专利名称：水稻颖壳形态建成调控基因tri1及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种利用图位克隆技术克隆水稻TRIl (Triangle Hull 1)基因，以及利用转基因互补实验鉴定该基因的功能；同时还涉及利用该基因产物对水稻颖壳形状进行调控，用做形态标记或者提高产量等应用。
背景技术：
水稻花器官的发育结果直接影响稻谷产量和稻米品质，而且水稻是单子叶植物发育分子生物学研究的模式植物，近年来有关水稻花发育基因调控的研究已取得了长足的进展，通过突变体获得了一系列与水稻花发育相关的基因。因此，利用水稻颖花突变体研究单子叶植物花器官发育的分子调控机制是目前植物分子遗传学的研究热点，并为将来水稻产量的提高打下基础。随着越来越多的水稻花器官突变体的获得和花发育相关的基因被克隆，但是它们与ABC模型中的典型基因并没有同源性，比如水稻无颖壳突变体dhl，它编码一个包含LOB 结构域的蛋白，虽然大部分突变体表现为颖壳缺失，但是还有一些表现为浆片缺失，雄蕊数目异常或者柱头数目异常等等，还有水稻凹陷内颖突变体retared paleal (repl) 0它在花发育的早期只在内颖原基表达，但是到了发育后期，又迅速扩散在雄蕊和内外颖都表达，从而导致内颖发育不良，但并没有完全消失。最近人们通过水稻额外颖突变体克隆了 EXTRA GLUME 1 (EGl)基因，它编码一个可能是脂肪酶的蛋白，并获得了两个等位突变体，它们都表现为有多个颖壳，但是除此之外强突变体中有的单株表现为内部产生额外的颖花，各轮花器官无法分化等性状，通过RT-PCR 和原位杂交发现在穗原基的时候该基因就开始大量表达，一直到花发育成熟。因此简单的 ABC模型已不能完全描述花的发育全过程，这牵涉到许多基因的调控，它们之间通过各种转录因子组成一个复杂的网络，我们只有通过发现这个网络中更多的节点，从而深入了解花发育过程。
发明内容
本发明提供一种能影响水稻颖壳形状的基因及其蛋白质，以及由此获得的转基因植物细胞，和利用所述基因对水稻颖壳进行改造的方法。为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻颖壳形态建成调控基因TRIl编码的蛋白质，其具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。作为本发明的水稻颖壳形态建成调控基因TRIl编码的蛋白质的改进上述氨基酸序列还包括在SEQ ID No :2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。本发明还提供一种编码上述蛋白质的基因一水稻颖壳形态建成调控基因TRI1， 其具有SEQ ID No 1所示的核苷酸序列。作为本发明的水稻颖壳形态建成调控基因TRIl的改进上述核苷酸序列还包括在SEQ ID No :1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因或衍生物。本发明还提供一种包含上述水稻颖壳形态建成调控基因TRIl的质粒。本发明还提供一种包含上述水稻颖壳形态建成调控基因TRIl的植物表达载体。本发明还提供一种包含上述核酸的转基因植物细胞。本发明还提供一种改变水稻颖壳形状的方法，包括用具有SEQ ID No 1所示的核苷酸序列的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。进一步具体说明本发明的目的是提供一种从水稻突变体triangle hull 1中克隆的新基因TRI1，如SEQ ID No :1所示的DNA序列，也包括与SEQ ID No :1所示的DNA序列至少有70%同源性的基因序列。本发明中的SEQ ID No :2所示的蛋白质属于含有DUF640 结构域的表达蛋白，其中进行一个或几个替换，插入或缺失所获得的功能类似物。另外，也包括在SEQ ID No :1中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能达到本发明的目的。本发明的另一个目的是提供一种用TRIl基因进行高效的植物转化的方法，具体地说，本发明提供了具有SEQ ID No :1所示的序列的基因或基因部分片段的载体，其中，如图4所示的pCAMBIA1300+promoter+TRIl+nos，该载体可以表达有上述核苷酸序列编码的多肽或其同源类似物。本发明还提供了一种利用植物表达载体转化植物细胞影响水稻颖壳形状的方法。 具体地是利用植物表达载体转化植物细胞以影响农作物颖壳形状的方法。实现本发明的具体技术步骤如下一、水稻颖壳突变体tril的分离和遗传分析本发明的水稻颖壳突变体tril来自EMS处理粳稻品种日本晴导致的突变。通过与野生型水稻的正反交实验，证明该突变体受隐性单基因控制，如图1所示。二、图位克隆控制水稻颖壳形状的TRIl基因1、TRIl基因的初步定位为了分离TRIl基因，本发明首先组建了两个定位群体，由tril分别与籼稻品种南京6号和明恢63 (Indica)杂交组配成两个F2定位群体，再通过图位克隆的方法，利用STS、 SSR等分子标记对TRIl位点进行初步定位，将其初步定位在第2号染色体的长臂上，并介于 RM5607和RM6312两SSR标记之间，见图2。2), TRIl基因的精细定位通过对RM5607和RM6312两个标记之间的BAC序列分析，发展新的SSR、STS标记将TRIl精确定位于BAC号为AP004081和AP005303之间重叠的区段上LT1-2和LT1-8标记之间23kb范围之内，并且与分子标记LT1-6共分离(图3)，通过分析此区段开放阅读框 (ORF)推测候选基因。