专利名称：用于临床检测血清或血浆游离脂肪酸的试剂盒及其方法
技术领域：
本发明涉及生物化学、检验试剂技术领域，具体涉及一种用于临床检测血清或血浆游离脂肪酸(NEFA)的试剂盒及其方法。
背景技术：
游离脂肪酸(FreeFatty acids, FFA),也叫非酯化脂肪酸(non-estered fattyacids，NEFA)，是人体内脂肪的水解产物。甘油三酯在脂肪酶的作用下，释放出游离脂肪酸，它们在血液中流通，与白蛋白结合转运。游离脂肪酸在人体内可作为代谢能量的来源、细胞膜结构的底物以及许多细胞内信号分子的前体(例如前列腺素)。虽然它们只占身体脂肪 很小的一部分，但却是人体重要的能源物质之一，满足了能量需求的很大部分，与糖代谢、脂肪代谢有着密切联系。游离脂肪酸的代谢异常在胰岛素抵抗、高胰岛素症、高血压、糖尿病等疾病发展过程中起着非常重要的作用，其水平的升高可见于一些病理状态如胰岛素抵抗/2型糖尿病、肥胖、恶性疾病和代谢综合征，并会引发心血管疾病。我国目前有一亿六千万左右的高血压患者，其中近50%伴有腹型肥胖、高血脂及糖耐量异常，即伴有代谢综合征的表现。因此在临床上游离脂肪酸的测定用于内分泌疾病、肝病以及糖尿病等疾病的体外辅助诊断。目前临床采用酶法测定人血清或血浆中游离脂肪酸的含量，其反应原理为游离脂肪酸在酰基辅酶A合成酶(ACS)的作用下与过量辅酶A(Co-A)生成酰基辅酶A，酰基辅酶A在酰基辅酶A氧化酶(ACO)作用下与氧气(O2)反应生成2，3-反式-烯酰基辅酶A和过氧化氢(H2O2)，利用Trinder反应即过氧化氢在催化剂过氧化物酶(POD)、显色剂4-氨基安替比林(4-AAP)存在下与色原物质生成红色醌亚胺化合物，得到显色物质，然后比色法得出测定的游离脂肪酸的含量。具体反应步骤如下
(I) FFA+Co-A+ ATP ——— 酰基辅酶 A +AMP+ Pi
(2)酰基辅酶A+O2——_ 2,3-反式-烯酰基辅酶A+H2O2
(3)H2O2+ 色原 +4-AAP_P2P_ 显色物质 +H2O目前市售的用于临床测定血清或血浆游离脂肪酸的酶法试剂盒，存在的主要问题如下(I)稳定性差，其试剂一般以干粉与缓冲液的形式出售，临用时配成工作液，而工作液的稳定性在一周之内。稳定性差的原因主要为步骤(I)中过量的辅酶A会干扰步骤
(3)反应，辅酶A会与色原反应，从而使整个检测结果偏低，所以必须在步骤(I)反应完成后去除多余的辅酶A，所以目前市售的试剂盒采用N-乙基马来酰亚胺(NEM)去除多余的辅酶A，而N-乙基马来酰亚胺的稳定性非常受限，最多只有一个星期，导致整个试剂盒稳定性不好。
(2)样本测定结果之间有差异，主要是由于现有技术所采用的酰基辅酶A合成酶与酰基辅酶A氧化酶对不同游离脂肪酸的底物特异性不同造成的。不同来源的酰基辅酶A合成酶与酰基辅酶A氧化酶对于不同C链长度的游离脂肪酸的底物特异性不同，即反应能力大小不同。而人血清中载有6种游离脂肪酸油酸、棕榈酸、亚油酸、硬脂酸、花生四烯酸及亚麻酸。只有对上述六种游离脂肪酸反应特异性都高的酶，才能保证测得的游离脂肪酸的准确度，才能确保样本测定结果之间无差异。
(3)线性范围窄，主要是由于现有技术所采用的用于步骤(3)中的色原受辅酶A干扰而导致其活性下降所致。用于检测游离脂肪酸的色原必须具有以下特性①为Trinder反应色原受辅酶A干扰少或者无干扰；③摩尔吸光系数高，反应灵敏度高；④稳定性好；⑤产物吸收峰在500 700nm。目前市场上测定游离脂肪酸所采用的Trinder反应色原主要有MEHA、TBHB, TOOS等，这些色原均受辅酶A的干扰比较大，而辅酶A在反应中的用量必须是过量的，所以使得这些色原的反应活性下降，从而使试剂盒检测的线性范围变窄。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服以上现有技术问题的不足，提供一种稳定性好、游离脂肪酸特异性好、线性范围广的用于临床检测血清或血浆游离脂肪酸的试剂盒及其方法。为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为提供一种用于临床检测血清或血浆游离脂肪酸的试剂盒，该试剂盒由以下两种试剂构成，其中试剂I :
