专利名称：一种饲用乳酸菌高密度发酵培养基及其发酵方法
技术领域：
本发明属于乳酸菌培养技术领域，涉及一种饲用乳酸菌高密度发酵培养基及其发酵方法。
背景技术：
乳酸菌是动物消化道中常有的正常菌，应用该类菌研制益生菌剂的历史最早， 此菌已被广泛的应用于发酵食品、动物饲料和保健食品中。唾液乳杆菌(LactcAacillus salivarius)为乳酸菌中的一种，它可通过产生乳酸、细菌素等抗菌物质，抑制病原菌在宿主体内增殖，维持消化道微生物区系平衡，减少大肠杆菌和沙门氏菌引发的腹泻，增进机体健康。传统的静置发酵法得到的发酵液中菌体的发酵密度较低，唾液乳杆菌活菌数在 5-10亿左右，为了得到更多的活菌数，就需要增加生物反应器的体积或增加发酵次数等，从而增加生物量的分离费用，延长生产周期，从而提高生产成本、降低生产效率。唾液乳杆菌目前仍难以实现高密度发酵，难以实现的主要问题是发酵培养基及其发酵方法，发酵后期营养物质不足和代谢产物(主要是乳酸)积累抑制菌体生长，导致高密度发酵难以实现。
发明内容
(一)要解决的技术问题本发明的目的是提供一种饲用乳酸菌高密度发酵培养基。本发明的另一目的是提供该高密度发酵培养基的发酵方法。( 二 )技术方案本发明的目的是通过如下技术方案实现的本发明提供一种饲用乳酸菌高密度发酵培养基，所述的乳酸菌为唾液乳杆菌 (Lactobacillus salivarius)，高密度发酵培养基的主要组分及其含量如下葡萄糖20 30g/L、胰蛋白胨10 15g/L、牛肉膏或牛肉粉6 15g/L、酵母粉5 10g/L、K2HPO4 2 3g/L、CH3C00Na5 8g/L、柠檬酸钠2 4g/L、Mg2+水溶性化合物0. 2 0. 4g/L、Fe2+水溶性化合物0. 1 0. 2g/L和Mn2+水溶性化合物45 55mg/L。其中，所述的Mg2+水溶性化合物为MgS04、MgCl2中的任一种；所述的!^2+水溶性化合物为FeS04、FeCl2, (NH4)2Fe (504)2中的任一种；所述的Mn2+水溶性化合物为MnS04。本发明的饲用乳酸菌高密度发酵培养基的配制方法如下(1)按含量分别称取各组分，用蒸馏水溶解，其中葡萄糖单独溶解；(2)葡萄糖115°C单独灭菌20分钟，其他组分装入发酵罐中121°C灭菌20分钟；(3)接种前通过无菌操作将葡萄糖加入发酵罐中，搅拌混勻，即得。本发明还提供了该饲用乳酸菌高密度发酵培养基的发酵方法，主要步骤如下(1)将冷冻保存的唾液乳杆菌在MRS琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于深层MRS液体试管，37°C培养10小时后，以1 %接种量转接于MRS液体培养基，培养8 10小时后作为种子液；(2)配制发酵培养基，培养基降至所需温度时，接上溶氧电极，标定溶氧为100% ；(3)以5% 10%的接种量将步骤(1)所得的种子液接种于步骤O)的发酵培养
基中；(4)发酵，发酵过程中维持发酵液pH值为5. 0 5. 5，当pH超过设定值时，补加 50%葡萄糖液；当pH低于设定值时，自动流加碱性中和剂氨水、K0H、Na0H中的任一种；在温度37 39°C、转速50rpm条件下发酵10 14小时，发酵过程不通气或通入队，维持溶氧小于；(5)当补加50%葡萄糖液pH不再降低或发酵液在600nm波长下的吸光值(即 OD600)不再增加时，终止发酵，即得唾液乳杆菌活菌数达IOltlCfuAil以上的发酵液。本发明的高密度发酵培养基及其发酵方法适用于其它乳酸菌，但为达到最好的发明效果，优选适用于唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)。本发明的唾液乳杆菌购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为ATCC11741。(三)有益效果本发明采用pH反馈控制补加葡萄糖策略，同时降低发酵液中乳酸的浓度，从而解除乳酸的反馈抑制作用，使用本发明的高密度发酵培养基及其发酵方法发酵的唾液乳杆菌，菌体密度较普通发酵显著提高，活菌数不低于101(lCfU/ml，这是现有的技术难以达到的发酵标准，较普通MRS培养基培养活菌数5. 1 X 108CfU/ml，提高50倍以上，实现了唾液乳杆菌的高密度发酵；可以减小生物量的分离费用，缩短生产周期，从而降低生产成本、提高生产效率。
