染色30min，再用脱色液脱色广8h，观察并记录试验结果。蛋白的纯化
挑取单菌落接种于5ml的液体LB培养基中，37°C，180rpm，培养过夜，后全部转接至 500ml的新鲜液体LB培养集中，37°C，180rpm，培养4h，用IPTG(0. ImM-O. 2 mM)，18°C条件下诱导1 后，收集菌体。取200μ1菌体于离心管中，4°C保存，进行SDS-PAGE电泳分析。用 5ml的裂解buffer悬浮细胞并转移至离心管内，置于冰上使菌体始终保持冷却，超声波破碎细胞。10，000 χ g，4°C离心20 - 30 min，收集上清液。取20 μ 的上清于_20°C保存，进行SDS-PAGE分析。向5ml细胞裂解液中加入广2ml的Ni-NTA resin(镍一次氮基三乙酸树脂填料)混勻，并低速在4°C摇床上结合60min。将结合完全的细胞裂解液和树脂混合物装入层析柱中，移走底部盖帽收集流出液部分(flow-through fraction, F)，取20μ1的流出液，于-20°C保存，进行SDS-PAGE分析。用細1的洗涤buffer洗脱层析柱两次，收集每部分的洗脱液(wash fraction, W)，各取20 μ 保存于_20°C冰箱中作SDS-PAGE分析。用0.5ml的洗脱buffer洗柱四次，分别用不同的收集管依次收集每部分的洗脱液(elution fraction，E)，分别标记为 El, E2, E3, E4，各取 20ul 进行 SDS-PAGE 分析。根据 SDS-PAGE 的检测结果，集中含有目标蛋白洗脱部分于一个离心管中，用移液器转移至透析袋中，4°C透析过夜。收集透析后的溶液，加入甘油使蛋白溶液中甘油总含量为20%，并且以200 μ /管的量进行分装，取微量进行SDS-PAGE蛋白浓度检测，其余的放于_70°C超低温冰箱进行保存备用。萜类合成酶酶活性鉴定
转接100 μ 种子液于新鲜的200ml (含25 mg /L Kan, 34 mg /L Chl)的LB培养基中，37°C 180rpm 培养 4h-6h，测 OD 值至 0. 4-0. 6 后用一定量的 IPTG (0. ImM-O. 2mM)在 14°C-18°C诱导 14 16h。5000rpm，4°C离心5min离心收集菌体，用 5ml buffer (IOmM MOPS buffer pH 7.0 10%甘油ImM DTT)悬浮细胞，置于冰上超声波破碎细胞。12000rpm，4°C离心20min，将上清移至新的离心管中。酶促反应及GC-MS分析
将ΙΟΟμΙ lOXbuffer，酶提取液880μ1，2. 5 mM 6ΡΡ20μ1溶液加入样品瓶中密封，将 75Mm聚二甲基氧烷(PMDQ萃取纤维头插入玻璃瓶中，水浴30°C lh,45°C 15min，顶空固相微萃取，反应结束后将萃取纤维头放至气相色谱-质谱连用仪中进行分析，气相色谱条件为色谱柱为HP-1NN0WAX柱(30mX0. 25mm)；载气为高纯氦气，分流比20 1，柱前压50 Pa， 流量1 mL /min ；取样时间^iiin ；程序升温柱起始温度45 °C，保持2min，以5 V /min的速度升至80 °C保持lmin，然后以10°C /min的速度升至250°C保持5 min。质谱条件为 GC-MS的接口温度220 °C，电子轰击源EI、350V;离子源温度170 °C;电子能量70 eV ；扫描质量范围35-335aum，采集到的质谱图用WILLEY/MAINLIB库进行分析。原核表达结果见图3。实施例4 Hctpsl对烟草的遗传转化
载体构建及农杆菌转化将论尔W用Zhl I和I酶切，回收目的片段；载体 pMOGMON用损al I和feoR I酶切，纯化回收相应大小的片段，连接，转化DH5 α，提质粒，酶切鉴定，挑出所需克隆，测序，并将其转化到农杆菌LBA4404中。烟草转化将烟草“中烟-90”叶片(0.5 cmX0.5 cm的方块)和矮牵牛叶片(1 cmXl cm的方块)培养基中预培养2 3 d，农杆菌菌液浓度OD6tltl 0. 5 0. 8，浸染5 lOmin，然后共培养3 d，烟草在潮霉素Hyg 20 mg/L、头孢霉素Cef 400 mg/L，矮牵牛在潮霉素Hyg 5 mg/L、头孢霉素Cef 400 mg/L的培养基上，在光照2000 lOOOOLx，25 °C条件下进行选择培养。选择培养2 3周后，外植体的转化细胞将产生抗性愈伤组织，将材料转入相应的选择分化培养基中进行分化出芽培养，待不定芽长至1 cm以上时，切下并插入含有选择压的生根培养基上进行生根培养，每瓶插入2 3棵小苗，进行生根诱导。将根长至约4 5 cm健壮小苗，炼苗5 6d，炼苗结束后，清水洗净根部培养基，进行移栽。转基因矮牵牛和烟草基因组DNA的提取
