专利名称：双温快循环荧光定量pcr端粒酶活性的检测方法和试剂盒的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种双温快循环荧光定量PCR端粒酶活性的检测方法和试剂盒。该方法应用锚定发夹引物(Anchored hairpin structural primer, ΑΗΡ)及复合式蝎形引物 (Duplex scorpion primer，DS)，在荧光定量PCR仪上，采用双温快循环PCR扩增条件，进行端粒酶活性的检测。即为用DS/AHP-TRAP(锚定发夹引物及复合式蝎形引物-端粒重复序列扩增分析法)检测端粒酶活性的试剂盒。
背景技术：
端粒酶(Telomerase)是广谱肿瘤标志物，它在近90 %的癌症中都有高频率的表达，而良性、癌前病变以及癌周围的组织中，一般无表达。端粒酶活性的测定具有直接性、高敏感性和强特异性，可作为一个独立的恶性肿瘤早期诊断、治疗监测和预后判断的指标。而且作为分子诊断手段，端粒酶活性检测明显优于肿瘤临床病理分期、组织学分型或细胞分化程度等现有细胞学诊断技术。它尤其对筛查或诊断无症状的早期癌症，具有特殊的价值； 对于那些形态学上良恶性难以鉴别的肿瘤，是判断肿瘤恶性程度有用的指标；作为肝细胞癌切除术后复发的独立预测指标，可预测肝癌术后转移复发。另一方面，端粒酶也是肿瘤治疗的最佳靶点之一，由于端粒酶在肿瘤细胞与正常体细胞之间的差别，端粒酶抑制剂可减少对机体的毒副作用。因此，抗端粒酶疗法已成为肿瘤治疗的一种新方法。围绕端粒酶抑制剂的研究也在如火如荼地进行着，而端粒酶活性测定则是评价药物的重要指标。总之，端粒酶活性的测定可用于癌症早期诊断、癌症预后、癌症的基因治疗和抗癌药物研发等各个领域。因此，采用现代分子生物学技术，研究开发端粒酶活性检测的新方法，为肿瘤防治提供技术上的保障，加速临床应用的进程，是十分必要的。检测端粒酶活性的标准方法是端粒重复序列扩增分析法(telomeric repeat amplification protocol, TRAP, Kim N. W. , Piatyszek Μ. Α. , Prowse K. R. , Harley C. B., West Μ. D. ,Ho P. L. C.，Coviello G. Μ. ,Wright W. Ε. ,Weinrich S. L.，Shay J. W. ,Science, 1994，266，2011-2015)。该法主要分为三个步骤1)延伸阶段，底物在端粒酶的作用下延伸，其3'-端加入若干TTAGGG的重复序列；2) PCR扩增阶段，端粒酶延伸产物扩增数百万倍以上；3)产物的检测阶段。TRAP法巧妙地将PCR技术应用于端粒酶活性检测中，极大地提高了检测的灵敏度，与常规的PCR扩增不同，TRAP方法检测的不是样本中核酸的量，而是端粒酶活性。 因此在PCR扩增之前，端粒酶首先对底物进行延伸，产生端粒酶延伸产物，随后通过对端粒酶延伸产物的扩增，达到检测端粒酶活性的目的。TRAP法的模板分子——端粒酶延伸产物序列很特殊，由底物序列和多个不等的端粒重复序列组成。因此，在以底物序列为正向引物的TRAP法中，反向引物CX设计为有三个错配碱基的端粒重复序列的互补序列。然而由于端粒酶延伸产物含有多个端粒重复序列，因此，在PCR反应的每一轮循环时，它仍可结合在端粒重复序列的任意部位，甚至在同一时间同一条模板分子上都可能会有多于一个的CX 引物开始延伸。这导致了 TRAP法得到的PCR产物的个数与端粒酶延伸产物不完全一致。从而干扰检测结果。改进PCR反向引物的新方法，如CX-ext、CXa弓丨物、锚定引物ACX、发夹型引物以及双反向引物-TRAP法等，均极大地减少了副产物的生成。其中锚定引物在5'-末端加入了一段与端粒序列无关的锚定序列，使得PCR产物5'-末端被非端粒序列封闭，阻止端粒酶产物在此端的延伸。从而避免了假阳性结果的出现，因而得到广泛的应用。但是该方法在不进行热启动时，会有非特异性产物生成。除此之外，TRAP法尚有许多常规PCR的不足之处，如终点检测结果，因此，劳动强度大、定量不准确、重现性差；同时，在测定PCR扩增产物前须打开反应管，易造成污染。因此，难以满足临床应用的要求。荧光定量PCR技术巧妙地将PCR扩增、荧光探针杂交和光学检测结合于一体，通过微机控制，对PCR每一轮循环进行实时监测，并自动报告分析结果。该技术操作简单、安全、 自动化程度高。不需要PCR后处理，从而从根本上解决了产物污染而导致的假阳性问题。而且特异性、灵敏度和重现性显著提高。