专利名称：一种丁酸梭菌的清液发酵培养基及其发酵培养方法
技术领域：
本发明涉及一种丁酸梭菌的清液发酵培养基及其发酵培养方法，属于微生物发酵技术领域。
背景技术：
丁酸梭菌iflostridium butyricum)，即丁酸梭状芽孢杆菌，又名酪酸菌。它是梭状芽孢菌属中的一个种，主要存在于奶酪、天然酸奶、人与动物的肠道与粪便中、某些树叶、 土壤等自然环境中。丁酸梭菌是一种直的或弯曲的革兰氏阳性厌氧内生芽孢杆菌，对环境变化具有一定的抗性，这些特点使丁酸梭菌具有作为优良益生菌的潜力。另一方面，丁酸梭菌通过动物肠道时，能耐胃酸及胆汁酸盐，很好地保证了其性能的发挥。在临床医学和畜牧业方面广泛应用于整肠药物、保健食品、饲料添加剂、微生物肥料等，是一种较理想的具有广泛开发前景的微生态制剂。1999年2月由联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)联合召开的第52次食品添加剂专家委员会强调指出丁酸梭菌是人的正常肠道菌。此后，人们广泛的关注和研究了酪酸梭菌的形态特征、生理特点、生化特点及其商业应用。1940年，丁酸梭菌在日本实现了商业化生产并被应用于临床。最初，它被用作整肠剂，广泛用于肠道菌群失调，急慢性腹泻，肠易激综合症，抗生素相关性肠炎等疾病的治疗，取得了显著疗效。此后，它先后被作为处方药、非处方药、兽药、饲料添加剂、食品添加剂等广泛使用。在韩国，酪酸梭菌也已经被用于牛、猪及家禽的饲料添加剂，丁酸梭菌能单独作为饲料添加剂使用，也能与乳酸菌、 芽孢菌、双歧杆菌等益生菌复配使用，能增强其功效。益生菌类微生态制剂在替代抗生素、防治畜禽疾病和改善环境等方面的积极作用已经得到了公认，但是目前真正符合生产要求的高质量微生态制剂产品还很少。丁酸梭菌由于生物学特性，在临床上具有非常显著的治疗效果，而且因其具有芽孢形态，有较高的实用价值。下述专利CN1144873C、CN1184308C、US5. 292 523 (1994)、US4. 892 731(1990)、 JP63-146825 (1986)、JP61-6625 (1984)、JP06-166825 (1994)、JP05-227898 (1993)涉及到丁酸梭菌的发酵和制备方法，这些现有技术存在一些缺点，1、就培养方式而言，大量运用复合培养基，或者其他含有大量不溶性成分培养基，引起后处理困难，成本高昂，单位菌粉活菌含量低，杂质较多；2、就培养效果而言，发酵液菌数较少，芽孢率较低。
发明内容
本发明为克服现有技术的缺点，提供一种丁酸梭菌的清液发酵培养基及其发酵培养方法，全部添加的是可溶性碳氮源和金属盐，无培养基沉淀，利用率高，菌液后处理简单， 菌粉有效含量高，方便保存，从总体上大幅降低处理成本。本发明的一种丁酸梭菌的清液发酵培养基的技术方案，包括下述组份葡萄糖 0. 8 2. 5% (w/v)，胰蛋白胨0. 6 2. 3% (w/v)，酵母浸粉1. 1 2. 8% (w/v)，硫酸铵0. 05 0. 2 % (w/v)，碳酸氢钠0. 05 0. 25 % (w/v)， 玉米浆粉或谷物浆粉或大豆浆粉 0. 2 0. 45% (w /ν) ； PH 值为 7 8。进一步的技术方案是
