专利名称：尖音库蚊抗药性检测试剂盒及其专用引物的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种尖音库蚊抗药性检测试剂盒及其专用引物。
背景技术：
尖音库蚊复合组(Culex pipiens complex)属于库蚊属库蚊亚属，该种全球分布。 一般认为该复合组包括尖音库蚊(Cx. p. pipiens)、致倦库蚊(Cx. p. quinquefasciatus)、 淡色库蚊(Cx.p.pallens)和騷扰库蚊(Cx. p. molestus)。上述4亚种在我国均有分布。本复合组种类不仅分布广，而且具有很大医学重要性。是我国防病灭蚊的主要对象之一。化学防治在目前和可预见的未来，仍然是蚊虫防治的重要手段。然而，抗性的产生严重地影响到媒介蚊虫的防治。尖音库蚊复合组内多种蚊虫对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性在我国已经普通存在。而抗性检测和监测是预防抗性发生和发展的前提，是抗性治理工作的基础。目前，蚊类抗药性的检测方法，一直沿用1970世界卫生组织推荐的生物测定法， 测出害虫对药剂的敏感毒力(LD-p)基线和LD5tl或LC5tl值。再从测试地区采集同种害虫种群，采用与测定敏感品系相同的生测方法和控制条件，得出待测种群的LD-p线和LD5tl或 LC50 {t,以待测种群与敏感种品系的LD5tl或LC5tl值之间的比值(即抗性倍数)来表示抗性水平。但该方法对所获得资料有严格的统计要求，必须严格控制试验条件，需反复多次试验， 而且在实践中亦显示出较明显的局限性。传统的生物测定法比较繁琐，从虫源、饲养到测定难于做到真正的标准化，而且由LD-p线求出的LD5tl或LC5tl值的重复性和精确性较低，当群体抗性较低和抗性种群多样时很难准确测定，因此测得的抗性水平往往具有滞后性，不适合早期抗性检测，不利于制定相应的防治对策。鉴于目前许多抗性对策依赖于抗性的早期检测，因此抗性监测与检测技术的研究尤显重要。随着抗性监测和检测目的的多元化，抗性监测手段和方法也朝着多元化方向发展。害虫抗药性分子检测技术是基于对害虫抗药性机制了解的基础上建立起来的，即利用分子生物学技术检测杀虫剂作用靶标的抗性位点或解毒代谢酶基因的增强表达。基于可操作性、实用性和经济等方面的原因，目前几乎所有的抗性检测研究都集中于靶标抗性方面，即检测靶标基因的突变。拟除虫菊酯类杀虫剂的作用靶标是昆虫神经细胞膜上钠离子通道，在钠通道II S6节段发生的基因点突变，被称为击倒抗性(kdr)，因其与拟除虫菊酯类杀虫剂抗性相关而倍受关注。目前，对于击倒抗性机制已经进行了大量的分子生物学实验。L1014F(亮氨酸-苯丙氨酸，Phe/kdr)突变因其广泛存在，又被称为经典突变。而在同一位点还存在另外两个突变，分别是亮氨酸突变为组氨酸(His/kdr)和亮氨酸突变为丝氨酸的点突变 L1014S (Ser/kdr)。在库蚊属蚊虫中仅存在两种突变的报道，分别是L1014F和L1014S突变。 随着击倒抗性分子机制研究的深入以及分子生物学技术的发展，kdr基因特异性等位基因聚合酶链反应(PASA)快速检测技术随之产生。
PASA技术是检测基因点突变的一种新PCR技术，该技术的基本原理是其中一条 PCR产物引物3’端设置于抗性突变位点处。利用这些引物进行PCR扩增，S引物能够扩增敏感害虫的基因片段，而不能扩增抗性害虫的基因片段；R引物则相反。PASA技术的使用需要针对突变碱基设计特别的引物，因此要求对引起抗性的所有碱基突变非常清楚。在尖音库蚊复合组蚊虫中，已经有文献报道了淡色库蚊和致倦库蚊中的kdr基因突变同时存在 L1014F和L1014S两种类型。在同一个碱基位点出现多种抗性突变时，需要设计多个引物， 进行多次PCR，才能确定突变的性质。虽然AS-PCR技术已经应用了蚊虫抗性检测，但是多是针对kdr基因单个点突变而建立起来的方法。目前对于尖音库蚊复合组蚊虫还没有一种能够同时检测多个突变位点的分子检测方法和试剂盒。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测尖音库蚊中kdr基因突变位点的引物。