具体实施例方式通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。本发明下列实施例所用的仪器型号、试剂及其来源如下发酵罐NewBrunswick公司 BioFlo/Celligenll5 型；循环水机北京长流科学仪器公司DX-208型；空气压缩机北京豪福机电技术开发应用有限公司HF-6100C型；分光光度计上海精密科学仪器有限公司721N型；显微镜0LYMPUSCX31 型；超净台苏净安泰SW-CJ-2FD型；生化培养箱上海博讯实业有限公司医疗设备厂SPX-250B-Z型酵母膏、牛肉粉、胰蛋白胨购自北京奥博星生物技术责任有限公司，其他试剂均购自北京化学试剂公司。实施例1发酵培养基的配制及发酵比较1、唾液乳杆菌高密度发酵培养基组分及其含量为葡萄糖20g/L、胰蛋白胨:10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、K2HPO4:2g/L、 CH3COONa :5g/L、柠檬酸钠:2g/L、MgSO4 :0. 2g/L, FeSO4 :0. lg/L、MnSO4 :55mg/L。
2、培养基配制方法(1)按上述含量分别称取各组分，用蒸馏水溶解，其中葡萄糖单独溶解；(2)葡萄糖115°C单独灭菌20分钟，其他组分装入发酵罐中121°C灭菌20分钟；(3)接种前通过无菌操作将葡萄糖加入发酵罐中，搅拌混勻，即得。3、高密度发酵与现有技术发酵的比较3. 1高密度发酵主要步骤如下(1)将冷冻保存的唾液乳杆菌(ATCC11741)在MRS琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于深层MRS液体试管，37°C培养10小时后，以1 %接种量转接于MRS液体培养基，培养 10小时后作为种子液；(2)配制发酵培养基，培养基降至所需温度时，接上溶氧电极，标定溶氧为100% ；(3)以5%的接种量将步骤(1)所得的种子液接种于步骤O)的发酵培养基中；(4)发酵，发酵过程中维持发酵液pH值为5. 0，当pH超过5. 0时，补加50%葡萄糖液约IOOml ；当pH低于5. 0时，自动流加碱性中和剂氨水；在温度37°C、转速50rpm条件下发酵10小时，发酵过程不通气，维持溶氧小于；(5)当补加50%葡萄糖液pH不再降低时，终止发酵，即得唾液乳杆菌活菌数达 1.2X1010cfu/ml 的发酵液。3. 2对照实验(1)唾液乳杆菌发酵培养基(MRS培养基)其组分与含量为葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L、酵母粉4g/L、K2HPO4:2g/L、 CH3COONa :5g/L、柠檬酸钠:2g/L、MgSO4 :0. 2g/L、MnSO4 :50mg/L、吐温 80 1ml。(2)发酵将冷冻保存的唾液乳杆菌(ATCC11741)在MRS琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于深层MRS液体试管，37°C培养10小时后。以接种量转接于MRS液体培养基，培养 10小时后作为种子液，以10%接种量接种发酵培养基。37°C静置培养10小时，终止发酵， 得到唾液乳杆菌活菌数为5. lX108cfu/mL·3. 3结果分析应用本发明的培养基及其发酵方法，可以得到唾液乳杆菌活菌数达1. 2X IO10Cfu/ ml的发酵液，而应用现行发酵培养基(MRS培养基)及其发酵方法，得到的唾液乳杆菌活菌数仅为5. lX108cfu/mL·实验证明本发明的培养基及其发酵方法得到的唾液乳杆菌活菌数为现有技术的近M倍，实现了唾液乳杆菌的高密度发酵。实施例2发酵培养基的配制及发酵比较1、唾液乳杆菌高密度发酵培养基其组分与含量为葡萄糖25g/L、胰蛋白胨10g/L、牛肉粉15g/L、酵母粉10g/L、K2HPO4:2g/L、 CH3COONa :7g/L、柠檬酸钠:3g/L、MgCl2 :0. 2g/L、Fe Cl2 :0. lg/L、MnSO4 :50mg/L。2、培养基配制方法(1)按含量分别称取各组分，用蒸馏水溶解，其中葡萄糖单独溶解；(2)葡萄糖10磅单独灭菌20分钟，其他组分装入发酵罐中15磅灭菌20分钟；(3)接种前通过无菌操作将葡萄糖加入发酵罐中，搅拌混勻，即得。3、高密度发酵与现有技术发酵的比较
