专利名称：一种提高胶红酵母对水果采后病害生物防治效力的方法
技术领域：
本发明涉及利用植酸(phytic acid)增强胶红酵母菌种(Mhocbtorula ^/ci^^i/^m)对水果采后病害防治效力的方法，属于水果采后生物防治领域。
背景技术：
水果在采摘、运销、储藏过程中因腐烂造成的损失是巨大的，已成为全球关注的问题。据报道，发达国家由此造成的损失为10%-2596，而在缺乏冷藏设施的发展中国家则高达40%-50%，我国水果采后损失为20% -25%左右。2007年3月国家统计局发布的《中华人民共和国2006年国民经济和社会发展统计公报》显示，2006年我国水果总产量达17050万吨。据此估算，我国水果采后的损失每年将达到数百亿元人民币的水平。病原微生物侵染造成的腐烂是水果采后损失的主要原因，这些病原微生物主要有灰葡萄抱(Bo trytis cinerea )、葡枝根霉{Rhizopus s toloniger )、青霉{Penicillium spp.)、毛毒(ifocor spp. ) λ IjI ^ (^7 tern aria spp.)禾口曲毒 046/7^/^/77^/61 spp.)等。 病原微生物对采后水果的危害不仅在于其导致水果在数量上造成的严重损失，而且由于许多病原真菌能分泌产生许多次生代谢产物从而引起严重的食品安全问题，如扩展青霉 iP.权/？浙仰产生的棒曲霉素(patulin)、灰葡萄孢U彻)产生的葡双醛霉素 (botrydial)等。目前最常用的控制水果采后腐烂的方法是低温贮藏和化学杀菌剂处理。近年来低温贮藏技术在我国得到了广泛的发展和应用，但已有的冷藏设备往往不能满足大多数水果的需要。同时，在低温条件下仍有相当数量的致病菌能够在水果上生长，并造成水果腐烂。 而那些对低温敏感的水果只能在不低于使产品受冷害的温度下贮藏。长期以来，控制水果采后病害的主要措施是使用杀菌剂。化学杀菌剂对防治病害可以起到立竿见影的效果，但是，长期和大量的使用，不仅导致病原微生物产生抗药性，同时严重污染环境，有损于人类健康。美国国家科学院(National Academy of kinces)的一份报告显示，在用于处理食品的全部农药中，杀菌剂构成60%的致瘤危险。随着国家经济发展和消费水平的提高，人们对食品安全和环境保护意识的日益增强，目前多种化学杀菌剂^WCaptaruBenomyl等)已被明令禁止使用或者在部分水果产品上限制使用，其直接的后果是目前许多水果采后病害已经没有杀菌剂能予以控制。因此，各国科学家都在积极地探索能代替化学杀菌剂的安全、高效的新型水果采后病害防治方法。当前国际上对用拮抗微生物进行水果采后病害的生物防治的研究已经取得了阶段性的成果， 并认为这是最有希望取代化学杀菌剂的方法之一。随着酵母分类、生态、生理、生物化学和分子生物学的研究取得进展，人们对果蔬贮藏中利用酵母的兴趣日益提高。国内外的研究表明，许多酵母菌应用于水果表面，可以防治水果由致病霉菌引起的病害，这些酵母被称为拮抗酵母。酵母菌遗传稳定，抑菌谱广、效价高，一般不产生对人和寄主植物有害的代谢产物，安全性高，且对营养要求低，生长快，并对多种胁迫、逆境具有较强的耐受力，对大多数杀菌剂不敏感，对其它化学和物理处理能够相容。因此近年来拮抗酵母作为水果采后病害生防菌，受到国际上的广泛关注。我国水果采后病害生物防治研究起步较晚。范青等Q001)对果实病害生物防治拮抗菌进行了筛选和分离，结果表明季也蒙假丝酵母(Pandida guiliennondii)、f} 檬形克勒克酵母iKloGckerei、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)对甜樱桃褐腐病都表现出显著的抑制效果，季也蒙假丝酵母和柠檬形克勒克酵母能有效地防治核果类果实软腐病；田世平等O004)研究，在甜樱桃采前喷洒1 X IO8个/mL的丝孢酵母 ijrichosporon /w/WWaas)，罗伦隐球酵母 ifryptococcus IaurentiΓ)和粘红酵母 (Mhodotorula glutinis)，分别在25°C ,0°C以及气调贮藏下，丝孢酵母在果实上繁殖数量最高，抑菌效果最好；张红印等000 研究了不同温度下，罗伦隐球酵母对灰霉病的防治效果，结果表明，25°C下，梨灰霉病的发病率为16. 