本发明提供的引物，由引物组A、引物组B和引物组C组成所述引物组A包括引物2和引物3，所述引物2和引物3的核苷酸序列分别为序列表中序列2和序列表中序列3 ；所述引物组B包括引物2和引物4，所述引物2和引物4的核苷酸序列分别为序列表中序列2和序列表中序列4 ；所述引物组C包括引物2和引物5，所述引物2和引物5的核苷酸序列分别为序列表中序列2和序列表中序列5。所述引物组A还包括引物1，所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列1 ；所述引物组B还包括引物1，所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列1 ；所述引物组C还包括引物1，所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列1。所述引物组A、所述引物组B和所述引物组C为独立包装；所述引物组A中所述引物1、引物2和引物3的质量比为0-5) 10 (8-5)，质量比具体为3 10 7；所述引物组B中所述引物1、引物2和引物4的质量比为0-5) 10 (8-5)，质量比具体为3 10 7；所述引物组C中所述引物1、引物2和引物5的质量比为0-5) 10 (8-5)，质量比具体为3 10 7；所述突变位点为L1014F或L1014S。本发明的第二个目的是提供一种检测尖音库蚊中kdr基因突变位点的PCR试剂。本发明提供PCR试剂由试剂A、试剂B和试剂C组成；所述试剂A由所述引物组A和PCR缓冲液组成；所述试剂B由所述引物组B和PCR缓冲液组成；所述试剂C由所述引物组C和PCR缓冲液组成；所述各引物组中各引物在对应的所述PCR试剂中的浓度分别为所述引物 1的终浓度为0. 08-0. 4uM，所述引物1的终浓度具体为0. 12uM;所述引物2的终浓度为0. 08-0. 4uM，所述引物2的终浓度具体为0. 4碰；所述引物3、4、5的终浓度均为 0. 32-0. 4uM，所述引物3、4、5的终浓度具体为0. 28uM0
所述突变位点为L1014F或L1014S。PCR缓冲液为试剂T，购自宝生物工程有限公司，产品号DR011。本发明的第三个目的是提供一种制备检测尖音库蚊中kdr基因突变位点的试剂的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤1)分别将所述的引物中的所述引物组A、所述引物组B和所述引物组C进行独立包装，得到独立包装引物组A、独立包装引物组B和独立包装引物组C ；2)再将步骤1)得到的独立包装引物组A、步骤1)得到的独立包装引物组B和步骤1)得到的独立包装引物组C进行包装，得到试剂。所述突变位点为L1014F或L1014S。由所述方法制备得到的试剂也是本发明保护的范围。本发明的第四个目的是提供一种检测尖音库蚊中kdr基因突变位点的试剂盒。本发明提供的试剂盒，为如下1)或2)1)所示的试剂盒由试剂盒A、试剂盒B和试剂盒C组成；所述试剂盒A为含有所述PCR试剂中的试剂A的试剂盒；所述试剂盒B为含有所述PCR试剂中的试剂B的试剂盒；所述试剂盒C为含有所述PCR试剂中的试剂C的试剂盒；2)所示的试剂盒为含有所述的试剂的试剂盒。所述突变位点为L1014F或L1014S。所述引物或所述试剂或所述试剂盒在检测尖音库蚊中kdr基因突变位点、检测尖音库蚊抗药性或制备检测尖音库蚊抗药性产品中的应用也是本发明保护的范围，所述突变位点为L1014F或L1014S，所述抗药性为抗菊酯类药物；所述菊酯类药物具体为溴氰菊酯、 Es-生物丙烯菊酯、氯菊酯或高效氯氰菊酯。本发明的第五个目的是提供一种检测或辅助尖音库蚊中kdr基因的突变位点的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤用所述引物组A中的所述引物2和所述引物3作为引物对A、用所述引物组B中的所述引物2、所述引物4作为引物对B和用所述引物组C中的所述引物2、所述引物5作为引物对C分别对待测尖音库蚊进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测各组引物扩增得到的产物，若所述引物对B扩增得到366_378bp产物，且所述引物C未扩增得到366_378bp 产物，则所述kdr基因的突变位点为或候选为L1014F ；若所述引物对C扩增得到366_378bp产物，且所述引物B未扩增得到366_378bp 产物，则所述kdr基因的突变位点为或候选为L1014S ；若所述引物对A扩增得到366_378bp产物，且所述引物对B和所述引物对C均未扩增得到366-378bp产物，则所述kdr基因不含或候选不含有所述突变位点。本发明的第六个目的是提供一种检测或辅助检测尖音库蚊中kdr基因的基因型的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤
