专利名称：一种微生物发酵生产牡蛎水解液的方法
技术领域：
本发明涉及一种液体发酵牡蛎制备牡蛎水解液的方法，属于水产品加工和微生物生物技术领域。
背景技术：
牡蛎味道鲜美，营养丰富，素有“海中牛奶”之美誉，是我国首批列为药食同源的保健疗效品之一。牡蛎蛋白高达50%，8种必需氨基酸的含量较高，占氨基酸总量的40%，且婴幼儿所需的组氨酸和精氨酸含量较高，是一种优质蛋白质。更为重要的是牡蛎肉中含有到3%以上的牛磺酸。牛磺酸具有消炎解毒、保肝利胆、降血脂、促进幼儿大脑发育及安神补脑等作用。此外，牡蛎肉中还含有高达22.41%的具有重要生理活性糖原、二十二碳六烯酸G)HA)和二十碳五烯酸(EPA)等不饱和脂肪酸、维生素以及铁、锌、钙、锰、硒等矿物质和微量元素。牡蛎是我国四大养殖贝类之一，在沿海地区大量人工养殖，资源丰富。目前，牡蛎加工和综合利用还比较落后，多以鲜食和制成干肉制品为主，少量加工成蚝油或其它调味品。牡蛎深加工制备高附加值产品鲜有报道，因此国内牡蛎养殖行业出现“增产不增收”的现象。蛋白质水解后产生易于吸收、溶解性好、乳化性好，并具有多种生理活性的多肽，改善了蛋白质的功能特性，提高了蛋白质的营养及利用价值。太平洋牡蛎又称长牡蛎、日本真牡蛎，广温广盐性的内湾品种。目前，我国沿海各省份多养殖该品种。目前国内外已对包括太平洋牡蛎、近江牡蛎、大连湾牡蛎等多种牡蛎的酶解特性及工艺进行了研究。将牡蛎水解，可以产生具有包括抗疲劳、抗氧化等多种生理活性的活性多肽。目前报道的包括牡蛎水解都是直接添加成品蛋白酶水解。成品蛋白酶价格较昂贵，增加了生产成本。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的工艺更为合理、有效降低成本、可适用于工业大生产的微生物发酵生产牡蛎水解液的方法。本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种微生物发酵生产牡蛎水解液的方法，其特点是，它采用米曲霉Aspergillus oryzae液体发酵方法，其具体步骤如下(1)牡蛎的制备购买新鲜太平洋牡蛎，清洗干净，取出牡蛎肉，勻浆机勻浆；(2)制备发酵基质勻浆液用蒸馏水稀释到蛋白浓度的M/V为15%，用IM的NaOH 调节PH值至7. 0，60°C巴氏灭菌30min，得发酵基质；(3)微生物发酵将米曲霉Aspergillus oryzae菌种在PDA斜面培养基上活化， 从活化后的菌种保藏斜面上挑取孢子接种至PDA液体培养基，3(TC、120rpm培养至菌体浓度达到107CFU/ml，得发酵菌株种子液；按V/V 5%接种量将发酵菌株种子液接种于发酵基质，装液量V/V 20%，转速140rpm，30°C，发酵48h ；
(4)分离发酵结束后，用截留100KD的超滤膜超滤去除菌体、未水解蛋白和其它杂质，滤清液即为牡蛎水解物，或者将滤清液浓缩干燥制粉得粉状牡蛎水解物。马铃薯培养基(PDA)可以采用以下方法配置马铃薯200g (切片水煮30min，过滤取汁)、蔗糖20. 0g、蒸馏水lOOOmL，pH值自然。固体培养基另加m/V为2%的琼脂。本发明所述的可以选用购自中科院微生物所的米曲霉Aspergillus oryzae (菌株号 AS3. 951)。以下是发明人所做的关于本发明方法的技术方案或参数的优选试验及其结果。1、测定样品的制备分别在不同的发酵时间取样，煮沸IOmin灭酶。将发酵液过 0. 45 μ m微孔滤膜，滤液作为样品进行测定。2、接种量对总氮提取率和糖原提取率的影响按照本发明方法步骤(2)制备好发酵基质后，接种量分别为2.5^,5^,10%, 15%，装液量为 V/V 20%，转速 120rpm, 30°C发酵培养，分别在 0，12，24，36，48，60，72，84，
