专利名称：一种耐糖皮质激素人淋巴瘤细胞系的利记博彩app
技术领域：
本发明属微生物动物细胞系领域，具体涉及一种具有耐糖皮质激素潜能的人淋巴瘤细胞系。
背景技术：
根据卫生部公布的第三次全国居民死亡原因调查结果显示恶性肿瘤成为中国城市居民首位死因。恶性肿瘤已经严重威胁人们的生命。近年来，非霍奇金淋巴瘤发病率也逐年提高。美国肿瘤调查数据显示09年非霍奇金淋巴瘤新增病例65980例，在女性肿瘤发病率上升至第5位。国内的统计资料与国外大体相似。弥漫大B细胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤最常见的类型之一，具有侵袭性，占非霍奇金淋巴瘤的30%-40%。尽管以⑶2。单抗为代表的生物免疫靶向治疗应用使得弥漫大B细胞淋巴瘤的总生存率明显提高，但仍有超过半数的患者出现复发或耐药。现对于弥漫大B细胞淋巴瘤耐药的机制尚未明确。目前认为， 化疗是通过诱导细胞凋亡来发挥其疗效,而弥漫大B细胞淋巴瘤肿瘤细胞的内源性凋亡抵抗是影响化疗敏感性的重要机制之一。CHOP方案作为弥漫大B细胞淋巴瘤的标准治疗方案，其中重要组成成分糖皮质激素具有诱导淋巴细胞凋亡的作用。糖皮质激素通过与细胞内的糖皮质激素受体结合，激活细胞内一系列的细胞信号通路，最终在细胞核内反式作用于目的基因，调控基因转录水平，从而发挥诱导凋亡的作用。一些临床研究发现，在某些造血系统肿瘤中，对于糖皮质激素的初治反应是评价预后众多指标之一。某些血液系统肿瘤患者存在对糖皮质激素原发性或继发性不敏感从而影响疗效。因此，研究糖皮质激素耐药的问题引起越来越多的学者关注。但糖皮质激素耐药机制的研究多来自急性淋巴细胞性白血病的体内外实验，关于弥漫大B细胞淋巴瘤与糖皮质激素耐药相互关系的研究甚少。而临床工作中发现不少弥漫大B细胞淋巴瘤患者出现复发或耐药。因此对于弥漫大B细胞淋巴瘤耐药的研究具有实践意义。1974年，Sibley等最早从小鼠淋巴瘤糖皮质激素敏感株S49中分离了淋系细胞来源的耐糖皮质激素细胞系，之后CEM-7、WEHI-7等耐糖皮质激素细胞系相继建立。这为研究血液系统肿瘤耐糖皮质激素机制提供了实验基础。但针对人弥漫大B细胞淋巴瘤耐糖皮质激素细胞系尚未见报道，淋巴瘤糖皮质激素耐药的研究缺少良好的实验平台。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有耐糖皮质激素潜能的人淋巴瘤细胞系。本发明提供了一种人弥漫大B细胞淋巴瘤耐糖皮质激素细胞株，在本发明中称为Toledo/DEX。所述细胞株对地塞米松的耐药倍数高于源细胞。所述的源细胞是人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系。本发明的细胞对阿霉素、长春新碱或者环磷酰胺的耐药倍数高于源细胞。本发明的细胞与源细胞的基本特征相似，也有因耐糖皮质激素引起的特征改变。细胞周期分布Gl期占82. 32%，G2期3. 76%，S期13. 92%，G2/G1值为I. 98。该细胞裸鼠成瘤率为25%，潜伏期为31天。该细胞悬浮生长，呈圆形或椭圆形，体积较正常的淋巴细胞大，细胞大小不均一，细胞胞体偏大，形态不规则，核/浆比例增高，胞浆淡蓝色，浆内见空泡，核不规则，可见多个核仁及核裂；电镜下可见局部可见片层状突起，有细长微绒毛。该细胞流式分析细胞免疫表型为⑶3'⑶5'⑶7_、⑶1Q+、ra19+、⑶79ノ、⑶2。+、⑶‘、⑶‘、⑶‘、CD22'该细胞的该细胞的糖皮质激素受体GR a表达量高于源细胞。本发明的细胞株还具有以下生物学特性该细胞株体外培养生长良好，每2-3天传代一次；细胞倍增时间是倍增时间为37. 10±2. 56小时；染色体数目为50，染色体变异与源细胞基本相同，但有个别细胞有差异，存在I或4或7或10号染色体异常，但均未形成两个相关的克隆。较源细胞系Gl期细胞增多，而S期和G2期细胞減少；裸鼠成瘤率为25%，潜伏期为31天，源细胞成瘤率为0% ；CCK-8法检测细胞对DEX (地塞米松)、ADM (阿霉素)、VCR (长春新碱)和CTX (环磷酰胺)耐药性均有所提高;Western Blot检测GR a、GR @蛋白(糖皮质激素受体)的表达，进行灰度分析表明!'016(10/1^乂细胞系61^表达下调，且随着耐药倍数的增高而下降，同时GRP表达上调，且随着耐药倍数的增高而明显上升。所述的源细胞人弥漫大B细胞淋巴瘤Toledo细胞株来源于名女性弥漫大B细胞 淋巴瘤患者的外周血，该患者经大剂量的化疗及骨髄造血干细胞移植治疗后出现脑部转移，属典型的难治性淋巴瘤病例，建株于1990年，ATCC号CRL-2631，由复旦大学附属华山医院血液科引进并保存。