7%，结合CaCl2使用效果更显著。从国内外文献中可知当前以有效微生物取代化学杀菌剂用于水果采后病害的防治已显示出巨大的应用前景，水果采后病害的生物防治成为一个新的研究热点。但到目前为止，已实际应用于生产的拮抗菌种类不多，只有Biosave和Aspire等少数几种产品上市，而我国目前尚没有拮抗菌应用于实际生产。主要原因在于商业生产条件下，目前已报道的拮抗微生物的防治效果往往不如化学杀菌剂的效果，从而达不到保鲜要求。这些因素影响了拮抗菌作为果蔬保鲜剂在生产中的使用。胶红酵母是我们课题组从镇江江心洲无公害果园的土壤中筛选分离到的一株拮抗酵母。我们的大量研究表明胶红酵母对草莓、桃等水果的采后病害具有显著的抑制作用。然而，我们的试验结果也表明胶红酵母对果实病害的防治效力与化学杀菌剂相比仍有较大的差距。因此进一步提高胶红酵母的拮抗效力，是提高其对水果采后病害控制水平，并将其应用于水果贮藏保鲜的重要策略之一。植酸是以玉米、米糠或小麦为原料制备的。作为一种可生物降解的天然物质，植酸不仅资源丰富，而且价格低廉、无毒安全。因其具有众多独特的生物学特性，在食品和水果采后保鲜等领域都有着广泛的研究和应用。在水果采后保鲜领域，植酸被作为理想的水果涂层，用来延缓果实中维生素C的降解，保持果实中的可溶性固形物和含酸量。研究表明植酸对多种病原菌引起的腐烂的抑制效果较弱，因此植酸作为保鲜剂应用时，必须与其它防腐剂配合使用。近年来，如何将植酸与其它安全的非杀菌剂方法有效整合，以获得对水果采后真菌病害更高水平的控制，已成为国际上非常受关注的一个研究热点。但国内外对植酸培养能否影响采后拮抗酵母生物防治效力尚无相关报道。
发明内容
本发明为了克服上述现有技术中的不足，提供了一种增强胶红酵母生物防治效力的方法。胶红酵母经植酸溶液稀释，制备成菌悬液。将菌悬液应用到水果上，可以显著地抑制水果病原菌，防止水果采后腐烂。本发明具有安全、高效、成本低等优点，可以广泛地用于水果采后病害的生物防治过程中，减少水果采后病害造成的损失。本发明同时提供了一种利用植酸增强胶红酵母对水果采后病害防治效力，从而将其应用于水果贮藏保鲜的方法。按照下述步骤进行将胶红酵母(Μ— mucilaginosa)活化，接种到NYDB培养基中进行培养，离心得到菌体；将菌体用无菌水及植酸溶液稀释制备成IX IO8个/mL的菌悬液；将水果放入菌悬液中，浸泡30秒后马上取出，自然风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温或冷藏条件下存放。
其中所述的NYDB培养基中酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，纯化水1000ml，自然pH。其中所述的菌悬液中植酸的质量浓度为0. 05—0. 5%。其中所述的胶红酵母、Rhodo torula mucilaginosa)，保藏菌株编号为CGMCC No.3617。其中所述的水果优选苹果、桃或草莓。本发明的优点本发明使用植酸增强胶红酵母防治水果采后病害的效力，使用简单，操作方便，效果好，成本低。增强后的胶红酵母可以代替化学杀菌剂防治水果采后病害， 避免使用化学杀菌剂对人体的危害，具有显著的经济效益和社会效益。