用所述引物组A中的所述引物2和所述引物3作为引物对A、用所述引物组B中的所述引物2、所述引物4作为引物对B和用所述引物组C中的所述引物2、所述引物5作为引物对C分别对待测尖音库蚊进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测各组引物扩增得到的产物，所述引物对B扩增得到366_378bp产物，且所述引物A和所述引物C均未扩增得到366-378bp产物，则所述kdr基因为含有或候选含有突变位点L1014F的纯合型基因；若所述引物对C扩增得到366_378bp产物，且所述引物A和所述引物B未扩增得到366-378bp产物，则所述kdr基因为含有或候选含有突变位点L1014S的纯合型基因；若所述引物对B和所述引物对C均扩增得到366_378bp产物，且所述引物A未扩增得到366-378bp产物，则所述kdr基因为含有或候选含有突变位点L1014F和L1014S的杂合型基因；若所述引物对A扩增得到366_378bp产物，且所述引物对B和所述引物对C均未扩增得到366-378bp产物，则所述kdr基因为不含或候选不含有突变位点L1014F和L1014S 的纯合型基因；所述PCR扩增中，以待测尖音库蚊的基因组DNA为模板；所述PCR扩增的退火温度为(60-65) °C，退火温度具体为60°C ；所述检测PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。以上PCR扩增中，所述引物组A或B或C中的引物1和引物2进行PCR扩增，得到扩增大小为487-499bp产物；该产物可以用来检测PCR反应体系是否正确，如果有487_499bp 产物，说明该体系正确。本发明的实验证明，本发明提供的了一种快捷、简便、灵敏的尖音库蚊抗药性检测试剂盒，用来掌握尖音库蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性状况。本发明的抗药性检测试剂盒针对与尖音库蚊kdr相关的基因型，抗药性检测试剂盒针对尖音库蚊复合组蚊虫kdr 突变两种与抗性相关的基因型，分别设计了 3组特异性引物，经过一定的配比合成，可以同时检测尖音库蚊复合组的两种突变。采用本发明的抗药性检测试剂盒，只需提取单只蚊虫的DNA，因此对待测蚊虫的数量没有特殊的要求，另外还无需蚊虫的饲养场所和设施，也不需要投入长时间的人力物力来观察，独立1人2小时内即可完成20份样本的检验，被检样本能够准确、有效、直接地检测出点突变，不仅能够区分抗性个体和敏感个体，而且能够鉴定个体基因型。在实验室检验符合率达到95%以上，在中国检科院和江苏省疾病预防控制中心等地试用，颇受好评。判断kdr相关的基因型为研究尖音库蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性奠定基础。
图1为抗性鉴定结果图
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、尖音库蚊抗药性检测
一、PCR 扩增1、引物的设计针对尖音库蚊与除虫菊酯类杀虫剂抗药相关的kdr (Accession number AY573288)基因设计特异性引物CDl :5，AAC TTC ACC GAC TTC ATG CAC 3，(序列 1，下游引物)CD2 :5，CAA GGC TAA GAA AAG GTT AAG AAC 3，(序列 2，上游引物)CD3 :5，CCA CCG TAG TGA TAG GAA ATT TA 3，(序列 3，下游引物)根据kdr的突变体kdr L1014F型突变基因(序列6)设计的特异性引物CDl :5，AAC TTC ACC GAC TTC ATG CAC 3，(序列 1，下游引物)CD2 :5，CAA GGC TAA GAA AAG GTT AAG AAC 3，(序列 2，上游引物)CD4 :5，CCA CCG TAG TGA TAG GAA ATT TA 3，(序列 4，下游引物)根据kdr的突变体kdr L1014S型突变基因(序列7)设计的特异性引物CDl :5，AAC TTC ACC GAC TTC ATG CAC 3，(序列 1，下游引物)CD2 :5，CAA GGC TAA GAA AAG GTT AAG AAC 3，(序列 2，上游引物)CD5 :5，CCA CCG TAG TGA TAG GAA ATT TA 3，(序列 5，下游引物)2、基因组DAN获得分别提取野外捕获的编号为1-6的6只尖音库蚊的基因组DNA，备用，得到编号为 1-6的6只待测样本的DNA。