专利名称：聚乙烯醇固定产蔗糖异构酶菌体制备异麦芽酮糖方法
技术领域：
本发明属于功能性糖生产领域，涉及一种用聚乙烯醇固定产蔗糖异构酶菌体制备异麦芽酮糖方法。
背景技术：
异麦芽酮糖(Isomaltulose)，也称帕拉金糖(Palatinose)，是一种还原性双糖， 1957年，由Weidenhagen等人在甜菜制作中首先发现。异麦芽酮糖的工业化生产是以蔗糖为原料经蔗糖异构酶(也称α-葡糖基转移酶)异构成异麦芽酮糖浆后，再经脱色离交纯化，浓缩结晶，离心分离干燥而获得。异麦芽酮糖具有与蔗糖类似的甜味特性，其甜度是蔗糖的一半左右，无任何异味。与蔗糖相比，异麦芽酮糖的突出优点体现在(1)低致龋齿特性；( 适合糖尿病人食用。作为一种有前途的功能性甜味剂，异麦芽酮糖已在日本、美国、 西欧等国家得以广泛应用，应用范围包括硬糖、软糖、口香糖、巧克力、焙烤食品、水果罐头、 果酱、运动饮料和牙膏等。另外异麦芽酮糖也是异麦芽酮糖醇(Isomalt)的原料。目前，世界各国如德国、英国、美国和日本等均采用固定化酶法，将蔗糖转化为异麦芽酮糖。在此转化过程中，除了生成异麦芽酮糖之外，还伴随有三种副产品即天蜜糖、葡萄糖和果糖的形成。各种产物之间的生成比例，则因转移酶的来源及其自身性质的不同而各不相同。葡萄糖和果糖是产品中的杂质，会影响异麦芽酮糖的结晶和产品质量，在后提取过程中必须要分离出去。中国专利文献报道了异麦芽酮糖的制备方法，摘录如下中国专利CN1030530C，固定化α -葡糖基转移酶制备帕拉金糖，公开了通过α -葡糖基转移酶菌种发酵、固定化、蔗糖转化及浓缩结晶而制得帕拉金糖的工艺，其工艺过程中采用高岭土吸附并收集发酵液中的菌体，然后采用海藻酸钠与菌体混合，滴入到氯化钙中进行固定化，再经戊二醛交联处理制得用于转化蔗糖液的固定化酶。中国专利CN1330149A，一种异麦芽酮糖的制备方法，工艺过程是先发酵制备产 α -葡糖基转移酶的红色精朊杆菌，然后将菌体加入到蔗糖溶液中进行蔗糖转化，再利用膜技术循环收集转化液，菌体循环连续使用，再将转化液浓缩、结晶、干燥即制得异麦芽酮糖干粉。中国专利CN101200750A，一种大黄欧文氏菌及其在制备异麦芽酮糖中的应用，该发明公开一种大黄欧文氏菌(Erwiniarhapontici)NX-S及利用该菌生产蔗糖异构酶进而制备异麦芽酮糖的方法。将该菌株CGMCC No. 2222接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中进行好气培养，离心或超滤获得含蔗糖异构酶的细胞，进而直接采用游离的含蔗糖异构酶的细胞转化蔗糖生成异麦芽酮糖或固定化含蔗糖异构酶的细胞后转化蔗糖生成异麦芽酮糖。采用该菌株使蔗糖转化率高达99.5% (w/w)，异麦芽酮糖转化率达90 %，转化液中异麦芽酮糖浓度达500g/L，无水解副反应，转化液中几乎不含葡萄糖和果糖，随着反应进行也不会使产物异麦芽酮糖转化为其他成分，对工业化生产异麦芽酮糖十分有益。中国专利CN1680575A，制备结晶异麦芽酮糖和氢化异麦芽酮糖的方法，包括以下步骤1)在α-葡糖基转移酶有活性的条件下使α-葡糖基转移酶与蔗糖水溶液或浆液接触；其中在反应混合物中异麦芽酮糖浓度达到晶体形成的点之后仍然保持所述条件；2)将反应混合物分离成为结晶异麦芽酮糖和剩余糖浆。根据本发明，蔗糖的酶转化和异麦芽酮糖的结晶在同一反应容器中同时进行。