所述的丁酸梭菌的清液发酵培养基的技术方案，组份是葡萄糖0. 8% (w/v)，胰蛋白胨 0. 6% (w/v)，酵母浸粉1. 1% (w/v)，硫酸铵0. 05 % (w/v)，碳酸氢钠0. 05 % (w/v)，玉米浆粉或谷物浆粉或大豆浆粉0.洲(w /ν) ；PH值7。所述的丁酸梭菌的清液发酵培养基，组份是葡萄糖2. 5% (w/v)，胰蛋白胨2. 3% (w/v)，酵母浸粉2. 8% (w/v)，硫酸铵0. 2 % (w/v)，碳酸氢钠0. 25 % (w/v)，玉米浆粉或谷物浆粉或大豆浆粉0. 45% (w /ν) ；PH值8。所述的丁酸梭菌的清液发酵培养基，组份是葡萄糖1. 5% (w/v)，胰蛋白胨1. 3% (w/v)，酵母浸粉1. 8% (w/v)，硫酸铵0. 1 % (w/v)，碳酸氢钠0. 12% (w/v)，玉米浆粉0. 33% (w /ν) ；PH 值 7. 5。本发明一种用于丁酸梭菌的清液发酵培养基促芽孢生成的金属盐，包括下述组份硫酸锰 0. 01 0. 1% (w/v)，硫酸镁 0. 01 0. l%(w/v)，硫酸亚铁 0. 01 0. 08% (w/v)
ο进一步的技术方案是
所述的丁酸梭菌的清液发酵培养基促芽孢生成的金属盐，组份是硫酸锰0. 05%(W/ ν)，硫酸镁 0. 05% (w/v)，硫酸亚铁 0. 03% (w/v)。本发明一种用于丁酸梭菌的清液发酵培养基的增殖培养基(RCM)，组成和重量份为酵母浸膏2 4、牛肉浸膏8 12、胰蛋白胨8 12、葡萄糖3 8、可溶性淀粉0.5 2、氯化钠3 8、三水合乙酸钠1 6、半胱氨酸盐酸盐0. 1 1. 5、0. 5%美蓝0. 1 3mL、蒸溜水 800 1200mL ；调节 pH7. 1 士 0. 1。进一步的技术方案是
所述的丁酸梭菌的清液发酵培养基的增殖培养基(RCM)，配方组成为酵母浸膏3g、牛肉浸膏10 g、胰蛋白胨10 g、葡萄糖5 g、可溶性淀粉1 g、氯化钠5 g、三水合乙酸钠3 g、 半胱氨酸盐酸盐0. 5 g、0. 5%美蓝0. 2mL、蒸馏水IOOOmL ；调节ρΗ7· 1 士 0. 1。本发明一种丁酸梭菌的清液发酵培养基的发酵培养方法，包括以下步骤
(1)甘油管冷藏菌种活化取甘油管冷藏菌种接种于装有增殖培养基(RCM)的试管中， 上覆液体石蜡，培养基提前灭菌，然后静置培养形成芽孢；
(2)加热优选将上述培养液混勻后置于水浴中处理；
(3)三角瓶一级种子培养再分别将上述菌液转接到灭过菌的优化后培养基的三角瓶中，培养到对数期能作为种子液接种到发酵培养基中；具有促芽孢生成的金属盐的发酵培养基包括葡萄糖，胰蛋白胨，酵母浸粉，硫酸铵，碳酸氢钠，玉米浆粉或谷物浆粉或大豆浆粉，硫酸锰，硫酸镁，硫酸亚铁，并保持一定PH值；
(4)液体发酵将培养好的三角瓶一级种子培养基接入发酵罐中发酵；
(5)喷雾干燥发酵液用均质机均质，控制喷雾干燥，即可制得高纯菌粉。进一步的技术方案是
所述的丁酸梭菌的清液发酵培养基的发酵培养方法，在所述步骤中 (1)甘油管冷藏菌种活化取-25 -18°c冷藏的甘油管菌种180 230 μ L接种于装有6 12mL增殖培养基(RCM)的试管中，上覆1 3cm液体石蜡，培养基提前灭菌，33 38°C条件下静置培养40 50h以形成芽孢；所述增殖培养基(RCM)包括下述组成重量份 酵母浸膏2 4、牛肉浸膏8 12、胰蛋白胨8 12、葡萄糖3 8、可溶性淀粉0.5 2、 氯化钠3 8、三水合乙酸钠1 6、半胱氨酸盐酸盐0. 1 1. 5、0. 5%美蓝0. 1 3mL、 蒸馏水 800 1200mL ；调节 pH7. 1 士0. 1,100 120°C，20 min 灭菌备用；