缓冲液20 200 mmol/L
ATPI 5 mmol/L
辅酶A10 30g/L
4-氨基安替比林0.3 6 mmol/L
离子激活剂5 20 mmol/L
酰基辅酶A合成酶 100 1000 U/L稳定剂I 100g/L
防腐剂0.1 100g/L
表面活性剂I 100ml/L
浓盐酸(37%)2 20ml/L;试剂2:缓冲液20 200 mmol/L
色原0.2 20 mmol/L
复合巯基试剂100 300ml/L
过氧化物酶20 200 kU/L
酰基辅酶A氧化酶5 15 kU/L
稳定剂I 100g/L
防腐剂0.1 100g/L
表面活性剂I 100 ml/L
浓盐酸(37%)2 20 ml/L。本发明的上述试剂I和试剂2中的缓冲液为磷酸盐缓冲液(如磷酸钾缓冲液)，或Tris缓冲液，或甘氨酸缓冲液，或GOOD’ S缓冲液。本发明的上述试剂I中的离子激活剂为激活酰基辅酶A合成酶和酰基辅酶A氧化酶的离子激活剂，为镁离子、铁离子、钡离子、锌离子、钙离子等二价离子或钠离子、钾离子、锂离子等一价离子中的一种。本发明的上述试剂2中的色原为本发明的关键所在。该色原为受辅酶A干扰少或者无干扰且灵敏度高的Trinder反应色原，进一步优选为TOPS。本发明从ADOS、ADPS、ALPS、DAOS、HDAOS、SCEP、TOPS、TODB、MADB、MAOS 等 10 种Trinder反应色原中，以上述检测游离脂肪酸色原必须具备的特性② ⑤为标准进行筛选，发现ADOS、TOPS、SCEP受辅酶A的干扰少，其中，SCEP几乎不与辅酶A发生反应，但它的稳定性很差，见光分解，配成试剂后随着时间的推移颜色会发生一系列变化。而AD0S、TOPS虽会受到辅酶A的一些干扰，但反应体系中至少有80 %色原有活性，且稳定性很好，配制试剂I年之内活性下降不超过5%。ADOS与TOPS相比较，TOPS的摩尔吸光系数为3. 74X 104(550nm)，而ADOS仅为2. 72 X IO4 (550nm)，故TOPS的反应灵敏度更高。其他色原受辅酶A的干扰很大，试剂中最多保留30%色原有活性。综合考虑，TOPS符合游离脂肪酸测定的需求，可以用于制备商品化试剂盒。当然，其他Trinder反应色原如果满足上述② ⑤标准，也可以用于游离脂肪酸的测定。本发明的上述试剂2中的复合巯基试剂为本发明的另一关键所在。该复合巯基试剂为以下配方试剂
GOOD’s 缓冲液20 200 mmol/L
N-乙基马来酰亚胺(NEM)200 500 ml/L
DTNB (5,5-二巯基-2,2-二硝基苯甲酸)500 700 ml/L
EDTA (乙二胺四乙酸)20 50 ml/L
MIT (2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)20 50 ml/L
曲拉通 X-100 (Triton X-100)I 100 ml/L
浓盐酸(37%)2 20 ml/L。、
所述复合巯基试剂的特点在于⑴减少NEM的用量至现有技术的20 50%，从而减少由于该物质的不稳定性导致的整个试剂的不稳定；(2)加入DTNB，DTNB也是一种巯基物质，可以与辅酶A的巯基反应而去除辅酶A对色原的干扰，并形成在405nm有吸收的黄色物质，而试剂盒的主反应在500 700nm范围内有最大吸收，故不会对反应造成干扰；同时DTNB的稳定性很好，且与NEM的作用相同，所以对试剂盒的稳定性也有一定的改进；(3)加入MIT，MIT也有部分消除巯基的作用，故加入少量的MIT去除辅酶A的巯基，同时也起到一个防腐剂的作用。采用该复合巯基试剂，经实验证明在采用TOPS色原的基础上，其能完全消除辅酶A带来的干扰，同时试剂盒的稳定性也大大提高，2-8°C可稳定I年。