另外，酶可以重复使用。中国专利CN1884561A，一种异麦芽酮糖醇的制备方法，其工艺过程为(1)以蔗糖溶液为原料，使蔗糖溶液通过固定化的α-葡糖基转移酶反应柱或罐，制得含有由酶转化而成的异麦芽酮糖和其他杂糖的转化液；( 将所制得的转化液通入其中装有固定化酵母的去杂糖反应罐，以去除转化液中异麦芽酮糖以外的杂糖；(3)再将去杂糖后的转化液离心去残渣后得到含异麦芽酮糖的清液，再将该清液催化加氢制成异麦芽酮糖醇。本发明将第一步所得的转化液通过固定化酵母去掉杂糖，使转化液中的异麦芽酮糖含量提高到98% 以上，再将这种转化液催化加氢生成异麦芽酮糖醇，大大提高了蔗糖原料的利用率；此外， 新方法还可大幅度节约能源，提高生产效率。中国专利CN1434861A，克雷伯氏菌属的细菌分离物以及从其中分离的异麦芽酮糖合酶基因，该发明涉及一种新菌种的两个菌株，即新加坡克雷伯氏菌 (KlebsiellasingaporensidUG及LX21。还涉及编码一种新型异麦芽酮糖合酶KIS的核苷酸序列(kis)。还涉及在植物中产生异麦芽酮糖的方法，此方法包括在该植株细胞中引入一种编码将蔗糖转化成异麦芽酮糖的酶的核酸序列，从而使得转化细胞表达所述的核酸序列。本发明还涉及用于分离编码KIS蛋白的核苷酸序列的功能克隆方法，包括步骤(a)从供体生物体制备基因库，其含有编码在适当的宿主生物体中的异麦芽酮糖生物合成活性的 DNA序列；(b)利用它们的增加的还原糖含量从基因库中筛选目的克隆；(c)分离含有编码具有异麦芽酮糖生物合成活性的蛋白的DNA的克隆。以上专利所公开的生产异麦芽酮糖技术工艺，采用游离的菌体或游离的α -葡糖基转移酶转化蔗糖溶液提高了效率，但由于回收困难致使成本增加，酶的使用寿命较短，不利于生产的连续化。而采用固定化菌体或固定化酶来转化蔗糖则可以较好地解决上述的不足，目前采用海藻酸钠进行固定化的方法已经成功地应用于工业化生产异麦芽酮糖中，但海藻酸钠固定化方法在生产的实际操作中存在以下几个问题1、固定化操作工序多，比较耗时间，效率低，不利于工业化生产；2、固定化菌体的强度不够大，容易在转化过程中变形或破碎，引起菌体的脱落。3、固定化过程中产生废弃物，造成了浪费和污染。此外，异麦芽酮糖最大的用途是经氢化后生成异麦芽酮糖醇，要获得高品质的异麦芽酮糖醇，异麦芽酮糖的纯度要求98%以上，而且最好不能含有非还原性的蔗糖。因为蔗糖不能被氢化，残留的蔗糖在经后继的离交、浓缩等操作时有部分就会分解成葡萄糖和果糖，造成异麦芽酮糖醇的还原糖指标不合格，异麦芽酮糖醇在使用于生产糖果时熬糖温度不高，容易变色，其中的所含的杂糖及蔗糖残留量不超过0. 1%。但在目前转化液的蔗糖残留量一般都会高于1%，通常在3%左右。
发明内容
本发明目的在于针对目前海藻酸钠固定化方法存在的缺点，提供一种操作简便快速、固定化菌体强度大、固定化菌体便于保存、酶活力损失少和不会造成污染浪费的用酶载体聚乙烯醇固定菌体，并提供一种通过产蔗糖异构酶分解转化液中残留的蔗糖，有效降低经结晶后所获得的异麦芽酮糖中蔗糖含量从而制备高质量异麦芽酮糖方法。本发明提供的技术方案是一种聚乙烯醇固定产蔗糖异构酶菌体制备异麦芽酮糖方法，其特征在于包括发酵增殖、收集菌体、菌体固定化、酶转化、酶分解、脱色纯化和浓缩结晶工序，利用酶载体对产蔗糖异构酶进行菌体固定化，加入蔗糖溶液并使蔗糖溶液转化，再用产蔗糖异构酶分解转化液中残留的蔗糖，最后将转化液采用脱色和离子交换进行纯化，经浓缩结晶，离心分离后制得异麦芽酮糖产品，所述的菌体收集采用高速离心或膜过滤收集菌体。