其中图1为不同浓度植酸与胶红酵母结合对草莓灰霉病的抑制效果；注CK:对照； 0: NYDB； 0. 1%-0. 5%为经0. 1%-0. 5%植酸溶液稀释后的菌悬液。发病率是20°C放置3天后测定的结果。不同字母代表差异显著性(P=O. 05)。图2为不同浓度植酸与胶红酵母结合对草莓根霉病的抑制效果；注:CK对照； 0: NYDB； 0. 1%-0. 5%:经0. 1%-0. 5%植酸溶液稀释后的菌悬液。发病率是20°C放置3天后测定的结果。不同字母代表差异显著性(P=O. 05)。图3为不同浓度植酸与胶红酵母结合对桃青霉病的抑制效果；注CK:对照；0: NYDB； 0.0. 5%-0. 25%:经0.05%-0. 25%植酸溶液稀释后的菌悬液。发病率是20°C放置6 天后测定的结果。不同字母代表差异显著性(P=O. 05)。图4为不同浓度植酸与胶红酵母结合对桃灰霉病的抑制效果；注CK:对照；0: NYDB； 0.0. 5%-0. 25%:经0.05%-0. 25%植酸溶液稀释后的菌悬液。发病率是20°C放置6 天后测定的结果。不同字母代表差异显著性(P=O. 05)。图5为不同浓度植酸与胶红酵母结合对桃根霉病的抑制效果；注CK:对照；0: NYDB； 0.0. 5%-0. 25%:经0.05%-0. 25%植酸溶液稀释后的菌悬液。发病率是20°C放置4 天后测定的结果。不同字母代表差异显著性(P=O. 05)。图6为不同浓度植酸与胶红酵母结合对苹果青霉病的抑制效果；注CK:对照； 0: NYDB； 0. 1%-0. 5%:经0. 1%-0. 5%植酸溶液稀释后的菌悬液。发病率是20°C放置8天后测定的结果。不同字母代表差异显著性(P=O. 05)。图7为不同浓度植酸与胶红酵母结合对苹果灰霉病的抑制效果注CK:对照；0: NYDB ； 0. 1%-0. 5%:经0. 1%-0. 5%植酸溶液稀释后的菌悬液。发病率是20°C放置10天后测定的结果。不同字母代表差异显著性(P=O. 05)。
具体实施例方式通过借助以下实施实例将更加详细的说明本发明。以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施实例的限制。胶红酵母系本实验室筛选分离得到，现保存于位于中国北京的北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心中心(CGMCC)，保藏菌株编号为CGMCC No. 3617，于NYDA (NYDB培养基的基础上添加洲的琼脂)培养基4°C低温保存。培养程序为(1)固体活化将胶红酵母接种于NYDA培养基中，在培养48h; (2)液体培养在250ml的三角瓶中装入50 ml的NYDB种子培养基，用接种环接入两环活化好的胶红酵母，在200 rpm (转/分钟)，条件下培养20h ； (3)增强将上述培养混合物7000Xg条件下离心lOmin，无菌生理盐水洗涤两次，以去除培养介质，并用无菌生理盐水重新悬浮酵母细胞，血球记数板调节细胞浓度为5 X IO8个/mL。 在250ml的三角瓶中分别装入50ml NYDB培养基，并加入上述浓度的酵母酵母培养液1ml， 然后在200 rpm 条件下培养Mh ； (4)离心分离再悬浮上述不同处理酵母培养混合物在7000 Xg条件下，离心lOmin，并用无菌生理盐水洗涤2次，以去除培养介质，再用无菌生理盐水及植酸溶液稀释到所需浓度。其中使用的植酸购自上海生工生物工程技术服务有限公司。实施例1 植酸增强胶红酵母对水果病害的抑制效果
一、试验方案