本发明的上述试剂I中的酰基辅酶A合成酶从MKll-I菌株中制备，MKll-I菌株为自行筛选的菌种。MKll-I菌株分类命名为假单胞菌,拉丁文学名为Pseudomonas sp.,保藏于位于我国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2011年5月16日，保藏编号为CGMCC No. 4864。本发明的上述试剂2中的酰基辅酶A氧化酶从MKl 1-2菌株中制备，MKl 1-2菌株为自行筛选的菌种。MKl 1-2菌株分类命名为假丝酵母，拉丁文学名为Candida sp.，保藏于位于我国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2011年5月16日，保藏编号为CGMCC No. 4863。所述酰基辅酶A合成酶和酰基辅酶A氧化酶是本发明的第三个关键所在。本发明从炼油厂附近的土壤采样，经过筛菌，各筛到五株高活力的酰基辅酶A合成酶和酰基辅酶A氧化酶的菌株，并分别测定其对人血清中六种游离脂肪酸的活力，根据不同底物活力高低再各筛到一株菌产酰基辅酶A合成酶的菌为Pseudomonas sp.，记为MK11-1，产酰基辅酶A氧化酶的菌为Candida sp.,记为MKl 1-2.。从上述两种菌中分离纯化出的酰基辅酶A合成酶和酰基辅酶A氧化酶对血清中游离脂肪酸的活力测定如下，因油酸在人血清中含量最高，故以油酸(ImM)活力记为100%，其它活力与油酸活力作比较得出。酰基辅酶A合成酶
底物(ImM)相对活力(％)
油酸100
棕榈酸102
亚油酸95
硬脂酸98
花生四烯酸92
亚麻酸100酰基辅酶A氧化酶底物(ImM)相对活力(％)
油酸-CoA100
棕榈酸-CoA99
亚油酸-CoA102
硬脂酸-CoA98
花生四烯酸-CoA95
亚麻酸-CoA97由上述表格可以看出，制备的酰基辅酶A合成酶和酰基辅酶A氧化酶对人血清中游离脂肪酸的反应特异性都很高，因此可以认为采用该两种酶可以真实地测定出人血清中游离脂肪酸的含量。本发明试剂I和试剂2中的稳定剂为牛血清白蛋白(BSA)或多元醇或多糖。其中，多元醇为甘油或乙二醇或PEG 2000 (PEG为聚乙二醇)或者PEG 6000，多糖为蔗糖或麦芽糖或可溶性淀粉。本发明试剂I和试剂2中的防腐剂为柳硫汞，或叠氮化合物(如叠氮钠)，或PC系列防腐剂(如PC300)。本发明试剂I和试剂2中的表面活性剂为吐温80 (Tween 80)，或曲拉通X-100 (Triton X-100，聚乙二醇辛基苯基醚)，或乳化剂0P。本发明试剂盒中的两种试剂配置工艺如下(I)配制试剂I :在洁净的玻璃容器中首先加入按配方比例已称量好的缓冲液，然后依次加入ATP、辅酶A、4-氨基安替比林、离子激活剂、稳定剂、防腐剂，加入适量水后加入表面活性剂，用浓盐酸调节PH到pH 6 9，最后加入酰基辅酶A合成酶，然后搅拌过滤，所得滤液中再加入蒸馏水到定量得试剂I (即如以IL试剂I为定量，要求配置过程中各原料加入量满足在IL试剂I中为配方比例含量,试剂2、复合巯基试剂也满足上述条件)。(2)配制试剂2 :在洁净的玻璃容器中首先加入按配方比例已称量好的缓冲液，然后依次加入色原、复合巯基试剂、稳定剂、防腐剂，加入适量水后加入表面活性剂，用浓盐酸调节PH到pH 6 9，最后加入过氧化物酶和酰基辅酶A氧化酶，然后搅拌过滤，所得滤液中再加入蒸馏水到定量。(3)将上述所配制的试剂灌装分至小瓶，以供医疗检验用将试剂I灌装40mLX I瓶备用；将试剂2灌装IOmLX I瓶备用。(4)要求配制上述两种试剂的操作过程均在无菌车间里进行，试剂I为无色或者淡黄色透明液体，试剂2为黄色液体，配制好后在2 8°C保存，可至少稳定I年。本发明所要解决的另一技术问题是，提供本发明用于临床检测血清或血浆游离脂肪酸的方法。该方法依赖上述酶法原理，具体包括以下步骤(I)取试剂I与样本以一定比例混匀，孵育一定时间，读取吸光值Al ；(2)加入试剂2，混匀，孵育一定时间，读取吸光值A2 ；(3)计算，样本中游离脂肪酸浓度=标准液浓度XQAm/AA#—)，AA_ =A2-A1。、