以上所述的发酵增殖是将产蔗糖异构酶加入发酵培养基中发酵增殖，控制温度 25 30°C，ρΗ 5. 0 7. 5，通气量0. 2 1. 2V/V.m，时间12 72小时。以上所述的产蔗糖异构酶，主要包括Protaminobacter rubrum(CBS 574.77)、 Erwinia rhapontici(NCPPB 1578)、 Serratia phymuthica(ATCC 15928)禾口 Serratia marcescens(NCIR8285)。以上所述的发酵培养基组分为蔴糖1 8% (W/V)，酵母膏或酵母提取物0. 5 4% (ff/V), (NH4) 2HP040. 1 % (W/V)。以上所述的菌体固定化是将水煮开，加入酶载体4 50% (W/W)充分搅拌为均勻浆液，待温度降至25 30°C后，在浆液中加入湿菌体5 30% (W/W)，充分搅拌均勻后置约零下20°C硬化保存，使用时将固定化菌取出置于室温下自然解冻，然后切成颗粒。以上所述的酶载体为聚乙烯醇或/和硅藻土，聚乙烯醇与硅藻土比例为 2 0. 8 1. 2。以上所述的酶转化是将固定化菌体置于反应器或填充于反应柱中，加入浓度为 20 60% (W/V)的蔗糖溶液，在温度为25 32°C，pH4. 5 7. 5的条件下转化为异麦芽酮糖，当转化液中蔗糖的残留小于3% (W/V)时中止转化。以上所述的酶分解是将收集酶转化后的异麦芽酮糖糖液于罐中，加入产蔗糖异构酶分解残留的蔗糖，每立方转化液的产蔗糖异构酶用量1 20克，控制温度40 70°C。本发明的优点和积极效果1、采用本发明方案用聚乙烯醇固定产蔗糖异构酶菌体制备异麦芽酮糖，产品纯度 98%以上。2、聚乙烯醇固定产蔗糖异构酶菌体制备异麦芽酮糖，固定化操作工序少，整个制备过程操作简便快速，效率较高，利于工业化生产。3、固定化菌体载体采用聚乙烯醇，强度大，在转化过程中不易变形或破碎，有效保护菌体从载体上脱落，固定化过程中不易产生废弃物，使用寿命长，降低了制备成本和减少污染。4、固定化菌体便于保存、酶活力损失少，在-20°C下保存三个月以上不会导致蔗糖异构酶活性的明显下降，不会造成污染浪费。
具体实施例方式下面通过实施例，对本发明的技术方案进一步具体的说明。实施例1在30升发酵罐中，加入22升发酵培养基，灭菌后接入菌种ftOtaminobacterrubrum(CBS574. 77)2升，培养基蔗糖4% (W/V)，酵母膏2% (W/V)酵母提取物0.4% (W/ V)，(NH4) 2ΗΡ040· 1 % (W/V)，发酵温度为300C，pH值为6. 5，通气量为0. 8V/V. m的条件下搅拌进行发酵培养，搅拌速度为300rpm，发酵48小时后用0. 2 μ m的陶瓷膜过滤收集菌体，得到约1升湿菌体浓度30 %的菌体悬液。将1. 6升水煮开后，加入0. 45公斤聚乙烯醇，搅拌，继续加热到聚乙烯醇充分溶解，然后加入0. 23公斤硅藻土搅拌均勻，冷却到30°C后加入菌体悬液，充分搅拌均勻，放入-20°C冰箱中M小时。当要使用时将固定化菌体取出自然解冻，用剪刀或切粒机切成直径约3nm的颗粒，装入到直径10cm、高50cm的反应柱中，反应柱的底部通入浓度为阳％ (W/V)的蔗糖溶液，调整流速以保证流出的转化液中蔗糖的残留量小于3% (W/V)，转化温度控制在30°C，pH为6.5。