(2)加热优选将上述培养液混勻后置于70 90°C水浴中处理9 12min；
(3)三角瓶一级种子培养再分别以1 3%的接种量将上述菌液转接到灭过菌的优化后培养基的三角瓶中，培养16_20h到对数期能作为种子液接种到发酵培养基中；
所述具有促芽孢生成的金属盐的发酵培养基，配方组成为葡萄糖0. 8 2. 5% (w/v)， 胰蛋白胨0. 6 2. 3% (w/v)，酵母浸粉1. 1 2. 8% (w/v)，硫酸铵0. 05 0. 2 % (w/v)， 碳酸氢钠0. 05 0. 25 % (w/v)，玉米浆粉或谷物浆粉或大豆浆粉0. 2 0. 45% (w /ν)； PH值为7 8 ；硫酸锰0. 01 0. l%(w/v)，硫酸镁0. 01 0. l%(w/v)，硫酸亚铁0. 01 0. 08% (w/v)；
(4)液体发酵将培养好的三角瓶一级种子培养基接入发酵罐中，接种量3% 5%， 控温33 40°C，搅拌转速45 60rpm，发酵过程中PH值降低到6. 5以下，补加18 25% 碳酸钠控制PH值为6. 5，直到发酵结束，且发酵Mh以内流加碳源，流加0. 55 1. 5% (w/ ν)碳源;
(5)喷雾干燥发酵液用均质机均质，控制喷雾干燥中进风温度130 160°C，出口温度 50 75°C，即可制得高纯菌粉。所述的丁酸梭菌的清液发酵培养基的发酵培养方法，在所述步骤中
(1)甘油管保藏菌种活化取-20°C保藏的甘油管菌种200 μ L接种于装有9mL增殖培养基(RCM)的试管中，上覆2cm液体石蜡，培养基提前灭菌，37°C条件下静置培养48h以形成芽孢；所述RCM培养基配方如下酵母浸膏3 g、牛肉浸膏10 g、胰蛋白胨10g、葡萄糖 5g、可溶性淀粉lg、氯化钠5g、三水合乙酸钠3g、半胱氨酸盐酸盐0. 5g、0. 5%美蓝0. 2mL、蒸馏水 IOOOmL ；调节 pH7. 1 士0. 1，115°C，20 min 灭菌备用；
(2)加热优选将上述培养液混勻后置于80°C水浴中处理IOmin；加热可以促进芽孢萌发，有利于菌体生长一致性和防止杂菌污染；
(3)三角瓶一级种子培养再分别以3%的接种量将上述菌液转接到灭过菌的优化后培养基的三角瓶中，培养16_20h到对数期能作为种子液接种到发酵培养基中葡萄糖 1.5% (w/v)，胰蛋白胨1.3% (w/v)，酵母浸粉1.8% (w/v)，硫酸铵0.1 % (w/v)，碳酸氢钠 0. 124% (w/v)，玉米浆粉 0. 33% (w /ν)，硫酸锰 0. 05% (w/v)，硫酸镁 0. 05% (w/v)，硫酸亚铁 0. 03% (w/v) ；PH 值 7. 5;
(4)液体发酵将培养好的三角瓶一级种子培养基接入发酵罐中，接种量3% 5%， 控温37°C，搅拌转速50rpm，发酵过程中PH值降低到6. 5以下，补加20%碳酸钠控制PH值为6. 5，直到发酵结束，且发酵Mh以内流加碳源，流加1% (w/v)碳源；
