专利名称：基于西瓜全基因组序列信息开发分析的ssr核心引物组及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及核心引物序列，具体地说是一套基于西瓜基因组序列开发的SSR核心引物序列及其应用，属于生物技术领域。
背景技术：
西瓜作为重要的经济作物，在我国种植业结构调整和促进农民致富增收中发挥着重要作用。当前西瓜生产中种子质量问题比较突出和普遍，种子纯度不够和假种子坑农事件常有发生，同名异物、异物同名的现象十分普遍，严重干扰了种业的健康发展，也是对品种创新与知识产权保护的严重损害。常规的品种审定/鉴定主要以形态学特征为依据，需要对被测试品种在特定生长时期的农艺性状进行考察，鉴定周期较长，而且农艺性状易受环境条件的影响。同时，很多亲缘关系相近的西瓜品种间农艺性状差异较小，甚至只有单一性状的不明显变异；而且西瓜生产中一般要在结瓜后才能判断种子纯度和真实性，周期长达3-4个月，因此单纯依靠品种形态特征进行准确、快速的品种鉴别变得越来越困难。基于DNA多态性的分子标记正逐渐成为分析生物遗传多样性的有力工具，在农作物遗传分析中应用较多的主要有RAPD、ISSR、AFLP等，而这些标记均是采用无基因组序列信息的标记技术，尽管有一定的实用性，但标记随机性强、稳定差。SSR技术具有共显性、重复性好等优点，是目前进行遗传多样性分析、遗传图谱构建等研究的首选标记。但如果将基因组的所有SSR位点对供试种质一一进行分析，需要耗费大量的人力和物力，是不可能实现的。为提高SSR技术的检测效率，玉米、小麦等大田作物采用核心引物进行相关研究。核心引物指均勻覆盖染色体全基因组、多态性、稳定性、重复性等综合特性好、可作为初步研究优先选用的一套引物。由于核心引物相对固定，不同实验室均可使用该套引物进行相关研究。但并非所有SSR引物具有同等检测结果和检测效率，不同引物组合的检测能力差异极大，我们无法准确判断引物组合是否正确地反映参试品种的特异性和遗传多样性。理论上，只有进行每个品种全基因组序列的比较才能正确反映不同品种的特异性。然而，目前多数植物基因组测序计划尚未完成，很难进行序列比较，只能通过反复筛选核心引物组合才能获得理想的试验结果，工作量极大且容易出错。
发明内容
本发明的目的在于提供一套基于西瓜基因组序列开发的SSR核心引物组。本发明的再一目的在于提供上述核心引物组的用途。本发明的第三目的在于提供利用上述核心引物组进行西瓜品种资源遗传多样性评价分析的方法，该方法可靠、迅速，能最大限度准确反映供试材料的遗传亲缘关系。本发明的发明思路为针对上述现有技术的问题，本发明依据西瓜基因组序列开发了一套SSR核心引物序列，可用于西瓜种质资源核酸指纹库构建和遗传背景等研究。在西瓜全基因组测序的基础上，首先依据覆盖整个基因组的303，0194个SNP位点对17份重测序材料进行全景检测分析并绘制系统发育树，由于系统发育树是通过比较17份重测序材料的全基因组序列得到的，因此能正确显示不同测序品种的特异性。以此系统发育树为模版，利用不同SSR引物组合对上述测序品种材料进行遗传多样性分析，并比较分析二者的研究结果，选取与系统发育树结果一致的引物组合作为检测遗传多样性的引物组合，将能迅速获得最大限度准确反映遗传多样性关系的核心引物组合。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案基于西瓜全基因组序列信息开发分析的SSR核心引物组，所述引物组包括核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 1 46所示引物。所述的基于西瓜全基因组序列信息开发分析的SSR核心引物组在西瓜品种遗传多样性分析中的应用。上述的基于西瓜全基因组序列信息开发分析的SSR核心引物组在西瓜品种真伪性鉴别中的应用。上述的基于西瓜全基因组序列信息开发分析的SSR核心引物组在杂种纯度鉴定中的应用。上述的SSR核心引物组进行西瓜品种资源遗传多样性评价分析的方法，所述方法包括如下步骤(1)提取待测西瓜样品基因组DNA ；(2)采用如序列表SEQ ID No. 1 46所示引物进行PCR扩增；(3)将步骤(2)的扩增产物经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法染色，照相并统计结果，某位置若有条带记为‘1’，若无则记为‘0’ ；(4)利用步骤(3)的统计结果进行遗传多样性分析。所述步骤(1)是采用CTAB小量法快速提取待测西瓜样本基因组DNA，步骤为 Iml/管96孔管加入叶片2 3片；加入400ul CTAB缓冲液，在48孔研磨器上研磨；65°C 水浴1小时；4°C冰箱冷却至15°C以下，10 40分钟；加入200ul体积比为24 1，4°C预冷的氯仿/异戊醇，200ul酚，上下混勻5分钟；4500rpm离心30分钟；取上清液300ul，加入预先加好的300ul异丙醇的96深孔板中，在台面上轻轻晃勻；4°C冰箱静止30分钟以上； 4500rpm离心1小时，弃上清夜；自然吹干DNA，让异丙醇挥发干净，彡1小时；加入IOOul的 H2O溶解DNA，_20°C保存备用。所述步骤(2)为所述的引物核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 1 46所示；PCR反应条件是12. 