专利名称：飞秒激光诱变吸水链霉菌子囊亚种选育子囊霉素高产菌株方法及培养基制备的利记博彩app
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，特别涉及飞秒激光诱变吸水链霉菌子囊亚种选育子囊霉素高产菌株方法及培养基制备。
背景技术：
大环内酯类免疫抑制剂是一组新的具有大环内酯结构的免疫抑制剂，经体内外研究证明具有明显的免疫抑制作用，其中包括子囊霉素(ascomycin，FK-520)及其衍生物。子囊霉素是由日本藤泽制药公司从含有吸水链霉菌(Sti^ptomyces hygroscopicus NO.KK317)的土壤中分离得到。它是免疫抑制剂他克莫司(tacrolimus，Π(-506)的乙基类似物，可用于治疗自身免疫性疾病、皮肤疾病及预防器官移植排斥。此外，一系列研究表明子囊霉素还具有抗疟疾、神经保护与再生、抗痉挛等活性。子囊霉素发现之初主要是用于抗菌目的，自从发现它的结构类似物他克莫司具有免疫抑制活性后，迅速推动了子囊霉素及其衍生物的免疫抑制活性的研究。吡美莫司 (pimecrolimus, SDZ-ASM981)系子囊霉素的氯衍生物，商品名Elidel，由瑞士诺华公司开发，2001年被美国食品和药物管理局(FDA)批准吡美莫司乳膏用于2岁以上儿童或成人轻中度特应性皮炎，于2002年在英国首先上市。是治疗特异性皮炎早起缓解和长期控制的非留体类药物，近年来发现能够用来治疗白癜风，其作为治疗胃肠道炎症药物即将进入临床试验。因为有很多的临床优点，子囊霉素及吡美莫司上市以来，市场份额迅速上升。据报道，2006年子囊霉素美国的市场售价为150000美元/Kg，其衍生物“卩比美莫司”的市场售价为500000美元/Kg，吡美莫司在美国的销售额达到159M8000美元，其应用价值和市场价值备受关注。2007年，印度学者Parveen等申请专利W02007/(^9082报道了子囊霉素的单位达到350-400mg/L，但国内对子囊霉素的研究还处于起步阶段，发酵单位一般在150_200mg/ L，与国外发酵效价相比，有较大的差距。如此差距归根结底是国内的菌株制备子囊霉素的能力弱，效能低。目前我国还未有子囊霉素工业化生产的报道，其市场基本被日本、瑞士和美国等国外公司占领。开发具有自主知识产权的子囊霉素高产菌，打破发达国家在这一领域的垄断地位，具有迫切的现实意义和应用价值。激光诱变技术在微生物诱变育种中的应用较为广泛，目前大多数研究者均采用低功率可见激光进行生物诱变育种的研究。但是传统的低功率的可见激光诱变手段继续提高突变菌种的生产能力效果不理想，并存在易损伤细胞活性、突变效率低等缺陷，必须采用新型的飞秒激光诱变育种技术进行菌种改造技术研究。飞秒激光由于脉冲持续时间短、瞬时功率大、聚焦尺寸小的特点，使得其在生物学领域有着广阔的应用前景。其中最重要的一个方向是飞秒激光诱变技术在生物细胞方面的应用，细胞是所有生物体的基本单位，所以应用飞秒激光诱变技术在吸水链霉菌子囊亚种，可以达到一系列关键酶活性增强的目的，提高吸水链霉菌子囊亚种的生产能力。目前虽然有部分学者应用红外飞秒激光进行了光与生物体作用的研究，但大都从事医学成象和生物活体检测、外科医疗等医学方面的应用研究。 天津大学闻建平课题组利用飞秒激光诱变米根霉(闻建平，于守智.飞秒激光诱变米根霉选育富马酸高产菌株的方法，CN10206U94A)，取得了很好的效果，然而把飞秒激光应用在产子囊霉素菌种的选育方面，则未见相关专利和文献报道。
发明内容