与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果用于临床检测血清或血浆游离脂肪酸的试剂盒I.液体即用型试剂，可直接应用与全自动生化仪，提高检测速度。2.对反应所需色原进行筛选，筛选出适于测定游离脂肪酸的色原，提高试剂盒稳定性，改善试剂盒的灵敏度。3.采用复合巯基试剂，彻底去除 辅酶A的干扰，提高试剂盒稳定性至2-8 °C下可保存I年。4.采用自己分离纯化的酰基辅酶A合成酶与酰基辅酶A氧化酶，对人血清中的六种游离脂肪酸都具有高度特异性，从而提高了试剂盒测定的准确度。5.试剂盒的线性范围广，为0 5mM。本发明针对目前市场上游离脂肪酸测定试剂盒存在的稳定性不好、测定范围不一致、线性范围窄等缺点，采用TOPS等色原、复合巯基试剂，提高了试剂盒的稳定性与灵敏度，也扩充了检测范围，同时也自行筛选、制备了对血清游离脂肪酸高度特异的酰基辅酶A合成酶与酰基辅酶A氧化酶，提高了测定的准确度。临床试验表明，用该试剂盒进行人血清或血浆游离脂肪酸测定时，对人血清中六种游离脂肪酸都有很高的特异性，测量精确度高，样本测定结果之间无差异；反应灵敏读度高，微量或浓度高的样本都能准确检测出来，线性范围广；试剂稳定性好，I年内测试结果显示无差异。所以，该试剂盒适用于临床血清或血浆游离脂肪酸的测定。用于临床检测血清或血浆游离脂肪酸的方法本发明为根据酶法原理进行检测的方法，游离脂肪酸的羧基在过量辅酶A存在下生成酰基辅酶A，酰基辅酶A与过量O2反应生成11202，H2O2再氧化显色剂生成显色物质，最后通过比色得出显色物质的吸光值，所以游离脂肪酸的含量最终被显示到显色物质的吸光值读数上。然后根据用相同方法测定的已知游离脂肪酸浓度的标准液的吸光值，根据公式样本中游离脂肪酸浓度=标准液浓度X (AA#^/AAw), AAt^i= A2-A1，便可得出被测样本中游离脂肪酸的浓度。该方法精确度高、测量误差小，是科学的测量方法。
附图所示的是本发明临床检测血清或血浆游离脂肪酸的试剂盒及其方法的实施例I中SDS-PAGE电泳图。其中M、marker ;1、酰基辅酶A合成酶；2、酰基辅酶A氧化酶。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。MKll-I菌株,分类命名为假单胞菌,拉丁文学名为Pseudomonas sp.,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2011年5月16日，保藏编号为CGMCC No. 4864。MK11-2菌株,分类命名为假丝酵母,拉丁文学名为Candida sp.,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2011年5月16日，保藏编号为 CGMCC No. 4863。
实施例I :巯基试剂的配制HEPES 缓冲液100 mmol/L
NEM300 ml/L
DTNB600 ml/L
EDTA40 ml/L
MIT50 ml/L
Triton X-1005 ml/L
浓盐酸(37%)5 ml/L在洁净的玻璃容器中首先加入按配方比例已称量好的HEPES缓冲液(GOOD’ s缓冲液即两性离子缓冲液，包括JEPES缓冲液、MES缓冲液、MOPS缓冲液等)，然后依次加入300ml/L 的 NEM、600ml/L DTNB,40ml/L EDTA、50ml/L MIT，加入适量水后加入 5ml/L TritonX-100，用浓盐酸调节pH到pH 6 9，用量约为5ml/L，然后搅拌过滤，所得滤液中再加入蒸馏水到定量。酰基辅酶A合成酶与酰基辅酶A氧化酶的制备(I)酰基辅酶A合成酶的制备培养MKll-I菌株，收集细胞，超声破碎，离心取上清，经30 70%硫酸铵沉淀、等电点沉淀、DEAE-Cellulose 32柱层析、分子筛层析后,经SDS-PAGE验证，为一条单带，分子量为60KDa，说明已得到酰基辅酶A合成酶纯酶(见附图中条带I)。(2)酰基辅酶A氧化酶的制备培养MK11-2菌株，收集细胞，超声破碎，离心取上清，经2 0 6 0 %丙酮沉淀、等电点沉淀、D EAE - C e 11 u IO s e 3 2柱层析、分子筛层析后，经SDS-PAGE验证，为一条单带，分子量为80KDa，说明已得到酰基辅酶A氧化酶纯酶(见附图中条带2)。用于临床检测血清或血浆游离脂肪酸的试剂盒，由以下两种试剂构成试剂I :