本发明采用长期间歇小剂量糖皮质激素递增诱导法诱导制得耐糖皮质激素人淋巴瘤细胞株Toledo/DEX，已于2011年3月4号保藏，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)Jii :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号=CGMCC No. 4620，分类命名人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株。本发明提供了所述的细胞株的制备方法，即采用长期间歇小剂量糖皮质激素递增诱导法诱导耐药细胞。未述及之处可以采用常规操作方法。本发明借鉴体外诱导化疗药物耐药细胞的方法，采用长期间歇小剂量糖皮质激素递增诱导法培养Toledo的糖皮质激素耐药细胞系Toledo/DEX。Toledo/DEX细胞最终可在含DEX I. 024X KT5M的浓度中稳定生长。本发明采用下述步骤采用长期间歇小剂量糖皮质激素递增诱导法诱导耐药细胞。取对数生长期Toledo细胞(I X 106/ml)接种于25cm2培养瓶，加入含DEX起始浓度为I X KT8M的RPMI1640+10%新生牛血清的培养液，置于37°C、5%C02、饱和湿度的ニ氧化碳培养箱内培养96小时(第48 h时用含相同浓度DEX的完全培养基换液一次)，后用37°C的RPMI1640液洗2次，加入不含药物的培养液，待细胞増殖再次进入对数生长期，提高DEX浓度I倍。如此逐步增加药物浓度，培养6个月。本发明的细胞株可以用于糖皮质激素耐药性的研究。本发明经实验表明，可在含DEX I. 024X 10_5M的浓度中稳定生长，对于DEX (地塞米松)的耐药性提高了 1227倍。
本发明经过6个月的培养，成功建立了对糖皮质激素耐药指数为1227倍的人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系Toledo/DEX。经实验表明，本发明的Toledo/DEX细胞可在含DEX1.024X10_5M的浓度中稳定生长，对于DEX的耐药性提高了 1227倍，是国内外首例具有耐糖皮质激素潜能的人弥漫大B细胞淋巴瘤耐糖皮质激素细胞系。为研究弥漫大B细胞淋巴瘤复发/耐药的机制和逆转策略提供了ー个新的实验研究平台。本发明的人淋巴瘤细胞系能为淋巴瘤耐糖皮质激素机制及逆转糖皮质激素耐药药物筛选的研究建立良好的实验平台。
图I. Toledo/DEX透射电镜下的超微结构。可见,Toledo/DEX呈圆形或椭圆形,体积较正常的淋巴细胞大，细胞大小不均一，细胞胞体偏大，形态不规则，核/浆比例增高，胞浆淡蓝色，浆内见空泡。核不规则，可见多个核仁及核裂，电镜下可见局部可见片层状突起，有细长微绒毛。图2. Toledo/DEX细胞的裸鼠致瘤性，致瘤侧种植Toledo/DEX细胞，未致瘤侧种植源细胞。图3Toledo/DEX细胞的细胞周期分析。
具体实施例方式实施例I Toledo/DEX细胞的建立
本发明采用人弥漫大B细胞淋巴瘤Toledo细胞株作为源细胞，所述的人弥漫大B细胞淋巴瘤ToIedo细胞株来源于名女性弥漫大B细胞淋巴瘤患者的外周血，该患者经大剂量的化疗及骨髄造血干细胞移植治疗后出现脑部转移，属典型的难治性淋巴瘤病例，建株于1990年，ATCC号CRL-2631，由复旦大学附属华山医院血液科引进并保存。本发明采用长期间歇小剂量糖皮质激素递增诱导法诱导制得耐糖皮质激素人淋巴瘤细胞株Toledo/DEX，已于2011年3月4号保藏，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)Jii :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No. 4620，分类命名人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株。本发明采用长期间歇小剂量糖皮质激素递增诱导法培养Toledo的糖皮质激素耐药细胞系Toledo/DEX。步骤如下采用长期间歇小剂量糖皮质激素递增诱导法诱导耐药细胞。取对数生长期Toledo细胞(IX 106/ml)接种于25cm2培养瓶，加入含DEX起始浓度为I X KT8M的RPMI1640+10%新生牛血清的培养液，置于37°C、5%C02、饱和湿度的ニ氧化碳培养箱内培养96小时(第48 h时用含相同浓度DEX的完全培养基换液一次)，后用37°C的RPMI1640液洗2次，加入不含药物的培养液，待细胞増殖再次进入对数生长期，提高DEX浓度I倍。