专利名称：一种纯化病毒样颗粒蛋白的方法及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种采用低PH缓冲体系纯化病毒样颗粒蛋白的方法以及应用。
背景技术：
针对慢性疾病的治疗性疫苗是目前疫苗研究的热点之一，这些疾病包括慢性病毒感染、过敏性疾病、肿瘤、糖尿病、高血压和阿尔茨海默病等。与普通预防性疫苗不同的是治疗性疫苗针对的是自身抗原或外来免疫耐受抗原，因此，治疗性疫苗要发挥治疗作用必须首先打破免疫耐受，产生针对特定抗原的自身抗体或自身反应T细胞。由于治疗性疫苗所针对的靶抗原一般是短肽，抗原性较弱，必须与合适的载体结合后，在免疫佐剂的帮助下才能发挥作用，因此，选择合适的载体及佐剂往往是治疗性疫苗成功的关键。目前常用的载体如KLH、破伤风类毒素等，效力一般不强，必须使用佐剂，而常用的佐剂如弗氏佐剂虽然效能较强，但不能应用于人体，铝制佐剂虽然可应用于人体，但免疫效能很弱，而且也存在如脑动脉硬化、铝盐局部堆积等不良反应。因此，理想的治疗性疫苗载体，应该在与靶抗原结合后，在不应用免疫佐剂的情况下，就能有效打破机体的免疫耐受， 产生高滴度抗体，发挥治疗作用。病毒样颗粒就是这样一类理想的疫苗载体。病毒样颗粒(VLP)是由病毒衣壳蛋白装配成的不含病毒核酸的空壳结构，具有病毒的外形和免疫原性，可诱导机体产生以体液免疫为主的反应，从而产生针对与之结合的抗体，由于不具有病毒的核酸成分，因此避免了病毒复制增殖的风险。病毒样颗粒由大量重复结构的衣壳蛋白单体聚合而成，可以与特异性B细胞表面受体(BCR)广泛交联并激活B细胞，以T细胞非依赖性(Tl)和T细胞依赖性(TD)两种方式进行抗原提呈，且作为外源性T细胞表位能够使靶抗原高度有序且重复的展示在其表面，有利于突破自身免疫耐受，对机体免疫系统有着强大的刺激作用，所以病毒样颗粒的使用已经越来越广泛。目前国内外已制备出多种噬菌体病毒样颗粒，如Qi^噬菌体病毒样颗粒、人乳头瘤病毒样颗粒(HPV)、MS2病毒样颗粒等。瑞士 Cytos公司将Qi3 噬菌体病毒样颗粒为载体研制了一系列治疗性疫苗，包括阿尔茨海默病AD疫苗(CAD106)、 尼古丁疫苗(NIC002)、过敏性哮喘疫苗(CYT003-QbG10)等，其中其研制的针对血管紧张素 II的降压疫苗(CYTOOe-AngQb)，已完成IIa期临床实验，针对过敏性鼻结膜炎研制的疫苗 (CYT003-QbG10)已完成nb期临床实验。而比利时葛兰素史克公司(GSK)研制的已经上市的子宫颈癌疫苗Cervarix (TM)的主要疫苗成分就是HPV-16和HPV-18。这些病毒样颗粒显示了强大的免疫原性和人使用之后的安全性。近年来随着对蛋白质的研究和生产的需要，分离纯化作为基因工程的下游技术愈发显示其重要性。据统计，基因工程产品的分离纯化成本约占其全部成本的60-80%，是蛋白质制备过程中最为耗时、花费最大的一步。病毒样颗粒作为蛋白质的一种，同样面临这样的问题。目前的常用纯化方法基本都适用于病毒样颗粒的纯化，但是需要针对每一种病毒样颗粒的特征及制备成本问题来设计和探索。瑞士 Cytos公司针对Qi3病毒样颗粒，建立了其纯化的工艺，其主要纯化方法为切向流(TFF)离心、阴离子交换层析(AIX)、内毒素去除(HAPA)、疏水作用层析(HIC)及凝胶过滤层析(SEC)。虽然经过以上5步以后可以获得 99%以上纯度的病毒样颗粒，但是其成本花费巨大。迄今为止尚未见到有关一种高效、成本低的病毒样颗粒纯化方法的报道。
发明内容