本发明的目的是提出一种飞秒激光诱变吸水链霉菌及选育子囊霉素高产菌株的方法，依此方法诱变的菌种可以有效地提高子囊霉素的产量。本发明是通过如下技术方案实现的本发明对制备子囊霉素的原始菌进行诱变， 该原始菌为吸水链霉菌子囊亚禾中(Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus)。 该菌种诱变方法的特征包括以下过程在室温下，取成熟孢子斜面加入适量无菌水，轻轻将琼脂表明的孢子刮下，将该孢子悬浮液置于已灭菌50ml三角瓶内，瓶中预先放置数粒无菌玻璃球，充分振摇后用灭菌的脱脂棉进行过滤，并用无菌水冲洗滤渣2-3次，制成IO6-IO7 个/ml的单孢子悬浮液，将0. 2ml的悬浮液分装于无菌的1.5ml的离心管内，采用中心波长800nm、脉宽150fs、频率76MHz的钛宝石飞秒激光在照射功率10_30mW下，对该孢子辐照Ι-lOmin，然后把经辐照处理的孢子悬液经无菌水10倍梯度稀释IO3-IO4倍，取稀释后的孢子液0. Iml涂布于固体平板培养基中培养10天，选取生长良好的单菌株接种于斜面培养基培养10天，挖取新鲜孢子斜面于装有40ml种子培养基的250ml摇瓶中， ^°C、200rpm摇床中培养48h，后10% (ν/ν)接种于装有40ml发酵培养基的250ml摇瓶中， ^°C-30°C、180-220rpm摇床中培养144-192h，HPLC检测子囊霉素含量，从中获得诱变的遗传稳定、发酵单位提高的纯菌吸水链霉菌子囊亚种。所述的固体和斜面培养基组成及含量为大豆粉15_25g/L、甘露醇15_25g/L、琼脂18-22g/L，初始pH7. 0 ；种子液培养基组成及含量为淀粉8_12g/L、葡萄糖25_35g/L、蛋白胨5-7g/L、酵母粉5-7g/L、碳酸钙l-3g/L，初始pH7. 0 ；淀粉15_25g/L、糊精35_45g/L、麸质粉2-3g/L、蛋白胨4-6g/L、酵母粉8-12g/L、玉米浆4-6g/L、冷榨豆饼粉4-6g/L、磷酸氢二钾 0. 5-1. 5g/L、硫酸铵 0. 5-1. 5g/L、硫酸镁 0. 5-1. 5g/L、碳酸钙 0. 5-1. 5g/L，初始 pH7. 0。本发明的优点表现为采用钛宝石飞秒激光照射的方式进行对产子囊霉素的菌种进行飞秒激光诱变，飞秒激光诱变具有脉冲时间短、瞬时功率大、聚焦尺寸小、诱变效率高、 不宜损伤细胞活性的特点，其诱变效果远较传统的He-Ne等激光诱变方法好，在微生物制药菌种选育中有较大的推广价值。本发明通过利用飞秒激光照射进行诱变，可选育出高产子囊霉素的吸水链霉菌子囊亚种突变株。突变株正突变率5-30%。发酵单位同原始菌株相比，提高了 10-60% ο
具体实施例方式实施例1在室温下，取子囊霉素(ascomycin，FK-520)成熟孢子斜面加入适量无菌水，制成 IO6-IO7个/ml的单孢子悬浮液，将0. 2ml的悬浮液分装于无菌的1. 5ml的离心管内，进行飞秒激光(中心波长800nm、脉宽150fs、频率76MHz)辐照lOmin，辐照功率10mW。辐照处理后的孢子悬液经无菌水10倍梯度稀释IO3-IO4倍后吸取0. Iml涂布于固体平板培养基(大豆粉15g/L、甘露醇15g/L、琼脂20g/L、pH7. 0)中观避光培养10天，选取生长良好的单菌株接种于斜面培养基(大豆粉20g/L、甘露醇15g/L、琼脂20g/L、pH7.培养10天，挖取