如此逐步増加药物浓度，培养6个月。经过6个月的培养，成功建立了对糖皮质激素耐药指数为1227倍的人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系Toledo/DEX。本细胞株具有以下生物学特性该细胞株体外培养生长良好,姆2-3天传代一次；Toledo/DEX悬浮生长,呈圆形或椭圆形,体积较正常的淋巴细胞大，细胞大小不均一，细胞胞体偏大，形态不规则，核/浆比例增高，胞浆淡蓝色，浆内见空泡。核不规则，可见多个核仁及核裂，电镜下可见局部可见片层状突起，有细长微绒毛；细胞倍增时间是倍增时间为37. 10±2. 56小时；染色体数目为50，染色体变异与源细胞基本相同，但有个别细胞有差异，存在I或4或7或10号染色体异常，但均未形成两个相关的克隆。流式分析细胞免疫表型为cd2_、⑶3_、ra5_、⑶7_、⑶1Q+、ra19+、⑶79ノ、⑶2。+、⑶‘、⑶‘、⑶‘、CD22-与源细胞一致。PI检测细胞周期分布Gl期占82. 32%，G2期3. 76%，S期13. 92%，G2/Gl值为I. 98，较源细胞系Gl期细胞增多，而S期和G2期细胞减少；裸鼠成瘤率为25%，潜伏期为31天，源细胞成瘤率为0% ；CCK-8法检测细胞对DEX、ADM、VCR和CTX耐药性均有所提高(如表一);Western Blot检测GRa、GRP蛋白的表达，进行灰度分析表明Toledo/DEX细胞系GRa表达下调，且随着耐药倍数的增高而下降，同时GRP表达上调，且随着耐药倍数的增高而明显上升。
实施例2耐药性测试
经实验表明，本发明的Toledo/DEX细胞可在含DEX I. 024X IO^5M的浓度中稳定生长，对于DEX的耐药性提高了 1227倍。表I Toledo/DEX细胞耐药谱分析
权利要求
1.一种人弥漫大B细胞淋巴瘤耐糖皮质激素细胞株，其特征是，所述细胞株为耐糖皮质激素人淋巴瘤细胞株Toledo/DEX，保藏编号CGMCC No. 4620，分类命名人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株；具有以下生物学特性该细胞悬浮生长，呈圆形或椭圆形，体积较正常的淋巴细胞大，细胞大小不均一，细胞胞体偏大，形态不规则，核/浆比例增高，胞浆淡蓝色，浆内见空泡，核不规则，可见多个核仁及核裂；电镜下可见局部可见片层状突起，有细长微绒毛；该细胞细胞周期分布Gl期占82. 32%，G2期3. 76%，S期13. 92%，G2/G1值为I. 98 ;该细胞裸鼠成瘤率为25%,潜伏期为31天。
2.如权利要求I所述的细胞株，其特征是，所述细胞株对地塞米松的耐药倍数高于源细胞；所述的源细胞是人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系。
3.如权利要求I所述的细胞株，其特征是，该细胞对阿霉素、长春新碱或者环磷酰胺的耐药倍数高于源细胞。
4.如权利要求I所述的细胞株，其特征是，该细胞流式分析细胞免疫表型为CD2-、CD3_、CD5_、CD7_、0^0+、CD19+、CD79 a +、CD20+、CD38+、CD16-、CD56-、CD22-。
5.如权利要求I所述的细胞株，其特征是，该细胞的糖皮质激素受体GRa表达量高于源细胞。
6.如权利要求I所述的细胞株，其特征是，所述源细胞的ATCC号为CRL-2631。
7.权利要求I所述的细胞株的制备方法，其特征是，采用长期间歇小剂量糖皮质激素递增诱导法诱导耐药细胞。
8.权利要求I所述的细胞株的应用，其特征是，将所述的细胞用于糖皮质激素耐药性的研究。
全文摘要
本发明属微生物动物细胞系领域，具体涉及一种具有耐糖皮质激素潜能的人弥漫大B细胞淋巴瘤耐糖皮质激素细胞系Toledo/DEX。本发明的Toledo/DEX细胞株GRα表达量低于源细胞，且所述细胞株对地塞米松的耐药倍数高于源细胞；所述的源细胞是人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系。该细胞系是国内外首例具有耐糖皮质激素潜能的人弥漫大B细胞淋巴瘤耐糖皮质激素细胞系。本发明表明长期、间歇、小剂量糖皮质激素递增诱导法建立淋巴瘤耐药细胞系的方法是切实可行性，Toledo/DEX细胞系的建立将为后续糖皮质激素耐药机制及逆转的研究提供了一个实验平台。
文档编号C12N5/09GK102766598SQ20111011413
公开日2012年11月7日 申请日期2011年5月4日 优先权日2011年5月4日
发明者许小平, 谭微, 陈波斌, 韩天洁, 马燕 申请人:复旦大学附属华山医院