(5)喷雾干燥发酵液用均质机均质，控制喷雾干燥中进风温度150°C，出口温度70°C， 即可制得高纯菌粉。本发明的主要优点如下
(1)本发明丁酸梭菌的清液发酵培养基的发酵培养方法中，添加可溶性碳氮源和金属盐，无培养基沉淀，利用率高，菌液后处理简单，菌粉有效含量高，方便保存，从总体上大大降低成本。厌氧发酵通过在培养基上覆石蜡，石蜡可重复循环利用，不需要通入惰性气体， 环保节约。(2)分段流加培养方式，进一步提高丁酸菌含量，进而提高芽孢形成率，采用本发明生产丁酸梭菌，大大提高发酵菌数和芽孢得率，发酵液菌数可达2. 3 X 109CfU/ml，芽孢得率95%以上。(3)加热优选种子培养基方式，使得菌体生长一致。(4)发酵结束后用喷雾干燥方式，能快速高效获得大量高含量菌粉。
具体实施例方式实施例1 本发明的丁酸梭菌的清液发酵培养基组份是葡萄糖1. 5% (w/v)，胰蛋白胨1. 3% (w/v)，酵母浸粉1. 8% (w/v)，硫酸铵0. 1 % (w/v)，碳酸氢钠0. 12% (w/v)，玉米浆粉 0.33% (w /ν) ；PH 值 7. 5。实施例2 本发明的丁酸梭菌的清液发酵培养基组份是葡萄糖0. 8% (w/v)，胰蛋白胨0. 6% (w/v)，酵母浸粉1. 1% (w/v)，硫酸铵0. 05 % (w/v)，碳酸氢钠0. 05 % (w/v)，玉米浆粉或谷物浆粉或大豆浆粉0.洲(w /ν) ；PH值7。实施例3 本发明的丁酸梭菌的清液发酵培养基组份是葡萄糖2. 5% (w/v)，胰蛋白胨2. 3% (w/v)，酵母浸粉2. 8% (w/v)，硫酸铵0. 2 % (w/v)，碳酸氢钠0. 25 % (w/v)，玉米浆粉或谷物浆粉或大豆浆粉0. 45% (w /ν) ；PH值8。实施例4 本发明一种用于丁酸梭菌的清液发酵培养基促芽孢生成的金属盐，包括下述组份硫酸锰0. 01 0. l%(w/v)，硫酸镁0. 01 0. l%(w/v)，硫酸亚铁0. 01 0. 08% (w/v)。本实施例组份是硫酸锰0. 05% (w/v)，硫酸镁0. 05% (w/v)，硫酸亚铁 0. 03% (w/v)。实施例5 本发明一种用于丁酸梭菌的清液发酵培养基的增殖培养基(RCM)，组成和重量份为酵母浸膏2 4、牛肉浸膏8 12、胰蛋白胨8 12、葡萄糖3 8、可溶性淀粉0. 5 2、氯化钠3 8、三水合乙酸钠1 6、半胱氨酸盐酸盐0. 1 1. 5,0. 5%美蓝 0. 1 3mL、蒸馏水800 1200mL ；调节pH7. 1 士0. 1。本实施例配方组成为酵母浸膏3g、 牛肉浸膏10 g、胰蛋白胨10 g、葡萄糖5 g、可溶性淀粉1 g、氯化钠5 g、三水合乙酸钠3 g、半胱氨酸盐酸盐0.5 g、0. 5%美蓝0. 2mL、蒸馏水IOOOmL;调节pH7. 1 士0. 1。实施例6 本发明一种丁酸梭菌的清液发酵培养基的发酵培养方法，有以下步骤
(1)甘油管冷藏菌种活化取甘油管冷藏菌种接种于装有增殖培养基(RCM)的试管中， 上覆液体石蜡，培养基提前灭菌，然后静置培养形成芽孢；
(2)加热优选将上述培养液混勻后置于水浴中处理；加热可以促进芽孢萌发，有利于菌体生长一致性和防止杂菌污染；