水果处理后，用消过毒的打孔器在每个果实表面赤道部位形成统一大小和深度的伤口。其中草莓的表面伤口为3mm (直径)X 3mm (深)，桃果的表面伤口为5mm (直径)X 3mm (深)，苹果的表面伤口为5mm(直径)X3mm(深)。每个伤口处等量加入30 μ 1 (1)1 X IO8个/ ml经无菌生理盐水稀释的酵母悬浮液；(2)1 X IO8个/ml经植酸稀释的酵母悬浮液(含植酸质量浓度为0. 1%_0.5%);(3)无菌水(作为对照)。池后，在每个伤口处分别加入等量30 μ 1 的病原菌孢子悬浮液。其中草莓分别加入IX IO5个/ml的灰葡萄孢(彻iiriis cinerea) 孢子悬浮液和IX IO4个/ml的葡枝根霉OWi^wAs StoAwi沢r)孢子悬浮液；桃果分别加入1 X IO5个/ml的灰葡萄孢(Motrytis cinerea)孢子悬浮液、1 X IO4个/ml的葡枝根霉 (.Rhizopus SioAwi沢r)孢子悬浮液和 5 X IO4 个/ml 的扩展青霉(/^fliciBiws expansum) 孢子悬浮液；苹果分别加入1 X IO5个/ml的灰葡萄孢(彻iiriis孢子悬浮液和
5X IO4个/ml的扩展青霉权/？浙仰 )孢子悬浮液。自然晾干后，将果实放入塑料筐并用保鲜膜密封，恒温培养箱中培养(水分活度95%)，草莓置于20°C，桃果及苹果置于 25 0C ο每处理重复3次，每个重复18个果实。整个试验重复2次。经过若干天的培养， 计算发病率，以此评价胶红酵母菌种(/SoWorWa mucilaginosa)的抑菌效果。发病率的计算公式如下
发病率(%)=发病的果实数/接种病原菌的果实总数X100%
二、试验结果
按照上述步骤试验，后统计水果的腐烂率结果如下 1.1对草莓灰霉病及根霉病的抑制效果
从图1可以看出，经胶红酵母处理后，草莓灰霉病的发病率都显著地低于对照草莓的发病率。胶红酵母与0. 1%、0. 2%及0. 3%浓度的植酸结合使用，其对灰葡萄孢在草莓伤口处的侵染抑制作用显著增强。尤其当植酸浓度为0.洲时，酵母菌悬液处理草莓后其灰霉病的发病率仅为对照的28. 3%，为酵母菌单独使用(未与植酸结合)处理后草莓发病率的51. 5%。 从图2可以看出胶红酵母对葡枝根霉在草莓伤口处的侵染抑制作用试验也出现了类似的结果。1. 2对桃果青霉病、灰霉病及根霉病的抑制效果
如图3所示，胶红酵母与0. 15%植酸结合使用，其对桃果伤口青霉病侵染的抑制效力显著增强。主要表现在整个试验阶段，经胶红酵母与0. 15%植酸结合处理的桃果，其青霉病发生率显著低于对照及经胶红酵母单独处理的桃果。在对桃果伤口灰霉病及根霉病的抑制作用上也出现了类似的结果(如图4和图5所示)。对苹果青霉病及灰霉病的抑制效果
如图6和图7所示，试验结果表明浓度为0. 2%的植酸能显著提高胶红酵母对苹果青霉病、灰霉病的控制效力，仅为对照的41%，35%。以上结果表明，植酸能够增强胶红酵母对灰葡萄孢(彻iiriis ci/^rea)、葡枝根霉(Mhizopus stoloniger)、賓毒iPenicillium spp.)引起的灰霉病、青霉病和根霉病的防治效果。实施例2 植酸增强胶红酵母对水果自然腐烂及贮藏品质的影响
一、试验方案
试验水果采摘后直接用以下处理浸泡果实30s (1) NYDB培养基培养的胶红酵母悬浮液；(2)植酸溶液稀释的酵母悬浮液；(3)无菌水(作为对照)。然后将果实放在塑料筐内， 风干后用保鲜膜密封。草莓贮藏于4°C冰柜，20天后转入20°C恒温箱贮藏，5天后观察果实腐烂情况，计算腐烂率；桃果贮藏于4°C冰柜，30天后转入25°C培养箱贮藏，7天后观察果实腐烂情况，计算腐烂率，并进行贮藏品质分析；苹果贮藏于4°C冰柜，30天后转入25V 培养箱贮藏，10天后观察果实腐烂情况，计算腐烂率，并进行贮藏品质分析。每处理重复3 次，每次重复10个果实，整个试验重复2次。贮藏品质分析方法如下