3、待测样本的DNA的PCR扩增(扩增体系如表1)(1)分别取12uL试剂T (宝生物工程有限公司，产品号DR011)加入到3个PCR管中，标记为管A、管B和C管。(2)在管A中加入IuL试剂PA，在管B中加入IuL试剂PB，在管C中加入IuL试剂 Pc(3)取 11. 5uLddH20 至管 A、管 B 和管 C 中。(多个样本检测时，根据以上的配比，分A、B和C管将试剂混合后分装，效果更好)(4)分别取0. 5uL DNA加入到管A、管B和管C中。(5)将以上的管A、管B和管C盖好后，放入PCR仪中，按以下条件设置反应条件 (为了使试剂混勻，稍微离心效果更好)。表1为PCR扩增体系
权利要求
1.一种检测尖音库蚊中kdr基因突变位点的引物，由引物组A、引物组B和引物组C组成所述引物组A包括引物2和引物3，所述引物2和引物3的核苷酸序列分别为序列表中序列2和序列表中序列3 ；所述引物组B包括引物2和引物4，所述引物2和引物4的核苷酸序列分别为序列表中序列2和序列表中序列4 ；所述引物组C包括引物2和引物5，所述引物2和引物5的核苷酸序列分别为序列表中序列2和序列表中序列5。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于所述引物组A还包括引物1，所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列1 ； 所述引物组B还包括引物1，所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列1 ； 所述引物组C还包括引物1，所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列1。
3.根据权利要求1或2所述的引物，其特征在于所述引物组A、所述引物组B和所述引物组C为独立包装；所述引物组A中所述引物1、引物2和引物3的质量比为0-5) 10 (8-5)，所述引物组A中所述引物1、引物2和引物3的质量比具体为3 10 7；所述引物组B中所述引物1、引物2和引物4的质量比为0-5) 10 (8-5)，所述引物组B中所述引物1、引物2和引物4的质量比具体为3 10 7；所述引物组C中所述引物1、引物2和引物5的质量比为0-5) 10 (8-5)，所述引物组C中所述引物1、引物2和引物5的质量比具体为3 10 7； 所述突变位点为L1014F或L1014S。
4.一种检测尖音库蚊中kdr基因突变位点的PCR试剂，由试剂A、试剂B和试剂C组成；所述试剂A由所述引物组A和PCR缓冲液组成； 所述试剂B由所述引物组B和PCR缓冲液组成； 所述试剂C由所述引物组C和PCR缓冲液组成；所述各引物组中各引物在对应的所述PCR试剂中的浓度分别为所述引物1的终浓度为0. 08-0. 4uM,所述引物1的终浓度具体为0. 12uM ；所述引物2的终浓度为0. 08-0. 4uM,所述引物2的终浓度具体为0. 4uM ；所述引物3、4、5的终浓度均为0. 32-0. 4uM，所述引物3、 4、5的终浓度具体为0. 28uM ；所述突变位点为L1014F或L1014S。
5.一种制备检测尖音库蚊中kdr基因突变位点的试剂的方法，包括如下步骤1)分别将权利要求1-3中任一所述的引物中的所述引物组A、所述引物组B和所述引物组C进行独立包装，得到独立包装引物组A、独立包装引物组B和独立包装引物组C ；2)再将步骤1)得到的独立包装引物组A、步骤1)得到的独立包装引物组B和步骤1) 得到的独立包装引物组C进行包装，得到试剂；所述突变位点为L1014F或L1014S。
6.由权利要求5所述的方法制备的试剂。