本发明的目的旨在克服现有技术的缺陷，满足对病毒样颗粒的需要，提供了一种高效、成本低的纯化病毒样颗粒蛋白的方法。本发明通过以下技术方案实现这种高效的纯化病毒样颗粒蛋白的方法建立在一个低pH缓冲体系上。这种低pH 缓冲体系可以由柠檬酸-柠檬酸盐缓冲对、乙酸-乙酸盐缓冲对、甲酸-甲酸盐缓冲对、甲酸/乙酸/磷酸二氢盐-甲酸盐/乙酸盐/磷酸一氢盐缓冲对构成。将含有病毒样颗粒的样品直接置于低PH缓冲体系中或通过透析袋间接置于低pH缓冲体系中，缓冲体系的体积是样品体积的20-500倍。这个低pH缓冲体系的pH值在2. 4-4. 0之间，这种强酸性缓冲环境能够使绝大部分杂蛋白变性和碎片化，经一步酸化后，蛋白就可以达到80%左右的纯度。 通过简单离心(10，OOOg离心10分钟)和进一步的分离层析将变性蛋白和片段去除，获得纯化后的病毒样颗粒蛋白，通过SDS-PAGE鉴定其纯度。这种方法可以用来纯化Qi3噬菌体病毒样颗粒蛋白、Q β "2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白、HK-97噬菌体病毒样颗粒蛋白野生型的前体和成熟体、HK-97噬菌体病毒样颗粒蛋白嵌合体的前体和成熟体以及HK-97噬菌体病毒样颗粒蛋白突变体的前体和成熟体。与现有技术相比，本发明具有以下优点1、本发明与常规的离子交换、羟基磷灰石、密度梯度离心等分离方法相比，具有操作简单，成本低廉的特点。2、本发明能够对多种病毒样颗粒蛋白进行纯化，且有很高的纯化效率，为扩大生
产奠定了基础。
图1 :Qβ -2aa噬菌体病毒样颗粒经系列纯化后的SDS-PAGE电泳纯度对比。M为蛋白Marker，1泳道为诱导表达后细菌裂解上清，2泳道为硫酸铵沉淀后样品，3泳道为酸化后上清，4泳道为疏水层析后样品，5泳道为凝胶过滤后样品，6泳道为纯化浓缩后样品，目的蛋白大小约14KDa，最后的纯度约为95%。图2:不同pH值(ρΗ2·4，ρΗ3·8，ρΗ8·07)条件下，Q β _2aa病毒样颗粒圆二色谱结^ ο图3 用透射电镜观察经系列纯化(包括酸化)后的Q β -2aa噬菌体病毒样颗粒。 病毒样颗粒透射电镜图示，表明Qf3-2aa病毒样颗粒能够自行组装为球形颗粒，直径大约为 30nmo图4 :HK-97病毒样颗粒酸化后的样品(Omin)、中和后样品(5min, 10min,30min, 60min,2hrs)进行SDS-PAGE电泳，鉴定病毒样颗粒前体、中间体和成熟体及其纯度。图5 用透射电镜观察HK-97酸化成熟后的形态及大小。成熟体HK-97的形态类似球形，薄外壁，直径约66nm。
具体实施例方式以下结合说明书附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明。实施案例1 Q β -2aa噬菌体病毒样颗粒的酸化Q β -2aa噬菌体病毒样颗粒的酸化分离步骤如下1)配制pH3. 6的40mM的柠檬酸-柠檬酸盐酸化缓冲液，其配方为=C6H8O7 · H2O 8. 42g(lL)、C6H5Na3O7 · 2H20 11. 75g(lL)，室温下前者与后者以2 1体积准确混合；2)将硫酸铵初步纯化后溶解的沉淀装入透析袋(14，000的分子截留大小)内，放入步骤1)中的柠檬酸-柠檬酸盐酸化缓冲液中，4°C透析，隔6小时换液一次，共2次；3) 12，OOOrpm离心10分钟，弃去沉淀，重复离心一次，上清以pH7. 4的PBS稀释，获得酸化后的样品。分别取细菌裂解后上清、硫酸铵粗提样品、酸化后样品、疏水作用层析后样品和凝胶过滤后样品，进行SDS-PAGE电泳，SDS-PAGE电泳比较各自样品的纯度(图1)。实施案例2 Q β -2aa病毒样颗粒酸化后的二级结构Q β -2aa噬菌体病毒样颗粒在三种不同pH值(pH2. 