新鲜孢子斜面于装有40ml种子培养基(淀粉8g/L、葡萄糖35g/L、蛋白胨6g/L、酵母粉7g/ L、碳酸钙1.5g/L，初始pH7.0)的250ml摇瓶中，28°C、200rpm摇床中培养48h，后10% (ν/ ν)接种于装有40ml发酵培养基(淀粉22g/L、糊精45g/L、麸质粉2g/L、蛋白胨4g/L、酵母粉llg/L、玉米浆4g/L、冷榨豆饼粉4g/L、磷酸氢二钾lg/L、硫酸铵lg/L、硫酸镁0. 5g/L、碳酸钙1. 5g/L，初始pH7. 0)的250ml摇瓶中，30°C、220rpm摇床中培养180h, HPLC检测子囊霉素含量，挑选高产子囊霉素的遗传稳定突变株。突变株正突变率10-13%。发酵单位比原始菌株提高10-15%。采用钛宝石飞秒激光照射的方式进行对产子囊霉素的菌种进行飞秒激光诱变，飞秒激光诱变具有脉冲时间短、瞬时功率大、聚焦尺寸小、诱变效率高、不宜损伤细胞活性。实施例2在室温下，取成熟孢子斜面加入适量无菌水，制成IO6-IO7个/ml的单孢子悬浮液， 将0. 2ml的悬浮液分装于无菌的1. 5ml的离心管内，进行飞秒激光(中心波长800nm、脉宽 150fs、频率76MHz)辐照8min，辐照功率15mW。辐照处理后的孢子悬液经无菌水10倍梯度稀释IO3-IO4倍后吸取0. Iml涂布于固体平板培养基中(大豆粉25g/L、甘露醇15g/L、琼脂20g/L、pH7. 避光培养10天，选取生长良好的单菌株接种于斜面培养基(大豆粉 15g/L、甘露醇22g/L、琼脂22g/L、pH7. 0) 培养10天，挖取新鲜孢子斜面于装有40ml种子培养基(淀粉10g/L、葡萄糖32g/L、蛋白胨7g/L、酵母粉7g/L、碳酸钙3g/L，初始pH7. 0) 的250ml摇瓶中，28°C、200rpm摇床中培养48h，后10% (ν/ν)接种于装有40ml发酵培养基 (淀粉20g/L、糊精45g/L、麸质粉2g/L、蛋白胨4g/L、酵母粉8g/L、玉米浆4g/L、冷榨豆饼粉 4g/L、磷酸氢二钾1. 5g/L、硫酸铵lg/L、硫酸镁lg/L、碳酸钙lg/L，初始pH7. 0)的250ml摇瓶中，26°C、220rpm摇床中培养19 !，ΗΡΙΧ检测子囊霉素含量，挑选高产子囊霉素的遗传稳定突变株。突变株正突变率15-17%。发酵单位比原始菌株提高35-42%。实施例3在室温下，取成熟孢子斜面加入适量无菌水，制成IO6-IO7个/ml的单孢子悬浮液， 将0. 2ml的悬浮液分装于无菌的1. 5ml的离心管内，进行飞秒激光(中心波长800nm、脉宽 150fs、频率76MHz)辐照6min，辐照功率20mW。辐照处理后的孢子悬液经无菌水10倍梯度稀释IO3-IO4倍后吸取0. Iml涂布于固体平板培养基(大豆粉20g/L、甘露醇20g/L、琼脂 20g/L、pH7. 0)中避光培养10天，选取生长良好的单菌株接种于斜面培养基(大豆粉 22g/L、甘露醇22g/L、琼脂20g/L、pH7. 0) 培养10天，挖取新鲜孢子斜面于装有40ml种子培养基(淀粉10g/L、葡萄糖30g/L、蛋白胨6g/L、酵母粉6g/L、碳酸钙2g/L，初始pH7. 0) 的250ml摇瓶中，28°C、200rpm摇床中培养48h，后10% (ν/ν)接种于装有40ml发酵培养基 (淀粉15g/L、糊精45g/L、麸质粉3g/L、蛋白胨4g/L、酵母粉12g/L、玉米浆4g/L、冷榨豆饼粉4g/L、磷酸氢二钾1. 5g/L、硫酸铵0. 5g/L、硫酸镁lg/L、碳酸钙1. 5g/L，初始pH7. 0)的 250ml摇瓶中，28°C、200rpm摇床中培养168h，HPLC检测子囊霉素含量，挑选高产子囊霉素的遗传稳定突变株。突变株正突变率20-21%。发酵单位比原始菌株提高48-52%。实施例4在室温下，取成熟孢子斜面加入适量无菌水，制成IO6-IO7个/ml的单孢子悬浮液，将0. 