此时所获得的转化液组份(W/V) 异麦芽酮糖81. 5%，异海藻糖9. 5%，蔗糖2. 5%，葡萄糖2. 5%，果糖3. 0%，其它1%。转化液不断收集至40升的量，转化液倒入容器中升温至55°C，加入0. 2克ftOtaminobacter rubrum(CBS 574. 77)酶，反应 4. 5 小时后，经检测，此时经 Protaminobacter rubrum(CBS 574. 77)酶分解后的转化液组分(W/V)为异麦芽酮糖81.5%，异海藻糖9.5%，蔗糖0.2%， 葡萄糖3. 7 %，果糖4. 1 %，其它1 %。经脱色过滤、离交、浓缩结晶后，离心分离得到异麦芽酮糖晶体，纯度达98. 6% (W/W)，没有检测到蔗糖的残留。固定化菌体经过连续20天转化后，酶活没有明显下降，固定化菌体也没有任何变形现象。实施例2在30升发酵罐中，用Erwinia rhapontici (NCPPB 1578)为发酵菌种，按实施例一的发酵工艺和固定化工艺制取得到固定化菌体，将固定化菌体放入到30升批式反应器中， 加入20升浓度为35% (W/V)蔗糖溶液，在沈.5°C，pH为5. 5条件下搅拌转化，待转化液中的蔗糖量小于2. 6%时，停止转化，加入新蔗糖液进行转化，收集两批转化液共40升，转化液倒入容器中升温至45°C，加入0. 3克Erwinia rhapontici (NCPPB 1578)酶，反应5小时后， 经检测，此时经Erwinia rhapontici (NCPPB 1578)酶分解后的转化液组分(W/V)为异麦芽酮糖77.5%，异海藻糖16.5%，葡萄糖2. 3 %，果糖2. 6 %，其它0. 8 %。经脱色过滤、离交、 浓缩结晶后，离心分离得到异麦芽酮糖晶体，所获得的异麦芽酮糖晶体纯度也达到98. 3%, 也没有检测到蔗糖的残留。固定化菌体转化20批后，固定化菌体没有产生变形现象，酶活也没有明显下降。实施例3在30升发酵罐中，用krratia phymuthica(ATCC 15928)为发酵菌种，按实施例一的发酵工艺和固定化工艺制取得到固定化菌体，将固定化菌体放入到30升批式反应器中，加入20升浓度为35% (W/V)蔗糖溶液，在30°C，pH为5. 5条件下搅拌转化，待转化液中的蔗糖量小于2. 6 %时，停止转化，加入新蔗糖液进行转化，收集两批转化液共40升，转化液倒入容器中升温至55°C，加入0. 25克产蔗糖异构酶，反应3. 5小时后，经检测，此时经产蔗糖异构酶分解后的转化液组分(W/V)为异麦芽酮糖77. 3%，异海藻糖14. 5%，葡萄糖 2. 1 %，果糖3. 2%，其它0. 9 %。经脱色过滤、离交、浓缩结晶后，离心分离得到异麦芽酮糖晶体，所获得的异麦芽酮糖晶体纯度也达到98. 1%，也没有检测到蔗糖的残留。固定化菌体转化20批后，固定化菌体没有产生变形现象，酶活也没有明显下降。
权利要求
1.一种聚乙烯醇固定产蔗糖异构酶菌体制备异麦芽酮糖方法，包括发酵增殖、菌体固定化、蔗糖的酶转化、脱色纯化和浓缩结晶工序，其特征在于利用酶载体对产蔗糖异构酶进行菌体固定化，加入蔗糖溶液并使蔗糖溶液转化，再用产蔗糖异构酶分解转化液中残留的蔗糖，最后将转化液采用脱色和离子交换进行纯化，经浓缩结晶，离心分离后制得异麦芽酮糖产品，所述的菌体收集采用高速离心或膜过滤收集菌体。