3. 1高密度发酵主要步骤如下(1)将冷冻保存的唾液乳杆菌(ATCC11741)在MRS琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于深层MRS液体试管，37°C培养10小时后，以1 %接种量转接于MRS液体培养基，培养 8小时后作为种子液；(2)配制发酵培养基，培养基降至所需温度时，接上溶氧电极，标定溶氧为100% ；(3)以5%的接种量将步骤(1)所得的种子液接种于步骤O)的发酵培养基中；(4)发酵，发酵过程中维持发酵液pH值为5.3，当pH超过设定值时，补加50%葡萄糖液约IOOml ；当pH低于设定值时，自动流加碱性中和剂氨水；在温度38°C、转速50rpm条件下发酵12小时，发酵过程不通气，维持溶氧小于；(5)当补加50%葡萄糖液发酵液0D_不再增加时，终止发酵，即得唾液乳杆菌活菌数达2. 6X 101(lCfU/ml的发酵液。3. 2对照实验(1)唾液乳杆菌发酵培养基(MRS培养基)其组分与含量为葡萄糖:20g/L、蛋白胨:10g/L、牛肉粉5g/L、酵母粉4g/L、K2HPO4:2g/L、 CH3COONa :5g/L、柠檬酸钠:2g/L、MgSO4 :0. 2g/L、MnSO4 :50mg/L、吐温 80 1ml。(2)发酵将冷冻保存的唾液乳杆菌(ATCC11741)在MRS琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于深层MRS液体试管，37°C培养10小时后。以接种量转接于MRS液体培养基，培养 10小时后作为种子液，以10%接种量接种发酵培养基。38°C静置培养12小时，终止发酵， 得到所述唾液乳杆菌活菌数为6. OX IO8CfVml。3. 3结果分析应用本发明的培养基及其发酵方法，可以得到唾液乳杆菌活菌数达2. 6 X IO10Cfu/ ml的发酵液，而应用现行发酵培养基(MRS培养基)及其发酵方法，得到的唾液乳杆菌活菌数仅为6X 108CfU/ml。实验证明本发明的培养基及其发酵方法得到的唾液乳杆菌活菌数为现有技术的近44倍，实现了唾液乳杆菌的高密度发酵。实施例3发酵培养基的配制及发酵比较1、唾液乳杆菌高密度发酵培养基其组分与含量为葡萄糖30g/L、胰蛋白胨15g/L、牛肉膏6g/L、酵母粉6g/L、K2HPO4:3g/L、 CH3COONa :8g/L、柠檬酸钠4g/L、(NH4)2Fe(SO4)2 :0. 2g/L、MgSO4 :0. 4g/L、MnSO4 :45mg/L。2、培养基配制方法(1)按含量分别称取各组分，用蒸馏水溶解，其中葡萄糖单独溶解；(2)葡萄糖115°C单独灭菌20分钟，其他组分装入发酵罐中121°C灭菌20分钟；(3)接种前通过无菌操作将葡萄糖加入发酵罐中，搅拌混勻，即得。3、高密度发酵与现有技术发酵的比较3. 1高密度发酵主要步骤如下(1)将冷冻保存的唾液乳杆菌(ATCC11741)在MRS琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于深层MRS液体试管，37°C培养10小时后，以1 %接种量转接于MRS液体培养基，培养 10小时后作为种子液；(2)配制发酵培养基，培养基降至所需温度时，接上溶氧电极，标定溶氧为100% ；
(3)以10%的接种量将步骤⑴所得的种子液接种于步骤(2)的发酵培养基中；(4)发酵，发酵过程中维持发酵液pH值为5.5，当pH超过设定值时，补加50%葡萄糖液约IOOml ；当pH低于设定值时，自动流加碱性中和剂氨水；在温度39°C、转速50rpm条件下发酵14小时，发酵过程通入氮气，维持溶氧小于；(5)当补加50%葡萄糖液pH不再降低时，终止发酵，即得唾液乳杆菌活菌数达 3. 1 X 1010cfu/ml 的发酵液。3. 2对照实验(1)唾液乳杆菌发酵培养基(MRS培养基)其组分为葡萄糖:20g/L、蛋白胨:10g/L、牛肉膏5g/L、酵母粉4g/L、K2HPO4:2g/L、 CH3COONa :5g/L、柠檬酸钠:2g/L、MgSO4 :0. 2g/L、MnSO4 :50mg/L、吐温 80 1ml。