2ml的悬浮液分装于无菌的1. 5ml的离心管内，进行飞秒激光(中心波长800nm、脉宽 150fs、频率76MHz)辐照％iin，辐照功率20mW。辐照处理后的孢子悬液经无菌水10倍梯度稀释IO3-IO4倍后吸取0. Iml涂布于固体平板培养基(大豆粉20g/L、甘露醇20g/L、琼脂 20g/L、pH7. 0)中避光培养10天，选取生长良好的单菌株接种于斜面培养基(大豆粉 15g/L、甘露醇25g/L、琼脂20g/L、pH7. 0) 培养10天，挖取新鲜孢子斜面于装有40ml种子培养基(淀粉10g/L、葡萄糖30g/L、蛋白胨6g/L、酵母粉6g/L、碳酸钙2g/L，初始pH7. 0) 的250ml摇瓶中，28°C、200rpm摇床中培养48h，后10% (ν/ν)接种于装有40ml发酵培养基 (淀粉20g/L、糊精40g/L、麸质粉2. 5g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉10g/L、玉米浆5g/L、冷榨豆饼粉5g/L、磷酸氢二钾lg/L、硫酸铵lg/L、硫酸镁lg/L、碳酸钙lg/L，初始pH7. 0)的250ml 摇瓶中，28°C、220rpm摇床中培养168h，HPLC检测子囊霉素含量，挑选高产子囊霉素的遗传稳定突变株。突变株正突变率对-25%。发酵单位比原始菌株提高55-58%。实施例5在室温下，取成熟孢子斜面加入适量无菌水，制成IO6-IO7个/ml的单孢子悬浮液， 将0. 2ml的悬浮液分装于无菌的1. 5ml的离心管内，进行飞秒激光(中心波长800nm、脉宽 150fs、频率76MHz)辐照2min，辐照功率25mW。辐照处理后的孢子悬液经无菌水10倍梯度稀释IO3-IO4倍后吸取0. Iml涂布于固体平板培养基(大豆粉20g/L、甘露醇20g/L、琼脂 20g/L、pH7. 0)中避光培养10天，选取生长良好的单菌株接种于斜面培养基(大豆粉 20g/L、甘露醇20g/L、琼脂20g/L、pH7. 0) 培养10天，挖取新鲜孢子斜面于装有40ml种子培养基(淀粉10g/L、葡萄糖30g/L、蛋白胨6g/L、酵母粉6g/L、碳酸钙2g/L，初始pH7. 0) 的250ml摇瓶中，28°C、200rpm摇床中培养48h，后10% (ν/ν)接种于装有40ml发酵培养基 (淀粉20g/L、糊精40g/L、麸质粉2g/L、蛋白胨4g/L、酵母粉8g/L、玉米浆4g/L、冷榨豆饼粉4g/L、磷酸氢二钾0. 5g/L、硫酸铵1. 5g/L、硫酸镁lg/L、碳酸钙0. 5g/L，初始pH7. 0)的， ^°C、ISOrpm摇床中培养144h，HPLC检测子囊霉素含量，挑选高产子囊霉素的遗传稳定突变株。突变株正突变率18-20%。发酵单位比原始菌株提高25-30%。实施例6在室温下，取成熟孢子斜面加入适量无菌水，制成IO6-IO7个/ml的单孢子悬浮液， 将0. 2ml的悬浮液分装于无菌的1. 5ml的离心管内，进行飞秒激光(中心波长800nm、脉宽 150fs、频率76MHz)辐照lmin，辐照功率30mW。辐照处理后的孢子悬液经无菌水10倍梯度稀释IO3-IO4倍后吸取0. Iml涂布于固体平板培养基(大豆粉20g/L、甘露醇20g/L、琼脂 20g/L、pH7. 0)中避光培养10天，选取生长良好的单菌株接种于斜面培养基(大豆粉 20g/L、甘露醇20g/L、琼脂20g/L、pH7. 0) 培养10天，挖取新鲜孢子斜面于装有40ml种子培养基(淀粉10g/L、葡萄糖30g/L、蛋白胨6g/L、酵母粉6g/L、碳酸钙2g/L，初始pH7. 