Tris 缓冲液100 mmol/L
ATP5 mmol/L
辅酶A20 g/L4-APP5 mmol/L
MgCl25 mmol/L
酰基辅酶A合成酶500 U/L
BSA2 g/L
叠氮钠2 g/L
Triton X-1005 ml/L
浓盐酸(37%)10 ml/L试剂2
Tris 缓冲液100 mmol/L
色原8 mmol/L
复合疏基试剂250 ml/L
过氧化物酶85 kU/L
酰基辅酶A氧化酶10kU/L
BSA2 g/L
叠氮钠2 g/L
Triton X-1005 ml/L
浓盐酸(37%)10 ml/L实施例2 巯基试剂的配制
MES 缓冲液30 mmol/L
NEM200 ml/L
DTNB550 ml/L
EDTA22 ml/L
MIT25 ml/L
Triton X-1007 ml/L
浓盐酸(37%)6 ml/L配制方法同实施例I。酰基辅酶A合成酶与酰基辅酶A氧化酶的制备同实施例I。用于临床检测血清或血浆游离脂肪酸的试剂盒，由以下两种试剂构成试剂I :
磷酸钾缓冲液50 mmol/L
、ATP1.2 mmol/L
辅酶A10 g/L
4-APP0.55 mmol/L
MgCl212 mmol/L
酰基辅酶A合成酶100 U/L
BSA3 g/L
叠氮钠0.2g/L
Triton X-100I ml/L
浓盐酸(37%)2 ml/L试剂2
憐酸钾缓冲液50 mmol/L
色原0.5 mmol/L复合巯基试剂 100 ml/L
过氧化物酶25 kU/L 酰基辅酶A氧化酶 5 kU/L BSA 3 g/L
叠氮钠0.2g/L TritonX-IOO I ml/L
浓盐酸(37%)2 ml/L实施例3 巯基试剂的配制
MOPS 缓冲液20 mmol/L
NEM500 ml/L
DTNB680 ml/L
EDTA45 ml/L
MIT45 ml/L
Triton X-10075 ml/L
浓盐酸(37%)18 ml/L配制方法同实施例I。酰基辅酶A合成酶与酰基辅酶A氧化酶的制备同实施例I。 用于临床检测血清或血浆游离脂肪酸的试剂盒，由以下两种试剂构成试剂I :甘氨酸缓冲液200 mmol/L
ATP18 mmol/L
辅酶A30 g/L
4-APP5 mmol/L
MgCl218 mmol/L
酰基辅酶A合成酶1000 U/L
BSA50 g/L
叠氮钠80g/L
Triton X-10095 ml/L
浓盐酸(37%)20ml/L试剂2
甘氨酸缓冲液200 mmol/L
色原20 mmol/L
复合巯基试剂280 ml/L
过氧化物酶185kU/L
酰基辅酶A氧化酶15 kU/L
BSA50 g/L
叠氮钠80g/L
Triton X-10095 ml/L
浓盐酸(37%)20ml/L测定样本时，采用两点终点法，温度为37°C，主波长为550nm，反应方向向上(正反应)，加样步骤如下样本4 U L试剂I200 ii L混勻，置37°C孵育3_5min，读取吸光值Al试剂250 u L混匀，孵育3-5min，读取时吸光度A2AA#^= A2-A1
Aa样本
游离脂肪酸(mmol/L)=标准液浓度(mmol/L) X——-
ZXA标淮液采用全自动生化仪操作，仪器会根据定标结果自动给出样本中游离脂肪酸的浓度。本发明所用试剂除有特别说明外，均为普通市售商品。
本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。权利要求