(3)三角瓶一级种子培养再分别将上述菌液转接到灭过菌的优化后培养基的三角瓶中，培养到对数期作为种子液接种到发酵培养基中；具有促芽孢生成的金属盐的发酵培养基包括葡萄糖，胰蛋白胨，酵母浸粉，硫酸铵，碳酸氢钠，玉米浆粉或谷物浆粉或大豆浆粉，硫酸锰，硫酸镁，硫酸亚铁，并保持一定PH值；
(4)液体发酵将培养好的三角瓶一级种子培养基接入发酵罐中发酵；
(5)喷雾干燥发酵液用均质机均质，控制喷雾干燥，即可制得高纯菌粉。本发明所述的丁酸梭菌的清液发酵培养基的发酵培养方法，在所述步骤中，参数选值范围为
(1)甘油管冷藏菌种活化取-25 _18°C冷藏的甘油管菌种180 230μ L接种于装有6 12mL增殖培养基(RCM)的试管中，上覆1 3cm液体石蜡，培养基提前灭菌，33 38°C条件下静置培养40 50h以形成芽孢；所述增殖培养基(RCM)组成重量份如下酵母浸膏2 4、牛肉浸膏8 12、胰蛋白胨8 12、葡萄糖3 8、可溶性淀粉0. 5 2、氯化钠3 8、三水合乙酸钠1 6、半胱氨酸盐酸盐0. 1 1. 5、0. 5%美蓝0. 1 3mL、蒸溜水 800 1200mL ；调节 pH7. 1 士0. 1，100 120°C，20 min 灭菌备用；
(2)加热优选将上述培养液混勻后置于70 90°C水浴中处理9 12min；
(3)三角瓶一级种子培养再分别以1 3%的接种量将上述菌液转接到灭过菌的优化后培养基的三角瓶中，培养16_20h到对数期能作为种子液接种到发酵培养基中；
所述具有促芽孢生成的金属盐的发酵培养基，包括下述组份葡萄糖0. 8 2. 5% (w/ ν)，胰蛋白胨0. 6 2. 3% (w/v)，酵母浸粉1. 1 2. 8% (w/v)，硫酸铵0. 05 0. 2 % (w/ ν)，碳酸氢钠0.05 0.25 % (w/v)，玉米浆粉或谷物浆粉或大豆浆粉0. 2 0. 45% (w / ν)，PH值为7 8 ；硫酸锰0. 01 0. 1% (w/v)，硫酸镁0. 01 0. 1% (w/v)，硫酸亚铁0.01-0. 08% (w/v)；
(4)液体发酵将培养好的三角瓶一级种子培养基接入发酵罐中，接种量3% 5%， 控温33 40°C，搅拌转速45 60rpm，发酵过程中PH值降低到6. 5以下，补加18 25% 碳酸钠控制PH值为6. 5，直到发酵结束，且发酵Mh以内流加碳源，流加0.55 1.5% (w/ ν)碳源;
(5)喷雾干燥发酵液用均质机均质，控制喷雾干燥中进风温度130 160°C，出口温度 50 75°C，即可制得高纯菌粉。 具体实施方案是所述的丁酸梭菌的清液发酵培养基的发酵培养方法，在所述步骤中
(1)甘油管保藏菌种活化取-20°C保藏的甘油管菌种200 μ L接种于装有9mL增殖培养基(RCM)的试管中，上覆2cm液体石蜡隔绝空气，石蜡和培养基提前灭菌(115°C灭菌 20分)，制备四管，37°C条件下静置培养48h以形成芽孢；所述增殖培养基(RCM)配方组成如下酵母浸膏3 g、牛肉浸膏10 g、胰蛋白胨10g、葡萄糖5g、可溶性淀粉lg、氯化钠5g、三水合乙酸钠3g、半胱氨酸盐酸盐0. 5g、0. 5%美蓝0. 2mL、蒸馏水IOOOmL ；调节ρΗ7· 1 士0. 1 ；
(2)加热优选选生长健壮样本，将上述培养液各自混勻后置于80°C水浴中处理 IOmin ；加热可以促进芽孢萌发，有利于菌体生长一致性和防止杂菌污染；