同时，由于在PCR扩增的指数期(原始模板以相对固定的指数形式增长)进行定量检测，从而真正在技术上实现了 PCR从定性到定量的飞跃。目前，Intergen公司已推出能量转移引物实时定量检测端粒酶活性的试剂盒 (TRAPeze XL)。但该法无法消除反向引物不确定退火带来的影响，因此，特异性和有效性受到质疑。且试剂盒价格昂贵，检测费用高。另外，有报道将DNA嵌插试剂SYBR Green和 TRAP法结合，用于实时定量检测端粒酶活性。然而，非特异性以及所用试剂的昂贵也是阻碍其走向临床应用的最大绊脚石。本申请人在TRAP法基础上设计了复合式蝎形引物，该引物由两条单标记的寡核苷酸链组成，其中一条为探针引物链(Probe-Primer，PP)，该链在引物序列与探针序列之间用PCR阻断剂(PCR-blocker)连接，以阻止PCR产物沿探针序列延伸；另一条为猝灭探针链 (Quencher Probe, QP)，由标记有猝灭基团的探针互补序列组成，用于猝灭探针引物发出的荧光。复合式蝎形引物具有引物和探针的双重功能。它通过在检测步骤中形成稳定的茎环结构，导致探针引物链与猝灭探针链彻底分离，发出荧光从而实现端粒酶活性的定量分析 (黄艳萍，孔德明，张晓滨，沈含熙，宓怀风，复合式蝎形引物实时定量检测端粒酶延伸产物， 化学学报，2004，62，274-278)。 TRAP由于采用石蜡覆盖的热启动方法，要在PCR反应前进行繁琐的加热和冷却过程，且石蜡层两侧液体的混合在实际操作中也存在着一定的困难，往往达不到预定的效果。 为此本申请人设计出了一类新的发夹型引物(Hairpin structural primer，HP)。该引物 5'-末端具有与3'-端的碱基互补的序列，可在TRAP法开始阶段，处于发夹结构，无法行使引物延伸功能。因此实现了 TRAP检测中PCR热启动的自动化，增加了检测的专一性(黄艳萍，孔德明，柴鼎赓，沈含熙，宓怀风，用凝胶电泳研究发夹型引物基因检测恶性肿瘤预警标志物端粒酶活性，现代仪器，2004，10 41-3)。然而由于TRAP法中PCR的扩增的模板序列为底物序列及多个不等长的端粒重复序列，因此PCR反应不可避免引入非特异性产物，干扰检测结果。因此本申请在已有工作的基础上对HP引物进行了再次的改进，以降低实时检测的背景荧光，增加了 PCR反应的特异性。同时，本申请提供一种以绝对值来表示端粒酶活性的方法(Kim N. W.，Wu F.，Nucleic Acids Res.，1997，25，2595-2597)，从而进一步确保检测结果的准确性。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的双温快循环荧光定量PCR快速检测端粒酶活性的方法和试剂盒，以消除复杂的PCR反应后的检测过程，减少非特异性产物生成，提高检测的灵敏度、特异性和准确性，并可进行大批量样品的同时检测。本发明提供的一种双温快循环荧光定量PCR快速检测端粒酶活性的方法包括如下步骤(1)永生化细胞蛋白提取液及人工合成端粒酶延伸产物定量标准溶液的制备；(2)在荧光定量PCR仪上，将锚式发夹型引物(AHP)与复合式蝎形引物(DS)结合， 组成一个新的DS/AHP-TRAP体系，在双温快循环PCR扩增条件下，完成对细胞样品中端粒酶活性及标准溶液中端粒酶延伸产物的实时定量检测；(3)根据实时扩增曲线，得到两组定量标准曲线，从检测端粒酶活性定量曲线及端粒酶延伸产物定量曲线的吻合图上，得到以人工合成端粒酶延伸产物的总量，即TPG值表示细胞中端粒酶活性的定量方法。所述的锚定发夹型引物为5' -GCGCGGTTAGGGCTTACCCTTACCCTTA CCCTAACC-3’其中，下划线部分为发夹的茎部，中间未划线部分为与靶序列互补的引物序列， 5' _端的未划线部分为锚定序列(见附
图1)。发夹型结构在引物分子内部能形成独特的茎环状的二级结构，发夹型结构可实现 PCR反应的自动热启动，增加了 PCR反应的专一性，减少了非特异性产物的生成；锚定结构是在5'-末端加入了一段与延伸无关的锚定序列，使得PCR产物5'-末端被非端粒序列封闭，阻止端粒酶产物在此端的延伸。选择的复合式蝎形引物为引物探针，包括探针引物(probe-primer，PP)和猝灭探针(quencher probe, QP)两部分，序列分别为PP :FAM-5' -「CCCTAAL-阻断剂-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3 ‘(阻断剂为三个碳原子的碳链，带下划线的为探针序列)Qp 5' -IttagggIs-S‘ -DABCYL所述的双温快循环PCR扩增条件为95°C 0s,45°C 3s，引物延伸在温度转换过程中进行，在30个循环数内完成对样品中端粒酶活性的实时定量检测。