取样，测定接种量对总氮提取率和糖原提取率的影响。结果如图1，接种量变化影响总氮提取率和糖原提取率，接种量为2. 5%时，总氮提取率在发酵60h达到最大值，而接种量为5 %，10%，15 %时都在发酵4 达到较高提取水平；接种量为2. 5 %和5 %时，糖原提取率分别在发酵7 和48h达到较高提取水平，而接种量为10%和15%时，二者均约在发酵 3 达到较高提取水平。综合总氮提取率、糖原提取率和成本，接种量选择5%，此条件下发酵4 总氮提取率和糖原提取率都达到较高提取水平。3、起始pH对总氮提取率和糖原提取率的影响用蒸馏水将勻浆液稀释到蛋白浓度m/V 15%，用IM NaOH或IM盐酸调节pH值分别为 5. 0、6. 0、7. 0、8. 0、9. 0，60°C，30min 巴氏灭菌。接种量 V/V 5%，装液量 V/V 20%，转速120rpm, 30°C发酵培养，分别在0，12，24，36，48，60，72，84，96h取样，测定起始pH对总氮提取率和糖原提取率的影响。结果如图2，在pH8时总氮提取率最早达到最大值，而糖原提取率在pH6时提取率最高，并最早达到最大值，平衡考虑蛋白提取率和糖原提取率，选择发酵初始PH值为7.0。4、底物浓度对总氮提取率和糖原提取率的影响用蒸馏水将勻浆液稀释到蛋白浓度m/V 5%、10%、15%、20%，用IM NaOH调节pH 值至7.0，60°C，30min巴氏灭菌。接种量V/V5%，装液量V/V 20%，转速120rpm，30°C发酵培养，分别在0，12，24，36，48，60，72，84，取样，测定起始蛋白浓度对总氮提取率和糖原提取率的影响。结果如图3，蛋白浓度为5%、10%和15%时对总氮提取率和糖原提取率的影响不显著，但是蛋白浓度为20%时总氮提取率和糖原提取率都显著下降，因此选择蛋白浓度15%。5、发酵温度对总氮提取率和糖原提取率的影响用蒸馏水将勻浆液稀释到蛋白浓度m/V 15%，用IM NaOH调节pH值至7. 0，60°C， 30min巴氏灭菌。接种量V/V 5%，装液量V/V 20%，转速120rpm，分别于，28°C，30°C， 32°C发酵培养，分别在0，12，24, 36，48，60，72，84，96h取样，测定发酵温度对总氮提取率和糖原提取率的影响。结果如图4，温度在30°C时总氮提取率和糖原提取率最早达到最高值， 因此选择发酵温度为30°C。6、装液量对总氮提取率和糖原提取率的影响
用蒸馏水将勻浆液稀释到蛋白浓度m/V 15%，用IM NaOH调节pH值至7. 0，60°C， 30min巴氏灭菌。接种量V/V 5 %，装液量分别调整为V/V 10 %、20 %、30 %、40 %，转速 120rpm，30°C发酵培养，分别在0，12，24，36，48，60，72，84，取样，测定装液量对总氮提取率和糖原提取率的影响。结果如图5，装液量为20%时总氮提取率和糖原提取率最早达到最高值，因此选择装液量为20%。7、转速对总氮提取率和糖原提取率的影响用蒸馏水将勻浆液稀释到蛋白浓度m/V 15%，用IM NaOH调节pH值至7. 0，60°C， 30min巴氏灭菌。接种量V/V 5%，装液量V/V 20 %，转速分别设定为lOOrpm、120rpm、 140rpm、160rpm, 30°C发酵培养，分别在 0，12，24，36，48，60，72，84，96h 取样，测定转速对总氮提取率和糖原提取率的影响。结果如图6，转速为140rpm时总氮提取率和糖原提取率最早达到最高值，因此选择转速为140rpm。8、发酵时间对总氮提取率、糖原提取率、蛋白酶、淀粉酶活性的影响用蒸馏水将勻浆液稀释到蛋白浓度m/V 15%，用IM NaOH调节pH值至7. 0，60°C， 30min巴氏灭菌。接种量V/V 5%，装液量V/V 20%，转速140rpm，30°C发酵培养，分别在0， 12，24，36，48，60，72，84，％h取样，测定发酵时间对总氮提取率、糖原提取率、蛋白酶活性、 淀粉酶活性的影响。结果如图7，随着发酵时间的延长，总氮提取率、糖原提取率、蛋白酶活性、淀粉酶活性增加，发酵4 后总氮提取率、糖原提取率达到最大值，因此选择发酵时间为 48h。9、水解液分离及测定发酵结束后，可以用截留100KD的美国Millipore公司超滤膜超滤去除菌体和未水解蛋白和其它杂质。测定超滤液的游离氨基酸和牛磺酸发现超滤液游离氨基酸占总氨基酸的35. 91%，牛磺酸占总氨基酸的13. 05%。与现有技术相比，本发明方法采用液体发酵形式，其工艺参数设计合理，可操作性强，无需使用成品蛋白酶和淀粉酶，成本低，总氮提取率和糖原提取率高，能够充分利用牡蛎资源，具有较好的工业应用潜力。