(3)三角瓶一级种子培养再分别以3%的接种量(即6ml)将上述菌液转接到装有200ml 已灭过菌的优化后培养基的250ml三角瓶中(上覆液体石蜡)，共接种3瓶，37°C培养16_20h 到对数期能作为种子液接种到发酵培养基中葡萄糖1.5% (w/v)，胰蛋白胨1.3% (w/v), 酵母浸粉1. 8% (w/v)，硫酸铵0. 1 % (w/v)，碳酸氢钠0. 124% (w/v)，玉米浆粉0. 33% (w / ν)，硫酸锰 0. 05% (w/v)，硫酸镁 0. 05% (w/v)，硫酸亚铁 0. 03% (w/v) ；PH 值 7. 5 ；
(4)液体发酵将培养1 左右三角瓶一级种子培养基接入发酵罐中，发酵罐装液系数70%，上覆2 ml左右液体石蜡，隔绝空气，接种量350 ml ( 3% 5%)，控温37°C，搅拌转速50rpm，发酵过程中PH值降低到6. 5以下，补加20%碳酸钠(质量分数)控制PH值为 6. 5，直到发酵结束，且发酵Mh以内流加碳源，流加1%(w/v)碳源，即葡萄糖70g，30h以后，每隔池镜检染色，观察芽孢形成95%以上，放罐；
(5)喷雾干燥发酵液用均质机均质预处理，控制喷雾干燥中进风温度150°C，出口温度70°C，即可制得高纯菌粉，收集菌粉保存。
本发明权利要求保护范围不仅限于上述实施例。
权利要求
1.一种丁酸梭菌的清液发酵培养基，其特征在于，包括下述组份葡萄糖0. 8 2. 5% (w/v)，胰蛋白胨 0. 6 2. 3% (w/v)，酵母浸粉 1. 1 2. 8% (w/v)，硫酸铵 0. 05 0. 2 % (w/ ν)，碳酸氢钠0. 05 0. 25 % (w/v)，玉米浆粉或谷物浆粉或大豆浆粉0. 2 0. 45% (w / ν) ； PH值为7 8。
2.根据权利要求1所述的丁酸梭菌的清液发酵培养基，其特征在于，组份是葡萄糖 0. 8% (w/v)，胰蛋白胨0. 6% (w/v)，酵母浸粉1. 1% (w/v)，硫酸铵0. 05 % (w/v)，碳酸氢钠 0. 05 % (w/v)，玉米浆粉或谷物浆粉或大豆浆粉0.洲(w /ν) ；PH值7。
3.根据权利要求1所述的丁酸梭菌的清液发酵培养基，其特征在于，组份是葡萄糖 2.5% (w/v)，胰蛋白胨2. 3% (w/v)，酵母浸粉2. 8% (w/v)，硫酸铵0.2 % (w/v)，碳酸氢钠0.25 % (w/v)，玉米浆粉或谷物浆粉或大豆浆粉0. 45% (w /ν) ；PH值8。
4.根据权利要求1所述的丁酸梭菌的清液发酵培养基，其特征在于，组份是葡萄糖1.5% (w/v)，胰蛋白胨1. 3% (w/v)，酵母浸粉1. 8% (w/v)，硫酸铵0. 1 % (w/v)，碳酸氢钠 0. 12% (w/v)，玉米浆粉 0. 33% (w /ν) ；PH 值 7. 5。
5.一种用于权利要求1所述的丁酸梭菌的清液发酵培养基促芽孢生成的金属盐，其特征在于，包括下述组份硫酸锰0. 01 0. 1%(w/v)，硫酸镁0. 01 0. l%(w/v)，硫酸亚铁 0. 01 0. 08% (w/v)。
6.根据权利要求5所述的丁酸梭菌的清液发酵培养基促芽孢生成的金属盐，其特征在于，组份是硫酸锰0. 05% (w/v)，硫酸镁0. 05% (w/v)，硫酸亚铁0. 03% (w/v)。