1)取0.2 g材料，加入液氮研磨成粉末，将磨好的材料转入2 ml的离心管中，加入1 ml 预热2 % CTAB提取液(含0. 的巯基乙醇)，充分混勻，置于65°C水浴45 min, 6 8min 混勻一次。10000 rpm，离心 5 min。2)冷至室温，取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇(24 1 )，轻轻混勻至溶液成乳化状，10000 rpm，离心 5 min。3)取上清，加入2/3体积预冷的异丙醇，-20°C放置30min。10000 rpm离心5 min, 弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2 3次。加入200 μ 1 TE溶液溶解。4)加入1 /10体积NaAC (3 mo 1 /L)和2倍体积的无水乙醇，_20°C放置2h以上。 12000 rpm离心5min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗涤2 3次，室温干燥沉淀。用20 50 μ 1 IXTE 溶解，-20°C保存。转基因矮牵牛和烟草PCR检测
以转化菌液为阳性对照，未转化DNA作阴性对照，进行PCR扩增体系。上游引物如SEQ ID NO: 17所示， 下游引物如SEQ ID NO: 18所示。反应体系(20μ L)转基因植株 DNA IyL (20ng 50ng) ； 10 Xbuffer 2 μ L ； MgCl2 (2. 5mM) 2 μ L ;Taq 酶 0. 2 μ L ； dNTP (2. 5mM) 2μ L ；引物各加 10 μ M ；加无菌水至 25 μ L0反应条件-MV，4分钟；940C，30秒；54°C，30秒；72°C，1分钟；30个循环；72°C延伸10分钟。筛选出PCR阳性植株(图4)。转基因烟草与矮牵牛植株挥发性物质SPME-GC/MS分析
采用固相微萃取一气相色谱质谱方法分析。将烟草与矮牵牛小苗从基质中取出，洗净， 置于2. 5 L密封箱中，加入31. 6 ng/μ 1 (100 μ M SNP处理为316 ng/μ 1)的癸酸乙酯10 μ 1作为内标物，用聚四氟乙烯衬里的硅橡胶垫密封，插入100 μ m聚二甲基硅氧烷(PMDS) 萃取纤维头，于25°C温下顶空取样30 min。采用FINNIGAN TRACE MS气质联用仪(美国) 进行分析。色谱条件为DB-5石英毛细管柱长30 m，内径0.25 mm,液膜厚0. 25 ym，载气 He，柱头压力68. 974 kPa，程序分流/不分流(LSQ进样口温度250°C。程序升温50°C，保持2 min ；以3°C /min的升温速度升至250°C，保持30 min。在SPME分析中，PSS进样口设定为不分流进样方式，不分流时间为2 min，衬管采用1. 5 mm内径的玻璃管，脱附时间为3 min ；在DHS进样口分流比为20 :1，进样量为2.0 μ L· GC/MS传输线温度为250°C，质量扫描范围是30 350 a μ m，扫描时间0.3 s，扫描间隔0.2 s，EI离子源温度170°C，EI电子能量70 eV，光电倍增管(PMT)电压230 V，对采集到的质谱图用WILEY、MAINLIB、REPLIB及 NISTDEM0 4个库进行分析，并根据各组分峰面积与内标癸酸乙酯峰面积之比定量，确定烟草和矮牵牛挥发性物质的化学成分。结果表明与挥发性香气有关的物质柠檬烯，3，5-二氧甲基甲苯，长叶烯等含量相在测定的两株转基因植株都比野生型明显的提高，柠檬烯转基因烟草提高了 7. 19倍以上，3，5- 二氧甲基甲苯提高了 9倍以上，长叶烯提高了 4. 83倍以上(表1)。表1烟草论转基因植株挥发性气体成分的变化
权利要求
1.一种姜花萜类花香基因/fci/zs7，其特征在于该基因CDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；其DNA全长的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
2.权利要求1所述姜花萜类花香基因编码的蛋白质，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
3.一种载体，其特征在于含有权利要求1所述姜花萜类花香基因Hctpsl。
4.一种转基因植物，其特征在于包括权利要求3所述载体。
5.权利要求1所述姜花萜类花香基因的应用，其特征在于将姜花萜类花香基 ^Hctpsl连接到植物转化载体中，然后导入姜花或其它植物细胞中，获得表达所述姜花萜类花香基因的转基因花香品种或抗性品种。
6.权利要求1所述姜花萜类花香基因的应用，其特征在于根据该基因产生特异性的分子标记，用于鉴定姜花或其它植物的花香基因型。
全文摘要
本发明公开了一种姜花萜类花香基因Hctps1及其应用。本发明所述姜花萜类花香基因Hctps1的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本发明所述姜花萜类花香基因Hctps1在有香味的姜花花组织表达，也在姜花叶片中受伤害诱导表达，在无香味的姜花品种中不表达，并且其表达与花发育进程有关。本发明所述姜花萜类花香基因Hctps1可以连接到任意一种植物转化载体，然后导入姜花或其它植物细胞中，可获得表达所述基因的转基因花香或抗性品种，从而用于生产；也可以根据本发明所述基因序列信息产生特异性的分子标记，用于鉴定姜花或其它植物的花香基因型，用于分子标记辅助选择育种，从而提高育种的选择效率。
文档编号C12N15/63GK102277362SQ201110223418
公开日2011年12月14日 申请日期2011年8月5日 优先权日2011年8月5日
发明者余让才, 兰建彬, 卢保兰, 徐婧, 范燕萍 申请人:华南农业大学