2.根据权利要求1所述的聚乙烯醇固定产蔗糖异构酶菌体制备异麦芽酮糖方法，其特征在于所述的发酵增殖是将产蔗糖异构酶加入发酵培养基中发酵增殖，控制温度25 30°C, ρΗ 5. 0 7. 5，通气量 0. 2 1. 2V/V. m，时间 12 72 小时。
3.根据权利要求1或2所述的聚乙烯醇固定产蔗糖异构酶菌体制备异麦芽酮糖方法，其特征在于所述的产蔗糖异构酶菌株包括frotaminobacter rubrum(CBS 574. 77)、 Erwinia rhapontici(NCPPB 1578)和 Serratia phymuthica(ATCC 15928)。
4.根据权利要求2所述的聚乙烯醇固定产蔗糖异构酶菌体制备异麦芽酮糖方法，其特征在于所述的发酵培养基组分为蔗糖1 8% (W/V)，酵母膏或酵母提取物0. 5 4% (W/V)，(NH4) 2ΗΡ04 0. 1 % (W/V)。
5.根据权利要求1所述的聚乙烯醇固定产蔗糖异构酶菌体制备异麦芽酮糖方法，其特征在于所述的菌体固定化是将水煮开，加入酶载体4 50% (W/W)充分搅拌为均勻浆液， 待温度降至25 30°C后，在浆液中加入湿菌体5 30% (W/W)，充分搅拌均勻后置约零下 20°C硬化保存，使用时将固定化菌取出置于室温下自然解冻，然后切成颗粒。
6.根据权利要求1或5所述的聚乙烯醇固定产蔗糖异构酶菌体制备异麦芽酮糖方法， 其特征在于所述的酶载体为聚乙烯醇或/和硅藻土，聚乙烯醇与硅藻土比例为2 0.8 1. 2。
7.根据权利要求1所述的聚乙烯醇固定产蔗糖异构酶菌体制备异麦芽酮糖方法，其特征在于所述的酶转化是将固定化菌体置于反应器或填充于反应柱中，加入浓度为20 60% (W/V)的蔗糖溶液，在温度为25 32°C，pH4. 5 7. 5的条件下转化为异麦芽酮糖，当转化液中蔗糖的残留小于3% (W/V)时中止转化。
8.根据权利要求1所述的用一种聚乙烯醇固定产蔗糖异构酶菌体制备异麦芽酮糖方法，其特征在于所述的酶分解是将收集酶转化后的异麦芽酮糖糖液置于罐中，加入产蔗糖异构酶分解残留的蔗糖，每立方转化液的产蔗糖异构酶用量1 20克，控制温度40 70 °C。
全文摘要
本发明公开了一种聚乙烯醇固定产蔗糖异构酶菌体制备异麦芽酮糖方法，利用聚乙烯醇或/和硅藻土比例为2∶0.8～1.21的酶载体4～50％(W/W)水溶液浆液，在温度25～30℃加入产蔗糖异构酶湿菌体5～30％(W/W)，搅拌均匀后置于-20℃以下硬化备用，使用时将固定化酶菌取出置于室温下自然解冻，然后切成颗粒，加入蔗糖溶液异构转化，再用产蔗糖异构酶分解转化液中残留的蔗糖，然后将转化液采用脱色和离子交换进行纯化，经浓缩结晶，离心分离后制得异麦芽酮糖产品。本方法具有操作简单高效、材料便宜易得、固定化菌颗粒强度高、不易破碎、蔗糖异构酶活性高、使用寿命长等优点，异麦芽酮糖质量好，纯度大于98％，蔗糖残留量小于0.1％，更适合用于通过氢化反应制备高质量的异麦芽酮醇。
文档编号C12R1/18GK102286454SQ201110182498
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月1日 优先权日2011年7月1日
发明者卢汉浪, 唐峰, 蒋永强, 陈业良 申请人:广西科学院生物研究所