7.一种用于权利要求1所述的丁酸梭菌的清液发酵培养基的增殖培养基(RCM)，其特征在于，组成和重量份为酵母浸膏2 4、牛肉浸膏8 12、胰蛋白胨8 12、葡萄糖3 8、可溶性淀粉0. 5 2、氯化钠3 8、三水合乙酸钠1 6、半胱氨酸盐酸盐0. 1 1. 5、 0. 5% 美蓝 0. 1 3mL、蒸溜水 800 1200mL ；调节 pH7. 1 士 0. 1。
8.根据权利要求7所述的丁酸梭菌的清液发酵培养基的增殖培养基(RCM)，其特征在于，配方组成为酵母浸膏3g、牛肉浸膏10 g、胰蛋白胨10 g、葡萄糖5 g、可溶性淀粉1 g、 氯化钠5 g、三水合乙酸钠3 g、半胱氨酸盐酸盐0.5 g、0.5%美蓝0.2mL、蒸馏水IOOOmL ； 调节 pH7. 1 士 0. 1。
9.一种丁酸梭菌的清液发酵培养基的发酵培养方法，其特征在于，包括以下步骤(1)甘油管冷藏菌种活化取甘油管冷藏菌种接种于装有增殖培养基(RCM)的试管中， 上覆液体石蜡，培养基提前灭菌，然后静置培养形成芽孢；(2)加热优选将上述培养液混勻后置于水浴中处理；(3)三角瓶一级种子培养再分别将上述菌液转接到灭过菌的优化后培养基的三角瓶中，培养到对数期能作为种子液接种到发酵培养基中；具有促芽孢生成的金属盐的发酵培养基包括葡萄糖，胰蛋白胨，酵母浸粉，硫酸铵，碳酸氢钠，玉米浆粉或谷物浆粉或大豆浆粉，硫酸锰，硫酸镁，硫酸亚铁，并保持一定PH值；(4)液体发酵将培养好的三角瓶一级种子培养基接入发酵罐中发酵；(5)喷雾干燥发酵液用均质机均质，控制喷雾干燥，即可制得高纯菌粉。
10.根据权利要求9所述的丁酸梭菌的清液发酵培养基的发酵培养方法，其特征在于， 在所述步骤中(1)甘油管冷藏菌种活化取-25 _18°C冷藏的甘油管菌种180 230 μ L接种于装有6 12mL增殖培养基(RCM)的试管中，上覆1 3cm液体石蜡，培养基提前灭菌，33 38°C条件下静置培养40 50h以形成芽孢；所述增殖培养基(RCM)组成和重量份为酵母浸膏2 4、牛肉浸膏8 12、胰蛋白胨8 12、葡萄糖3 8、可溶性淀粉0.5 2、氯化钠3 8、三水合乙酸钠1 6、半胱氨酸盐酸盐0. 1 1. 5、0. 5%美蓝0. 1 3mL、蒸馏水 800 1200mL ；调节 ρΗ7· 1 士0. 1，100 120°C，20 min 灭菌备用；(2)加热优选将上述培养液混勻后置于70 90°C水浴中处理9 12min；(3)三角瓶一级种子培养再分别以1 3%的接种量将上述菌液转接到灭过菌的优化后培养基的三角瓶中，培养16_20h到对数期能作为种子液接种到发酵培养基中；所述具有促芽孢生成的金属盐的发酵培养基，组份为葡萄糖0.8 2. 5% (w/v)，胰蛋白胨0. 6 2. 3% (w/v)，酵母浸粉1. 1 2. 8% (w/v)，硫酸铵0. 05 0. 2 % (w/v)，碳酸氢钠0. 05 0. 25 % (w/v)，玉米浆粉或谷物浆粉或大豆浆粉0. 2 0. 45% (w /ν) ； PH值为7 8 ；硫酸锰0. 01 0. 1% (w/v)，硫酸镁0. 01 0. 1% (w/v)，硫酸亚铁0. 01 0. 08% (w/ ν)；(4)液体发酵将培养好的三角瓶一级种子培养基接入发酵罐中，接种量3% 5%， 控温33 40°C，搅拌转速45 60rpm，发酵过程中PH值降低到6. 5以下，补加18 25% 碳酸钠控制PH值为6. 5，直到发酵结束，且发酵Mh以内流加碳源，流加0. 55 1. 5% (w/ ν)碳源;(5)喷雾干燥发酵液用均质机均质，控制喷雾干燥中进风温度130 160°C，出口温度 50 75°C，即可制得高纯菌粉。