所述的人工合成端粒酶延伸产物R6为含有6个端粒重复序列的端粒酶延伸产物， 即5' -AATCCGTCGAGCAGAGTTAG[GGTTAG] 6-3 ‘TPG (total product generated，总生成产物)值代表端粒酶活性反应产生的端粒酶延伸产物的总量。在细胞样品定量标准曲线及人工合成端粒酶延伸产物R6定量标准曲线的吻合图上，假设1个TPG相当于1个永生化细胞拷贝数，得到一个TPG为0. 0058amol 的寡核苷酸R6。本发明提供的双温快循环荧光定量PCR快速检测端粒酶活性的方法的检测步骤如下1.样品的制备1)永生化细胞蛋白提取液l，10，102，103，104/yL的永生化细胞样品；2)阴性对照样品；3)人工合成端粒酶延伸产物R6标准溶液3300，330，33，3. 3，0. 33，0. 033amol/y L 的 R6(1_6)标准溶液。2. DS/AHP-TRAP法反应前的准备1)反应混合液1 X TRAP缓冲液，1. 5mmol/ LMgCl2,各 50 μ mol/L 的 dATP，dTTP, dCTP, dGTP, 0. 21 μ mol/L 的 ΑΗΡ, 2U TaqDNA 聚合酶， 0. 5 μ mol/L的PP链及1. 0 μ mol/L的QP链，2 μ L样品溶液。反应液总体积为25 μ L ;2) DS/ AHP-TRAP法反应条件采用30°C下30min进行端粒酶延伸反应，随后采用94°C Os, 45°C 3s 的双温快循环的方式进行PCR扩增反应。3. DS/AHP-TRAP法的测定1)永生化细胞蛋白提取液实时扩增曲线的测定；2)DS/ AHP-TRAP试剂盒定量工作曲线的确定将人工合成端粒酶延伸产物R6(1_e)标准溶液及一系列细胞样品及按以上条件进行扩增，得到两组扩增曲线。4.数据处理1)永生化细胞蛋白提取液工作曲线在细胞样品扩增曲线上设定荧光阈值，得到不同样品的Ct值。绘制细胞拷贝数IO4 10的范围内的标准曲线；2)DS/ AHP-TRAP试剂盒定量工作曲线及TPG值的确定同法绘制定量标准品R6的工作曲线，并与永生化细胞定量标准曲线作比较。从端粒酶活性定量曲线及端粒酶延伸产物定量曲线的吻合图上，得到以TPG值表示细胞中端粒酶的活性的定量方法。即根据假设1个TPG为1个拷贝数，确定TPG代表的定量标准物R6的量，从而可用TPG值表示细胞中端粒酶的活性。本发明提供的一种双温快循环荧光定量PCR快速检测端粒酶活性的试剂盒包括
权利要求
1.一种双温快循环荧光定量PCR快速检测端粒酶活性的方法，其特征在于它包括如下步骤1)永生化细胞蛋白提取液及人工合成端粒酶延伸产物定量标准溶液的制备；2)在荧光定量PCR仪上，将新型锚式发夹型引物与复合式蝎形引物结合，组成一个新的端粒重复序列扩增分析法体系，在双温快循环PCR扩增条件下，完成对细胞样品中端粒酶活性及标准溶液中端粒酶延伸产物的实时定量检测；3)根据实时扩增曲线，得到两组定量标准曲线，即检测端粒酶活性定量曲线和端粒酶延伸产物定量曲线，在这两组定量标准曲线吻合图上，得到以人工合成端粒酶延伸产物的总量，即TPG值表示细胞中端粒酶活性的定量方法。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的锚定发夹型引物为5' -GCGC GGTTAGGG CTTACCCTTACCCTTA CCCTAACC-3’其中，下划线部分为发夹的茎部，中间未划线部分为与靶序列互补的引物序列， 5'-端的未划线部分为锚定序列；复合式蝎形引物为引物探针，包括探针引物和猝灭探针两部分，序列分别为PP :FAM-5 ‘ -rCCCTAAl,-阻断剂-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3 ‘；阻断剂为三个碳原子的碳链，带下划线的为探针序列QP 5' ITTAGGGlr3' —DABCYL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的双温快循环PCR扩增条件为 94°C0s，45°C 3s，样品中端粒酶活性的实时定量检测可在30个循环数内完成。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的人工合成端粒酶延伸产物为含有6 个端粒重复序列的端粒酶延伸产物R6，即5 ‘ -AATCCGTCGAGCAGAGTTAG[GGTTAG]6_3 ‘。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的用TPG值表示细胞中端粒酶的活性， 是根据假设1个TPG为1个永生化细胞产生的端粒酶延伸产物，确定TPG代表的定量标准物R6的量，即一个TPG为0. 0058amol的R6时，一个TPG相当于一个永生化细胞。
