专利名称：用于治疗菌群失调症菌群紊乱症的大肠埃希氏菌、制剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物制剂，具体地说是一种用于治疗菌群失调症菌群紊乱症的大肠埃希氏菌、制剂及其制备方法。
背景技术：
目前临床常采用微生态制剂治疗肠道菌群失调症，是利用肠道益生菌作为种子， 通过发酵工程等扩大其数量制成的活菌制剂，均为口服剂型。该类制剂采用的是工程菌，不能根据个体菌群失调程度的不同调整给菌量，且口服剂型的生物利用度较低。人类的整个肠腔内都存在着大量细菌，正常情况下这些细菌并不致病，是肠道的正常菌群即生理性细菌，为人体提供生物拮抗、增强免疫、营养等有益作用。但随着抗生素、 免疫抑制剂、介入手段等的广泛使用，耐药菌株、菌群失调已无法克服，抗感染治疗遇到了前所未有的困难，使得感染的防治必然从“抗菌时代”向“促菌时代”转变，而唯一的出路就是用微生态技术解决这个难题。
发明内容
本发明的目的在于提出一种治疗菌群失调症菌群紊乱症效果优异的大肠埃希氏菌。本发明的再一目的在于利用上述菌株制备灌肠用菌剂。本发明的第三目的在于给出一种灌肠菌剂的制备方法。为了实现上述目的，本发明的发明思路为发明人依托实验室优势，首先对临床患者粪便标本进行肠道菌群分析，根据菌群失调程度的不同(II度菌群失调症、I度菌群紊乱症、II度菌群紊乱症、III度菌群紊乱症)，使用拟被灌肠患者粪便中分离的正常的大肠埃希氏菌即宿主自身生理性细菌，通过大量筛选优化得到了一株治疗效果非常好的大肠埃希氏菌CGMCC No. 4697。利用该菌株制备不同浓度(1. 5-9. 0 X 108CFU/ml)和液量(25 50ml) 的大肠埃希氏菌液进行保留灌肠，从而纠正肠道菌群失调状态，巩固肠道生物屏障，提高机体免疫能力，符合患者肠道生理环境要求。本发明所采用的具体技术方案如下一种用于治疗菌群失调症菌群紊乱症的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，于 2011年3月18日，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为 CGMCC No. 4697，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码100101。一种用于治疗菌群失调症菌群紊乱症的灌肠制剂，所述制剂包含有上述的保藏编号为CGMCC No. 4697的大肠埃希氏菌。所述灌肠制剂可以根据实际用药情况制备成栓剂或灌肠液。所述栓剂或灌肠液中含有保藏编号为CGMCC No. 4697的大肠埃希氏菌菌液，菌液浓度为 1. 5 X IO8 9. 0 X 108CFU/ml。
一种灌肠制剂的制备方法，具体步骤为(1)挑取大肠埃希氏菌CGMCC吣.4697菌落，接种到51111营养肉汤中，置30 ；351 电热恒温培养箱培养他；(2)用营养肉汤调制成0. 5 3. 0麦氏浊度大肠埃希氏菌液，得到活菌终浓度为 1. 5 X IO8 9. OX 108CFU/ml的大肠埃希氏菌液。(3)分装即得。所述大肠埃希氏菌CGMCC No. 4697在使用前进行纯培养，方法为接种大肠埃希氏菌CGMCC No. 4697在血琼脂平板和麦康凯平板上，置35°C电热恒温培养箱培养18 24h 后进行菌种鉴定。菌种鉴定方法为挑取血琼脂平板上的灰白色菌落或麦康凯平板上乳糖发酵菌落，涂片革兰染色镜检为革兰阴性杆菌，氧化酶试验阴性，做双糖、尿素、吲哚、枸橼酸盐、鸟氨酸、赖氨酸、氨基酸空白试验，若产酸/产气、不产硫化氢、尿素酶阴性，吲哚阳性、枸橼酸盐阴性、赖氨酸阳性，鉴定为大肠埃希氏菌；经VITEK鉴定仪确认为大肠埃希氏菌，并经血清学检测最终确认为非引起肠道感染的大肠埃希氏菌。所述大肠埃希氏菌CGMCC No. 4697纯培养后的菌种直接使用或转种在脱脂牛奶中，-70°C保存，使用时复苏。所述复苏步骤为将保存在-70°C冰箱中的相应菌株取出转种血琼脂平板或麦康凯平板，置35°C电热恒温培养箱培养18 Mh，复苏后用于制备灌肠制剂。上述的保藏编号为CGMCC No. 4697的大肠埃希氏菌在制备治疗菌群失调症灌肠制剂或菌群紊乱症灌肠制剂中的应用。本发明灌肠制剂推荐使用方法每日灌肠使用一次，连续使用三天。还可以根据粪便菌群分析调整治疗方案，纠正肠道菌群失调状态。本发明的有益效果本发明提供的大肠埃希氏菌CGMCC No. 4697均有很好的调节肠道菌群失调状态的功效，并且可以巩固肠道屏障。利用该菌株可以根据菌群失调程度的不同(II度菌群失调症、I度菌群紊乱症、II度菌群紊乱症、III度菌群紊乱症)制备不同浓度(1. 5 9. OX 108CFU/ml)和液量05 50ml)的大肠埃希氏菌液进行保留灌肠，然后再根据粪便菌群分析调整治疗方案，从而纠正肠道菌群失调状态，巩固肠道生物屏障，提高机体免疫能力，符合患者肠道生理环境要求。该治疗个体化、灵活化、有效、经济，且操作简单、方便，易于推广和规范化。