11.根据权利要求9或10所述的丁酸梭菌的清液发酵培养基的发酵培养方法，其特征在于，在所述步骤中(1)甘油管保藏菌种活化取-20°C保藏的甘油管菌种200 μ L接种于装有9mL增殖培养基(RCM)的试管中，上覆2cm液体石蜡，培养基提前灭菌，37°C条件下静置培养48h以形成芽孢；所述增殖培养基(RCM)配方组成如下酵母浸膏3 g、牛肉浸膏10 g、胰蛋白胨 10g、葡萄糖5g、可溶性淀粉lg、氯化钠5g、三水合乙酸钠3g、半胱氨酸盐酸盐0. 5g、0. 5%美蓝 0. 2mL、蒸馏水 IOOOmL ；调节 pH7. 1 士0. 1，115°C，20 min 灭菌备用；(2)加热优选将上述培养液混勻后置于80°C水浴中处理IOmin；加热可以促进芽孢萌发，有利于菌体生长一致性和防止杂菌污染；(3)三角瓶一级种子培养再分别以1 3%的接种量将上述菌液转接到灭过菌的优化后培养基的三角瓶中，培养16_20h到对数期能作为种子液接种到发酵培养基中葡萄糖 1.5% (w/v)，胰蛋白胨1.3% (w/v)，酵母浸粉1.8% (w/v)，硫酸铵0.1 % (w/v)，碳酸氢钠 0. 124% (w/v)，玉米浆粉 0. 33% (w /ν)，硫酸锰 0. 05% (w/v)，硫酸镁 0. 05% (w/v)，硫酸亚铁 0. 03% (w/v) ；PH 值 7. 5 ；(4)液体发酵将培养好的三角瓶一级种子培养基接入发酵罐中，接种量3% 5%， 控温37°C，搅拌转速50rpm，发酵过程中PH值降低到6. 5以下，补加20%碳酸钠控制PH值为6. 5，直到发酵结束，且发酵Mh以内流加碳源，流加1% (w/v)碳源；(5)喷雾干燥发酵液用均质机均质，控制喷雾干燥中进风温度150°C，出口温度70°C， 即可制得高纯菌粉。
全文摘要
本发明涉及丁酸梭菌的清液发酵培养基，有葡萄糖，胰蛋白胨，酵母浸粉，硫酸铵，碳酸氢钠，玉米浆粉等，PH值为7～8。用于丁酸梭菌的清液发酵培养基促芽孢生成的金属盐有硫酸锰，硫酸镁，硫酸亚铁。用于丁酸梭菌的清液发酵培养基的增殖培养基有酵母浸膏、牛肉浸膏、胰蛋白胨、葡萄糖、可溶性淀粉、氯化钠、三水合乙酸钠、半胱氨酸盐酸盐、0.5%美蓝、蒸馏水；调节pH7.1。丁酸梭菌的清液发酵培养基的发酵培养方法步骤包括甘油管冷藏菌种活化、加热优选、三角瓶一级种子培养、液体发酵、喷雾干燥。本发明优点是生产丁酸梭菌具有操作简单、发酵菌数和芽孢得率高，后处理简单，菌粉样品杂质少，有效活菌数高，总体上节约成本等优点。
文档编号C12N1/20GK102363754SQ20111011692
公开日2012年2月29日 申请日期2011年5月7日 优先权日2011年5月7日
发明者彭楠, 梁运祥, 王绩, 葛向阳, 赵旭冬, 赵述淼 申请人:华中农业大学