图1为接种量对总氮提取率和糖原提取率的影响图；图中■，·，▲, ▼分别为接种量为2.5%，5%，10%，15%时总氮提取率；□，〇，Δ，▽分别为接种量为2. 5%，5%， 10%，15%时糖原提取率；图2为起始pH对总氮提取率和糖原提取率的影响图；图中_,·,▲, ▼， 分别为起始PH为5，6，7，8，9时总氮提取率；□，〇，Δ，▽， 分别为起始pH为5，6，7，8，9时糖原提取率；图3为底物浓度对总氮提取率和糖原提取率的影响图；图中_,·，▲, ▼分别为底物浓度为5^,10%，15%，20%时总氮提取率；□，〇，Δ，▽分别为底物浓度为5%， 10%,15%, 20%时糖原提取率；图4为发酵温度对总氮提取率和糖原提取率的影响图；图中■，眷，▲，▼分别为发酵温度为^°CJ8°C，30°C，32°C时总氮提取率；□，〇，Δ，▽分别为发酵温度为,28°C, 300C，320C时糖原提取率图5为装液量对总氮提取率和糖原提取率的影响图；图中■，·，▲，▼分别为装液量为10%，20%，30%，40%时总氮提取率；□，〇，Δ，▽分别为装液量为10%，20%，30%，40%时糖原提取率；图6为转速对总氮提取率和糖原提取率的影响图；图中■，·，▲, ▼分别为转速为100rpm，120rpm，140rpm，160rpm时总氮提取率；□，〇，Δ，▽分别为转速为lOOrpm， 120rpm, 140rpm, 160rpm 时糖原提取率；图7为发酵时间对蛋白回收率、糖原提取率及米曲霉产蛋白酶和淀粉酶的影响图；图中■蛋白回收率； 糖原提取率；▲蛋白酶活性；▼淀粉酶活性。
具体实施例方式以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。实施例1，一种微生物发酵制备牡蛎水解物的方法，它采用米曲霉Aspergillus oryzae液体发酵方法，其具体步骤如下(1)牡蛎的制备购买新鲜太平洋牡蛎，清洗干净，取出牡蛎肉，勻浆机勻浆；(2)制备发酵基质勻浆液用蒸馏水稀释到蛋白浓度的M/V为15%，用IM的NaOH 调节PH值至7.0，60°C巴氏灭菌30min，得发酵基质；(3)微生物发酵将米曲霉Aspergillus oryzae菌种在PDA斜面培养基上活化， 从活化后的菌种保藏斜面上挑取孢子接种至PDA液体培养基，3(TC、120rpm培养至菌体浓度达到107CFU/ml，得发酵菌株种子液；按V/V 5%接种量将发酵菌株种子液接种于发酵基质，装液量V/V 20%，转速140rpm，3(TC，发酵48h ；⑷分离发酵结束后，用截留100KD的超滤膜超滤去除菌体、未水解蛋白和其它杂质，滤清液即为牡蛎水解物，或者将滤清液浓缩干燥制粉得粉状牡蛎水解物。
权利要求
1. 一种微生物发酵制备牡蛎水解物的方法，其特征在于它采用米曲霉 oryzae液体发酵方法，其具体步骤如下(1)牡蛎的制备购买新鲜太平洋牡蛎，清洗干净，取出牡蛎肉，勻浆机勻浆；(2)制备发酵基质勻浆液用蒸馏水稀释到蛋白浓度的M/V为15%，用IM的NaOH调节 PH值至7.0，60°C巴氏灭菌30min，得发酵基质；(3)微生物发酵将米曲霉J1^ergiBMoryzae菌种在PDA斜面培养基上活化，从活化后的菌种保藏斜面上挑取孢子接种至PDA液体培养基，300C、120rpm培养至菌体浓度达到107CFU/ml，得发酵菌株种子液；按V/V 5%接种量将发酵菌株种子液接种于发酵基质，装液量 V/V 20%,转速 140rpm，30 °C，发酵 48h ；(4)分离发酵结束后，用截留100KD的超滤膜超滤去除菌体、未水解蛋白和其它杂质， 滤清液即为牡蛎水解物，或者将滤清液浓缩干燥制粉得粉状牡蛎水解物。
全文摘要
本发明公开了一种微生物发酵制备牡蛎水解物的方法，其特征在于，它利用米曲霉Aspergillusoryzae发酵太平洋牡蛎制备牡蛎水解物，制备时取新鲜牡蛎肉、洗净、匀浆后接种米曲霉发酵；发酵结束后，过滤除菌，滤液浓缩可得牡蛎水解物。本发明方法采用液体发酵形式，工艺参数设计合理，可操作性强，无需使用成品蛋白酶和淀粉酶，成本低，总氮提取率和糖原提取率高，能够充分利用牡蛎资源，具有较好的工业应用潜力。
文档编号A23L1/33GK102326796SQ20111017179
公开日2012年1月25日 申请日期2011年6月23日 优先权日2011年6月23日
发明者刘姝, 吕明生, 房耀维, 焦豫良, 王淑军 申请人:淮海工学院