7.—种检测尖音库蚊中kdr基因突变位点的试剂盒，为如下1)或2)1)所示的试剂盒由试剂盒A、试剂盒B和试剂盒C组成；所述试剂盒A为含有权利要求4所述PCR试剂中的试剂A的试剂盒； 所述试剂盒B为含有权利要求4所述PCR试剂中的试剂B的试剂盒； 所述试剂盒C为含有权利要求4所述PCR试剂中的试剂C的试剂盒；2)所示的试剂盒为含有权利要求6所述的试剂的试剂盒； 所述突变位点为L1014F或L1014S。
8.权利要求1-3中任一所述引物或权利要求4或6所述试剂或权利要求7所述试剂盒在检测尖音库蚊中kdr基因突变位点、检测尖音库蚊抗药性或制备检测尖音库蚊抗药性产品中的应用；所述突变位点具体为L1014F或L1014S，所述抗药性为抗菊酯类药物；所述菊酯类药物具体为溴氰菊酯、Es-生物丙烯菊酯、氯菊酯或高效氯氰菊酯。
9.一种检测或辅助检测尖音库蚊中kdr基因的突变位点的方法，包括如下步骤 用权利要求1-3中任一所述引物或权利要求4或6所述试剂或权利要求7所述试剂盒中的所述引物组A中的所述引物2和所述引物3作为引物对A、用所述引物组B中的所述引物2、所述引物4作为引物对B和用所述引物组C中的所述引物2、所述引物5作为引物对 C分别对待测尖音库蚊进行PCR扩增，得到PCR扩增产物； 检测各组引物扩增得到的产物，若所述引物对B扩增得到366-378bp产物，且所述引物C未扩增得到366_378bp产物， 则所述kdr基因的突变位点为或候选为L1014F ；若所述引物对C扩增得到366-378bp产物，且所述引物B未扩增得到366_378bp产物， 则所述kdr基因的突变位点为或候选为L1014S ；若所述引物对A扩增得到366-378bp产物，且所述引物对B和所述引物对C均未扩增得到366-378bp产物，则所述kdr基因不含或候选不含有所述突变位点。
10.一种检测或辅助检测尖音库蚊中kdr基因的基因型的方法，包括如下步骤用权利要求1-3中任一所述引物或权利要求4或6所述试剂或权利要求7所述试剂盒中的所述引物组A中的所述引物2和所述引物3作为引物对A、用所述引物组B中的所述引物2、所述引物4作为引物对B和用所述引物组C中的所述引物2、所述引物5作为引物对 C分别对待测尖音库蚊进行PCR扩增，得到PCR扩增产物； 检测各组引物扩增得到的产物，若所述引物对B扩增得到366-378bp产物，且所述引物A和所述引物C均未扩增得到 366-378bp产物，则所述kdr基因为含有或候选含有突变位点L1014F的纯合型基因；若所述引物对C扩增得到366-378bp产物，且所述引物A和所述引物B未扩增得到 366-378bp产物，则所述kdr基因为含有或候选含有突变位点L1014S的纯合型基因；若所述引物对B和所述引物对C均扩增得到366-378bp产物，且所述引物A未扩增得到366-378bp产物，则所述kdr基因为含有或候选含有突变位点L1014F和L1014S的杂合型基因；若所述引物对A扩增得到366-378bp产物，且所述引物对B和所述引物对C均未扩增得到366-378bp产物，则所述kdr基因为不含或候选不含有突变位点L1014F和L1014S的纯合型基因；所述PCR扩增中，以待测尖音库蚊的基因组DNA为模板；所述PCR扩增的退火温度为(60-65)°C，退火温度具体为60°C ； 所述检测PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。
全文摘要
本发明公开了一种尖音库蚊抗药性检测试剂盒及其专用引物。本发明提供了一种检测尖音库蚊中kdr基因突变位点的引物，由引物组A、引物组B和引物组C组成所述引物组A由引物1、引物2和引物3组成；所述引物组B由引物1、引物2和引物4组成；所述引物组C由引物1、引物2和引物5组成。本发明的实验证明，本发明提供的了一种快捷、简便、灵敏的尖音库蚊kdr突变的方法，被检样本能够准确、有效、直接地检测出点突变，不仅能够区分抗性个体和敏感个体，而且能够鉴定个体基因型。
文档编号C12Q1/68GK102242215SQ20111019551
公开日2011年11月16日 申请日期2011年7月13日 优先权日2011年7月13日
发明者刘美德, 张映梅, 李春晓, 汪中明, 董言德, 赵彤言, 邢丹, 郭晓霞 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所