0) 的250ml摇瓶中J8°C、200rpm摇床中培养48h，后10% (ν/ν)接种于装有40ml发酵培养基(淀粉25g/L、糊精45g/L、麸质粉2. 5g/L、蛋白胨6g/L、酵母粉llg/L、玉米浆6g/L、冷榨豆饼粉6g/L、磷酸氢二钾1. 5g/L、硫酸铵lg/L、硫酸镁1. 5g/L、碳酸钙1. 5g/L，初始pH7. 0) 的250ml摇瓶中，28°C、180rpm摇床中培养168h，HPLC检测子囊霉素含量，挑选高产子囊霉素的遗传稳定突变株。突变株正突变率8-10%。发酵单位比原始菌株提高15-18%。
权利要求
1.一种飞秒激光诱变吸水链霉菌子囊亚种选育子囊霉素高产菌株方法，其特征在于包括以下过程将吸水链霉菌子囊亚种在室温下，取成熟孢子斜面加入适量无菌水，制成 IO6-IO7个/ml的单孢子悬浮液，将0. 2ml的悬浮液分装于无菌的1. 5ml的离心管内，采用中心波长800nm、脉宽150fs、频率76MHz的钛宝石飞秒激光在照射功率10_30mW下，对该孢子辐照Ι-lOmin，然后把经辐照处理的孢子悬液梯度稀释IO3-IO4倍，取稀释后的孢子液0. Iml 涂布于固体平板培养基中培养10d，选取生长良好的单菌株接种于斜面培养基培养10d，接适量孢子悬浮液于装有40ml种子培养基的250ml摇瓶中，28°C、200rpm摇床中培养48h，后接种于装有40ml发酵培养基的250ml摇瓶中，26°C -30°C、180_220rpm摇床中培养144-19 ,从中获得诱变的遗传稳定、发酵单位提高的吸水链霉菌子囊亚种的突变株。
2.权利要求1的方法中的培养基制备，其特征在于固体和斜面培养基组成及含量为 大豆粉 15-25g/L、甘露醇 15-25g/L、琼脂 18_22g/L，初始 pH7. 0。
3.权利要求1的方法中的培养基制备，其特征在于液体发酵培养基组成及含量为淀粉15-25g/L、糊精35-45g/L、麸质粉2_3g/L、蛋白胨4_6g/L、酵母粉8_12g/L、玉米浆4_6g/ L、冷榨豆饼粉4-6g/L、磷酸氢二钾0. 5-1. 5g/L、硫酸铵0. 5-1. 5g/L、硫酸镁0. 5-1. 5g/L、碳酸钙 0. 5-1.5g/L，初始 pH7. 0。
4.权利要求1的方法中的培养基制备，其特征在于液体种子液培养基组成及含量为淀粉8-12g/L、葡萄糖25-35g/L、蛋白胨5-7g/L、酵母粉5-7g/L、碳酸钙l_3g/L，初始 ρΗ7· 0。
全文摘要
本发明公开了一种飞秒激光诱变吸水链霉菌子囊亚种选育子囊霉素高产菌株方法及培养基制备；在室温下，取吸水链霉菌子囊亚种(ATCC14891)的成熟斜面孢子用无菌水制成106-107个/ml的单孢子悬浮液；采用中心波长800nm、脉宽150fs、频率76MHz的钛宝石飞秒激光在照射功率10-30mW下，对该孢子液辐照1-10min；孢子液经适当稀释，涂布于固体平板培养，后经摇瓶筛选，从中获得高产子囊霉素突变株。本发明的优点在于采用的飞秒激光诱变方法易行、操作安全，其诱变效果远较传统的物理化学诱变方法好，在微生物制药菌种选育中有较大的推广价值，本发明通过利用飞秒激光辐照进行诱变，可选育出高产子囊霉素的突变株。突变株正突变率5-30％，发酵单位比原始菌株提高10-60％。
文档编号C12N13/00GK102250872SQ20111016568
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月20日 优先权日2011年6月20日
发明者闻建平, 齐海山 申请人:天津大学