3)、TRIl基因的鉴定和功能分析通过转基因技术，结果表明本发明获得了使突变体恢复正常表型的转基因水稻 (图5)，证明了本发明正确克隆了 TRIl基因，氨基酸序列分析表明TRIl编码一个含有 DUF640结构域的表达蛋白。综上所述，本发明利用水稻三角颖突变体，通过图位克隆技术首次在水稻中克隆到了 TRI1基因，该基因编码一含有DUF640结构域的表达蛋白，在水稻中控制了颖壳形状以及穗颈节长度。通过对TRIl基因的功能解读，再通过梳理其上下游基因的关系，那么将为进一步探索单子叶植物花发育的分子调控机理打下基础。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1是水稻三角颖突变体tril与野生型材料的表型；在图1的下图中第一、二列为野生型日本晴的颖壳；第第三、四列为突变体的颖壳；图2是TRIl基因在水稻第2染色体上的初步定位图；图3是TRIl基因的精细定位图；图 4 是 pCAMBIA1300+TRIl 载体图谱；图5是功能互补实验Ttl转基因水稻植株颖壳的表型。
具体实施例方式实施例1 1、水稻材料水稻(Oryza sativa L.)颖壳突变体tril (triangle hull 1)，原始野生材料为粳稻品种“日本晴”。其等位突变体为粳稻品种“中花11”。上述水稻颖壳突变体tril是来自EMS处理粳稻品种日本晴导致的突变。其表型如图1所示。2、分析和定位群体纯合的tril突变体分别和正常表型品种明恢63以及南京6号进行杂交，F1代自交，得到F2群体，并从中选出一共1204株tril突变体表型的个体作为定位群体。在抽穗期每株取1克左右的嫩叶，用来提取总DNA。该基因是隐性突变，因此在F2群体中会按照1 3的比例分离，其中正常野生型表型的占3/4，突变体表型的占1/4，我们选择了突变体表型的单株作为定位群体。3、SSR和STS标记定位TRIl基因采用水稻微量DNA的快速提取方法从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组 DNA0具体如下取大约0. 2g水稻叶片，经液氮冷冻，在直径5cm的小研钵中磨成粉状，转移到1. 5ml离心管里提取DNA，获得的DNA沉淀溶解于200 μ 1超纯水中作为DNA样品。每一个PCR反应用2μ 1 DNA样品。TRIl基因的初步定位在tril与明恢63组合的F2群体中选取60个隐性个体， 组成的小群体进行SSR分析，根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选取近似均勻分布于各条染色体上的SSR引物，根据已知的反应条件进行PCR扩增，经4%琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙啶(EB)染色，检测PCR产物的多态性，将TRIl初步定位在第2号染色体长臂RM5607和RM6312标记之间，见图2。PCR反应体系的组成为
权利要求
1.水稻颖壳形态建成调控基因TRIl编码的蛋白质，其特征在于该蛋白质具有SEQ IDNo 2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的水稻颖壳形态建成调控基因TRIl编码的蛋白质，其特征在于所述氨基酸序列还包括在SEQ ID No :2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。
3.水稻颖壳形态建成调控基因TRI1，其特征在于该基因具有SEQID No :1所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的水稻颖壳形态建成调控基因TRI1，其特征在于所述核苷酸序列还包括在SEQ ID No :1所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。
5.一种含有权利要求3或4所述的水稻颖壳形态建成调控基因TRIl的质粒。
6.一种含有权利要求3或4所述的水稻颖壳形态建成调控基因TRIl的植物表达载体。
7.一种宿主细胞，其特征在于该宿主细胞含有权利要求3或4所述的水稻颖壳形态建成调控基因TRIl序列。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于该宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。
9.一种改变水稻颖壳形状的方法，其特征在于包括用具有SEQ ID No :1所示的核苷酸序列的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。
全文摘要
本发明公开了一种水稻颖壳形态建成调控基因TRI1编码的蛋白质，该蛋白质具有SEQIDNo2所示的氨基酸序列。本发明还同时公开了一种水稻颖壳形态建成调控基因TRI1，该基因具有SEQIDNo1所示的核苷酸序列。本发明还同时公开了一种改变水稻颖壳形状的方法，包括用具有SEQIDNo1所示的核苷酸序列的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。利用本发明的基因能对水稻颖壳进行改造。
文档编号C12N15/29GK102219840SQ20111010365
公开日2011年10月19日 申请日期2011年4月25日 优先权日2011年4月25日
发明者刘坚, 张光恒, 曾大力, 朱丽, 李峰, 胡江, 董国军, 薛永彪, 郭龙彪, 钱前, 颜美仙, 高振宇 申请人:中国水稻研究所