6.一种双温快循环荧光定量PCR快速检测端粒酶活性的方法，其特征在于包括如下步骤1)样品的制备a)永生化细胞蛋白提取液10，102，103，104/yL的永生化细胞样品； b)阴性对照样品；c)人工合成端粒酶延伸产物R6标准溶液3300，330，33，3. 3，0. 33， 0. 033amol/μ L 的 R6(1_6)标准溶液；2)反应液的制备1XTRAP缓冲液，1. 5mmol/L MgCl2，各 50 μ mol/L 的 dATP，dTTP， dCTP, dGTP, 0. 21 μ mol/L 的 ΑΗΡ, 2U Taq DNA 聚合酶，0. 5 μ mol/L 的 PP 链及 1. 0 μ mol/L 的 QP链，2 μ L样品溶液，反应液总体积为25 μ L ；反应条件采用30°C下30min进行端粒酶延伸反应，随后采用94°C 0s,45°C 3s的双温快循环的方式进行PCR扩增反应；3)测定a)永生化细胞蛋白提取液实时扩增曲线的测定；b)试剂盒定量工作曲线的确定将人工合成端粒酶延伸产物R6(1_6)标准溶液及一系列细胞样品及按以上条件进行扩增，得到两组扩增曲线；4)数据处理a)永生化细胞蛋白提取液工作曲线在细胞样品扩增曲线上设定荧光阈值，得到不同样品的Ct值；绘制细胞拷贝数IO4 10的范围内的标准曲线；b)试剂盒定量工作曲线及TPG值的确定同法绘制定量标准品R6的工作曲线，并与永生化细胞定量标准曲线作比较。从端粒酶活性定量曲线及端粒酶延伸产物定量曲线的吻合图上，得到以TPG 值表示细胞中端粒酶的活性的定量方法。
7. —种权利要求1所述的双温快循环荧光定量PCR检测端粒酶活性的试剂盒，其特征在于它包括洗液H印es-KOH 10mmol/L pH 7. 5, MgCl2 1. 5mmol/L, KCl 10mmol/L, DTT lmmol/L ； 细胞裂解液Tris-HCl 10mmol/L pH 7. 5, EGTA lmmol/L, MgCl2 lmmol/L, β-巯基乙醇 5mmol/L，甘油 10%，CHAPS 0. 5%, PMSF 0. lmmol/L ；10XTRAP 缓冲液Tris-HCl 200mmol/L pH = 8. 3, lOmmol/L EGTA, 630mmol/L KCl, 0. 05% Tween-20, lmg/mL BSA ；复合式蝎形引物 PP :FAM"5‘ -rCCCTAAl,-阻断剂-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3‘ PP+QP 阻断剂为三个碳原子的碳链，带下划线的为探针序列， QP 5' ITTAGGGlr3' "DABCYL ；定量标准物 R6 5 ‘ -AATCCGTCGAGCAGAGTTAG [GGTTAG] 6_3 ‘； AHP 5' -GCGC GGTTAGGG CTTACCCTTACCCTTA CCCTAACC-3'；附25mmol/L MgCl2,2. 5mmol/L dNTP 含 dATP，dTTP, dCTP, dGTP 各 2. 5mmol/L,5U/ul Taq DNA聚合酶。
全文摘要
本发明涉及一种双温快循环荧光定量PCR端粒酶活性的检测方法和试剂盒。引物-锚定发夹引物(AHP)与复合式蝎形引物(DS)结合组成DS/AHP-TRAP体系，在双温快循环PCR条件下完成对永生化细胞蛋白提取液中端粒酶活性的检测。它是以含6个端粒重复序列的端粒酶延伸产物R6为定量标准物，绘制检测端粒酶延伸产物定量曲线。通过比较永生化细胞样品及R6的两组定量标准曲线，得到检测端粒酶活性定量曲线及端粒酶延伸产物定量曲线的吻合图。假设1个TPG值为1个永生化细胞产生的端粒酶延伸产物，确定TPG值代表R6的量。本发明的试剂盒可在荧光定量PCR仪上，更简便、更快捷、大批量地完成端粒酶活性的实时检测。在恶性肿瘤早期诊断及抗癌药物筛选方面具有广阔的前景。
文档编号C12Q1/25GK102220418SQ20111010139
公开日2011年10月19日 申请日期2011年4月22日 优先权日2011年4月22日
发明者刘照胜, 汤华, 黄艳萍 申请人:天津医科大学