(2)发酵将冷冻保存的唾液乳杆菌(ATCC11741)在MRS琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于深层MRS液体试管，37°C培养10小时后。以接种量转接于MRS液体培养基，培养 10小时后作为种子液，以10%接种量接种发酵培养基。39°C静置培养14小时，终止发酵， 得到所述唾液、乳杆菌活菌数为4. 8X 108cfu/ml。3. 3结果分析应用本发明的培养基及其发酵方法，可以得到唾液乳杆菌活菌数达3. IxiO10Cfu/ ml的发酵液，而应用现行发酵培养基(MRS培养基)及其发酵方法，得到的唾液乳杆菌活菌数仅为4. 8X 108CfU/ml。实验证明本发明的培养基及其发酵方法得到的唾液乳杆菌活菌数为现有技术的近65倍，实现了唾液乳杆菌的高密度发酵。生产中，高密度发酵的实现可以减小生物量的分离费用，缩短生产周期，降低生产成本、提高生产效率等，这在高效节能的当代社会具有极其重要的意义。
权利要求
1.一种饲用乳酸菌高密度发酵培养基，所述的乳酸菌为唾液乳杆菌(LactcAacillus salivarius)，高密度发酵培养基的主要组分及其含量如下葡萄糖20 30g/L、胰蛋白胨 10 15g/L、牛肉膏或牛肉粉6 15g/L、酵母粉5 10g/L、K2HPO4 2 3g/L、CH3COONa 5 8g/L、柠檬酸钠2 4g/L、Mg2+水溶性化合物0. 2 0. 4g/L,Fe2+水溶性化合物0. 1 0. 2g/L和Mn2+水溶性化合物45 55mg/L。
2.权1所述的饲用乳酸菌高密度发酵培养基，其特征在于所述的Mg2+水溶性化合物为 MgSO4^MgCl2中的任一种；所述的1 2+水溶性化合物为i^eS04、i^eCl2、、(NH4) Je (504)2中的任一种；所述的Mn2+水溶性化合物为MnS04。
3.权1或权2所述的饲用乳酸菌高密度发酵培养基，其特征在于发酵培养基的配制方法如下(1)按含量分别称取各组分，用蒸馏水溶解，其中葡萄糖单独溶解；(2)葡萄糖115°C单独灭菌20分钟，其他组分装入发酵罐中121°C灭菌20分钟；(3)接种前通过无菌操作将葡萄糖加入发酵罐中，搅拌混勻，即得。
4.如权1、2或3任一项所述的饲用乳酸菌高密度发酵培养基的发酵方法，其特征在于主要步骤如下(1)将冷冻保存的唾液乳杆菌在MRS琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于深层MRS液体试管，37°C培养10小时后，以1 %接种量转接于MRS液体培养基，培养8 10小时后作为种子液；(2)配制发酵培养基，培养基降至所需温度时，接上溶氧电极，标定溶氧为100%；(3)以5% 10%的接种量将步骤(1)所得的种子液接种于步骤( 的发酵培养基中；(4)发酵，发酵过程中维持发酵液pH值为5.0 5. 5，当pH超过设定值时，补加50 % 葡萄糖液；当PH低于设定值时，自动流加碱性中和剂氨水、KOH、NaOH中的任一种；在温度 37 39°C、转速50rpm条件下发酵10 14小时，发酵过程不通气或通入队，维持溶氧小于 1% ；(5)当补加50%葡萄糖液pH不再降低或发酵液在600nm波长下的吸光值不再增加时， 终止发酵，即得唾液乳杆菌活菌数达KTcfu/ml以上的发酵液。
全文摘要
本发明属于乳酸菌培养技术领域，涉及一种饲用乳酸菌高密度发酵培养基及其发酵方法。本发明采用pH反馈控制补加葡萄糖策略，同时降低发酵液中乳酸的浓度，从而解除乳酸的反馈抑制作用，使用本发明的高密度发酵培养基及其发酵方法发酵的唾液乳杆菌，菌体密度较普通发酵显著提高，活菌数不低于1010cfu/ml，较普通MRS培养基培养活菌数提高50倍以上，实现了唾液乳杆菌的高密度发酵；从而可以减小生物量的分离费用，缩短生产周期，降低生产成本、提高生产效率。
文档编号C12R1/225GK102226156SQ20111011655
公开日2011年10月26日 申请日期2011年5月6日 优先权日2011年5月6日
发明者孙晓雯, 张军, 杨欣, 汪攀, 王安如, 闫轶洁 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司, 北京科高大北农饲料有限责任公司