1.一种用于临床检测血清或血浆游离脂肪酸的试剂盒，其特征在于由以下两种试剂构成，其中 试剂I: 缓冲液20 200 mmol/L ATPI 5 mmol/L 辅酶A10 30g/L 4-氨基安替比林0.3 6 mmol/L 尚子激活剂5 20 mmol/L 酰基辅酶A合成酶100 1000 U/L 稳定剂I 100g/L 防腐剂0.1 100g/L 表面活性剂I 100 ml/L浓盐酸2 20 ml/L； 试剂2 缓冲液20 200 mmol/L 色原0.2 20 mmol/L 复合巯基试剂100 300 ml/L 过氧化物酶20 200 kU/L 酰基辅酶A氧化酶5 15kU/L 稳定剂I 100g/L防腐剂0.1 100g/L 表面活性剂I 100 ml/L浓盐酸2 20 ml/L。
2.根据权利要求I所述的用于临床检测血清或血浆游离脂肪酸的试剂盒，其特征在于所述试剂I和试剂2中的缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液或甘氨酸缓冲液或GOOD’ S缓冲液。
3.根据权利要求I所述的用于临床检测血清或血浆游离脂肪酸的试剂盒，其特征在于所述试剂I中的离子激活剂为激活酰基辅酶A合成酶和酰基辅酶A氧化酶的离子激活齐U，为镁离子、铁离子、钡离子、锌离子、钙离子等二价离子或钠离子、钾离子、锂离子等一价离子中的一种。
4.根据权利要求I所述的用于临床检测血清或血浆游离脂肪酸的试剂盒，其特征在于所述试剂2中的色原为受辅酶A干扰少或者无干扰且灵敏度高的Trinder反应色原。
5.根据权利要求4所述的用于临床检测血清或血浆游离脂肪酸的试剂盒，其特征在于所述试剂2中的色原为TOPS。
6.根据权利要求I所述的用于临床检测血清或血浆游离脂肪酸的试剂盒，其特征在于所述试剂2中的复合巯基试剂为以下配方试剂GOOD’s 缓冲液20 200mmol/LN-乙基马来酰亚胺200 500ml/LDTNB500 700 ml/LEDTA20 50 ml/L MIT20 50 ml/L 曲拉通 X-100I 100 ml/L 浓盐酸2 20 ml/L。
7.根据权利要求I所述的用于临床检测血清或血浆游离脂肪酸的试剂盒，其特征在于所述试剂I中的酰基辅酶A合成酶从Pseudomonas sp. MKll-I菌株中制备，MKll-I菌株为自行筛选的菌种，于2011年5月16日在北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC No. 4864。
8.根据权利要求I所述的用于临床检测血清或血浆游离脂肪酸的试剂盒，其特征在于所述试剂2中的酰基辅酶A氧化酶从Candida sp. MKl 1-2菌株中制备，MKl 1-2菌株为自行筛选的菌种，于2011年5月16日在北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC No. 4863。
9.一种用于临床检测血清或血浆游离脂肪酸的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)取试剂I与样本以一定比例混勻，孵育一定时间，读取吸光值Al； (2)加入试剂2，混匀，孵育一定时间，读取吸光值A2； (3)计算，样本中游尚脂肪酸浓度=标准液浓度X( Δ ΔΑ_@)，Δ A#*= Α2-Α1。
全文摘要
本发明为公开了一种用于临床检测血清或血浆游离脂肪酸的试剂盒及其方法，该试剂盒由试剂1和试剂2两种试剂构成，其中试剂1的各组分为缓冲液、ATP、辅酶A、4-氨基安替比林、离子激活剂、酰基辅酶A合成酶、稳定剂、防腐剂、表面活性剂、浓盐酸，试剂2的各组分为缓冲液、色原、复合巯基试剂、过氧化物酶、酰基辅酶A氧化酶、稳定剂、防腐剂、表面活性剂、浓盐酸。该试剂盒稳定性好、游离脂肪酸特异性好、线性范围广。本发明采用酶法进行检测血清或血浆游离脂肪酸，该方法精确度高、测量误差小。
文档编号C12Q1/28GK102634565SQ201110172340
公开日2012年8月15日 申请日期2011年6月21日 优先权日2011年6月21日
发明者贾江花, 邹炳德 申请人:宁波美康生物科技股份有限公司