4，pH3. 8，pH8. 07)下纯化获得，经后续纯化后，对其二级结构进行圆二色谱法分析，发现Q β "2aa病毒样颗粒都显示了高度一致的二级结构类似性(图2)。实施案例3 Q β -2aa-VLP酸化后的形态制作经过pH3. 8和pH8. 07条件下纯化好的Q β -2aa噬菌体病毒样颗粒的电镜滴片(铜网，醋酸双氧铀负染)，在透射电镜下进行形态和大体结构观测，发现两者电镜下结构一致，直径均约30nm(图3)。实施案例4 HK-97VLP的酸化成熟HK97噬菌体病毒样颗粒的前体PII-HK97在体外需要经过酸性诱导才能成熟，那么酸化作为其本身成熟的一步，亦可作为其良好的纯化手段。PII-HK97病毒样颗粒前体的酸化诱导步骤为将30mg/ml PII-HK97病毒样颗粒前体1. 5ml稀释于150ml酸化缓冲液 (pH3. 8,250mMKCl,50mM Citrate)中1小时，随后加入1/6体积的中和缓冲液(pH8. 3，IM Tris-HCl)至总体系的pH在7. 0以上，室温放置2小时，之后可置于4°C 24小时。取酸化后的样品(Omin)，中和后样品(5min，IOmin, 30min, 60min, 2hrs)进行SDS-PAGE电泳鉴定病毒样颗粒前体、中间体和成熟体及其纯度(图4)，透射电镜观察成熟体HK-97形态及大小 (图 5)。
权利要求
1.一种纯化病毒样颗粒蛋白的方法，其特征在于它包括以下步骤1)配制PH值在2.4-4. 0的低PH缓冲体系；2)将含有病毒样颗粒的样品直接置于步骤1)中的低PH缓冲体系中或通过透析袋间接置于低PH缓冲体系中，4°C透析，隔6小时换液一次，共2次；3)10，OOOrpm离心10分钟，弃去沉淀，重复离心一次，上清以pH7. 4的PBS稀释，获得酸化后的样品。
2.根据权利要求1所述的一种纯化病毒样颗粒蛋白的方法，其特征在于所述的低PH缓冲体系，可以由以下缓冲对构成(a)柠檬酸-柠檬酸盐缓冲对；(b)乙酸-乙酸盐缓冲对；(c)甲酸-甲酸盐缓冲对；(d)甲酸/乙酸/磷酸二氢盐-甲酸盐/乙酸盐/磷酸一氢盐缓冲对。
3.根据权利要求1所述的一种纯化病毒样颗粒蛋白的方法，其特征在于其在纯化Q3 噬菌体病毒样颗粒蛋白、Qi3 _2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白和HK-97噬菌体病毒样颗粒蛋白的应用。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种纯化病毒样颗粒蛋白的方法及其应用。这种高效的纯化病毒样颗粒蛋白的方法建立在一个低pH缓冲体系上，将含有病毒样颗粒的样品置于低pH缓冲体系中，这种强酸性缓冲环境能够使绝大部分杂蛋白变性和碎片化，经一步酸化后，蛋白就可以达到80％左右的纯度。通过简单离心和进一步的分离层析将变性蛋白和片段去除，获得纯化后的病毒样颗粒蛋白。公开了这种方法在纯化Qβ噬菌体病毒样颗粒蛋白、Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白和HK-97噬菌体病毒样颗粒蛋白的应用。这种纯化方法简单、成本低廉且有很高的纯化效率，有很大的应用前景。
文档编号C12R1/92GK102260651SQ201110171728
公开日2011年11月30日 申请日期2011年6月24日 优先权日2011年6月24日
发明者周子华, 廖玉华, 杨仕俊, 王敏, 邱志华, 陈芬, 陈霄 申请人:华中科技大学同济医学院附属协和医院