具体实施例方式在本具体实施方式
中制备大肠埃希氏菌CGMCC No. 4697灌肠液所需试剂、培养基、 设备包括(1)设备35°C电热恒温培养箱，_70°C超低温冰箱。(2)培养基血琼脂平板(购自天津金章科技发展有限公司)、麦康凯平板(购自天津金章科技发展有限公司)、脱脂牛奶(购自内蒙古蒙牛乳业股份有限公司)、营养肉汤 (牛肉蛋白胨和牛肉粉购自中国检验检疫科学研究院北京陆桥技术有限公司，氯化钠和磷酸氢二钾购自北京化工厂)。
(3)试剂革兰染色液、氧化酶试剂、双糖、尿素、吲哚、枸橼酸盐、鸟氨酸、赖氨酸、 氨基酸空白、肠道感染大肠埃希氏菌血清型诊断试剂。质量控制(1)试剂的质量控制所有试剂用于检测标本前，必须质控以评估质量并记录质控结果，每配制一批自制试剂要求用阴性、阳性标准菌株或质控菌株评估其质量，只有质控合格才可使用。常用试剂质量控制见表1。表1常用试剂质量控制
权利要求
1.一种用于治疗菌群失调症菌群紊乱症的大肠埃希氏菌，其特征在于，所述大肠埃希氏菌的保藏编号为CGMCC No. 4697。
2.一种用于治疗菌群失调症菌群紊乱症的灌肠制剂，其特征在于，所述制剂包含有权利要求1所述的保藏编号为CGMCC No. 4697的大肠埃希氏菌。
3.根据权利要求2所述的灌肠制剂，其特征在于，所述灌肠制剂为栓剂或灌肠液。
4.根据权利要求3所述的灌肠制剂，其特征在于，所述栓剂或灌肠液中含有保藏编号为CGMCC No. 4697的大肠埃希氏菌菌液，菌液浓度为1. 5 X IO8 9. 0 X 108CFU/ml。
5.一种灌肠制剂的制备方法，其特征在于，具体步骤为(1)挑取大肠埃希氏菌CGMCCNo. 4697菌落，接种到5ml营养肉汤中，置30 35°C电热恒温培养箱培养他；(2)用营养肉汤调制成0.5 3. 0麦氏浊度大肠埃希氏菌液，得到活菌终浓度为 1. 5 X IO8 9. OX 108CFU/ml的大肠埃希氏菌液。(3)分装即得。
6.根据权利要求5所述的灌肠制剂的制备方法，其特征在于，所述大肠埃希氏菌CGMCC No. 4697在使用前进行纯培养，方法为接种大肠埃希氏菌CGMCCNo. 4697在血琼脂平板和麦康凯平板上，置35°C电热恒温培养箱培养18 24h后进行菌种鉴定。
7.根据权利要求6所述的灌肠制剂的制备方法，其特征在于，菌种鉴定方法为挑取血琼脂平板上的灰白色菌落或麦康凯平板上乳糖发酵菌落，涂片革兰染色镜检为革兰阴性杆菌，氧化酶试验阴性，做双糖、尿素、吲哚、枸橼酸盐、鸟氨酸、赖氨酸、氨基酸空白试验，若产酸/产气、不产硫化氢、尿素酶阴性，吲哚阳性、枸橼酸盐阴性、赖氨酸阳性，鉴定为大肠埃希氏菌；经VITEK鉴定仪确认为大肠埃希氏菌，并经血清学检测最终确认为非引起肠道感染的大肠埃希氏菌。
8.根据权利要求7所述的灌肠制剂的制备方法，其特征在于，所述大肠埃希氏菌CGMCC No. 4697纯培养后的菌种直接使用或转种在脱脂牛奶中，_70°C保存，使用时复苏。
9.根据权利要求8所述的灌肠制剂的制备方法，其特征在于，所述复苏步骤为将保存在-70°C冰箱中的相应菌株取出转种血琼脂平板或麦康凯平板，置35°C电热恒温培养箱培养18 Mh，复苏后用于制备灌肠制剂。
10.权利要求1所述的保藏编号为CGMCCNo. 4697的大肠埃希氏菌在制备治疗菌群失调症灌肠制剂或菌群紊乱症灌肠制剂中的应用。
全文摘要
一种用于治疗菌群失调症菌群紊乱症的大肠埃希氏菌，所述大肠埃希氏菌的保藏编号为CGMCC No.4697。本发明提供的大肠埃希氏菌CGMCC No.4697均有很好的调节肠道菌群失调状态的功效，并且可以巩固肠道屏障。利用该菌株可以根据菌群失调程度的不同(II度菌群失调症、I度菌群紊乱症、II度菌群紊乱症、III度菌群紊乱症)制备不同浓度(1.5-9.0×108CFU/ml)和液量(25-50ml)的大肠埃希氏菌液进行保留灌肠，然后再根据粪便菌群分析调整治疗方案，从而纠正肠道菌群失调状态，巩固肠道生物屏障，提高机体免疫能力，符合患者肠道生理环境要求。该治疗个体化、灵活化、有效、经济，且操作简单、方便，易于推广和规范化。
文档编号C12N1/20GK102229898SQ201110117270
公开日2011年11月2日 申请日期2011年5月6日 优先权日2011年5月6日
发明者吕治, 尉景娟, 徐小用, 曾昭瑛, 王建成, 苏建荣, 许淑珍, 闫东辉, 陈力, 马立艳 申请人:首都医科大学附属北京友谊医院