(1)硬度采用TA-XT2i质构分析仪测试，探头直径为5mm，探头测试前、测试中、测试后的运行速度分别为4.0 mm S^1U-O mm 0 mm s—1，草莓测试深度为6 mm，桃果及苹果测试深度为10 mm，探头插入水果时所受的最大阻力(单位为牛顿)就被定义为水果的硬度。 每个水果绕赤道处每120°测定3次。(2)总可溶性固形物采用WYT (0-80%)手持糖量计进行测定，测定结果表示为 g/100g 样品。(3)维生素C含量的测定紫外快速测定法。从6个水果上取20 g果肉样品加20 ml 1%盐酸勻浆，100 ml容量瓶定容至刻度。10000X g，4°C条件下离心10 mim，上清用于测定。取0. 2 ml提取液，放入盛有0. 4 ml 10% HCl的10 ml刻度试管中，用蒸馏水稀释至刻度后摇勻。以蒸馏水为空白，在M3 nm处测定吸光度。另吸取0.2 ml提取液，分别加入 4 ml蒸馏水和0. 6 ml ImolΓ1 NaOH溶液至10 ml至刻度试管，摇勻，静置15min后。加入 0.6 ml 10%HC1，混勻，加蒸馏水定容至刻度。以蒸馏水为空白，在M3 nm处测定吸光度。由待测液及碱处理待测液的A243值之差，查标准曲线，计算样品中维生素C的含量。每处理3 次重复。(4)褐变度6个水果称取20g果肉组织，加入40 ml蒸馏水勻浆，10000Xg，4°C条件下离心10 mim，取上清10 ml加入95%乙醇15ml 10000 X g，4°C条件下离心10 mim，取上清液于420 nm测定吸光度值，以此表示褐变程度。每处理3次重复。二、试验结果
按照上述步骤试验，统计草莓、桃果及苹果的自然腐烂率及贮藏品质的影响。结果如下表1植酸与胶红酵母结合对草莓自然腐烂率及储藏品质的影响
权利要求
1.一种提高胶红酵母对水果采后病害生物防治效力的方法，其特征在于按照下述步骤进行将胶红酵母(Miodotorula mucilaginosa)活化，接种到NYDB培养基中进行培养，离心得到菌体；将菌体用植酸溶液稀释制备成1 X IO8个/mL的菌悬液；将水果放入菌悬液中， 浸泡30秒后马上取出，自然风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温或冷藏条件下存放。
2.根据权利要求1所述的一种提高胶红酵母对水果采后病害生物防治效力的方法，其特征在于其中所述的NYDB培养基中酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，水1000ml，自然 pH。
3.根据权利要求1所述的一种提高胶红酵母对水果采后病害生物防治效力的方法，其特征在于其中所述的菌悬液中植酸的质量浓度为0. 05—0. 5%。
4.根据权利要求1所述的一种提高胶红酵母对水果采后病害生物防治效力的方法， 其特征在于其中所述的胶红酵母(Miodotorula，保藏菌株编号为CGMCC No.3617。
5.根据权利要求1所述的一种提高胶红酵母对水果采后病害生物防治效力的方法，其特征在于其中所述的水果为苹果、桃或草莓。
全文摘要
本发明公开了一种提高胶红酵母对水果采后病害生物防治效力的方法，按照下述步骤进行将胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)活化，接种到NYDB培养基中进行培养，离心得到菌体；将菌体用植酸溶液稀释制备成1×108个/ml的菌悬液；将水果放入菌悬液中，浸泡30秒后马上取出，自然风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温或冷藏条件下存放。本发明使用植酸增强胶红酵母防治水果采后病害的效力，使用简单，操作方便，效果好，成本低。防治效力增强后的胶红酵母可以代替化学杀菌剂防治水果采后病害，避免使用化学杀菌剂对人体的危害，具有显著的经济效益和社会效益。
文档编号C12R1/645GK102283280SQ20111016669
公开日2011年12月21日 申请日期2011年6月21日 优先权日2011年6月21日
发明者代春华, 任晓锋, 张晓云, 张红印, 赵利娜 申请人:江苏大学