5μ 1的反应体系中含有1. 25μ 1 10父13吐作1~(含]\%2+)，1.(^1 2. 5mMdNTP, IU Taq DNA聚合酶，30ng SSR引物，60ng模板DNA ；反应程序为，94°C预变性5min，然后 940C 15s，55°C 15s，72°C 30s，循环 35 次，72°C延伸 4min 后保存在 10°C条件下。所述步骤(3)扩增产物的检测在PCR扩增产物中加入2 μ 1加样缓冲液，用8% 非变性聚丙烯酰胺凝胶检测。凝胶大小为ISOcmX 120cmX 1mm，电极缓冲液为1 XTBE，每个点样孔加2μ 1样品，180V恒压下电泳约1. Oh。电泳结束，银染法染色。先将胶放入固定液 (450mL H20+50mL无水乙醇+2. 5mL冰醋酸)，在摇床上轻摇6min。固定2次。倒掉固定液， 加入银染液(500ml H20+lg硝酸银)，在摇床上轻摇12min。倒掉银染液，清洗两次。第一次用500ml蒸馏水洗30s ；第二次在500ml蒸馏水中加入120ul硫代硫酸钠洗30s。清洗后， 倒掉蒸馏水加入显色液(500ml H20+7. 5g Na0H+1500ul甲醛)，轻摇至DNA条带显出为止，当条带清晰时，倒掉显影液，加入固定液，固定2分钟。倒掉固定液，用蒸馏水中漂洗5分钟。 照相并统计带型。某位置若有条带记为‘1’，若无则记为‘0’。 所述步骤(4)是使用NTSYS-pc Ver. 2. IOe软件进行基于UPGMA法的聚类分析；使用Picalc 0. 6软件计算各引物的PIC值(多态性信息量)。本发明基于西瓜基因组序列开发一套SSR(Simple Sequence R印eat，SSR)核心引物序列，并使用该套核心引物准确进行西瓜种质资源材料的遗传多样性分析。本发明的有益效果本发明获得的SSR核心引物组合具有最大限度反映西瓜种质材料遗传多样性、多态性高、重复性好，标记稳定可靠，便于统计等优点。利用该套引物进行遗传多样性分析，能最大限度准确反映供试材料的遗传亲缘关系。下面结合附图及最佳实施方式对本发明做进一步说明，以使公众对发明内容有整体和充分的了解，而并非对本发明保护范围的限定。前述部分已经充分公开了本发明可以实施的保护范围，因此凡依照本发明公开内容进行的任何本领域公知的等同替换，均属于对本发明的侵犯。
图1为建立在西瓜全基因组测序SNP信息基础上的17份重测序材料系统发育树；图2为建立在39个SSR指纹数据基础上的17份重测序材料聚类图；图3为依据23个引物组合绘制的17份测序材料亲缘关系图谱；图4为依据11个引物组合绘制的17份测序材料亲缘关系图谱；图5为依据5个引物组合绘制的17份测序材料亲缘关系图谱；图6为相似系数矩阵标准误与SSR位点数关系图谱；图7为依据23个核心引物组合绘制的117份西瓜育种材料亲缘关系图谱。
具体实施例方式实施例1西瓜育种材料遗传多样性研究一、材料和方法1. 1 材料供试材料为17份重测序材料和100份西瓜育种材料。17 份西瓜重测序材料涵盖西瓜的 Citrullus Ianatus 和 Citrullus colocynthis 2 yIv^t Iii,^ Citrullus lanatus var. lanatus>Citrullus lanatus var. citroides 2 yIv^ 种。类型丰富，从无籽到有籽、从黄瓤到红瓤、从小瓜到大瓜，基本涵盖了西瓜主要生态类型与主要农艺性状，尽可能多地体现了种质多样性，具有较高的遗传多样性(表1)。100份西瓜育种材料为亲缘关系明确的育种材料，主要用于调整和验证核心引物。1. 2研究方法1. 2. 1基因组DNA的提取Iml/管96孔管加入离心管盖大小新鲜叶片2_3片；加入400ul CTAB缓冲液，在 48孔研磨器上研磨；65°C水浴1小时；4°C冰箱冷却至15°C以下(约30分钟)；加入200ul 24 :14°C预冷的氯仿/异戊醇，200ul酚，上下混勻5分钟；4500rpm离心30分钟；取上清液300ul，加入预先加好的300ul异丙醇的96深孔板中，在台面上轻轻晃勻；4°C冰箱静止30 分钟以上；4500rpm离心1小时，弃上清夜；自然吹干DNA，让异丙醇挥发干净(彡1小时)； 加入IOOul的H2O溶解DNA，_20°C保存备用。DNA浓度用紫外分光光度计(Shimadzu UV-1201，日本)以0D260值测定，并用 0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。1. 2. 2PCR扩增与产物的检测
12. 5μ 1 的反应体系中含有 1. 25μ 1 10 X buffer (含 Mg2+)，1. 0 μ 1 2. 5mM dNTP, IU Taq DNA 聚合酶，30ng SSR 引物(SEQ ID No. 1 46 所示)，60ng 模板 DNA。TaqDNA 聚合酶及反应缓冲液购自TaKaRa公司。dNTP购自上海Sangon公司。SSR引物由北京奥科生物公司合成。反应程序94°C预变性5min，然后 94°C 15s，55°C 15s，72°C 30s，循环 35 次，72°C 延伸4min后保存在10°C条件下。PCR仪为美国Biorad公司制造的PTC-100。扩增产物的检测在PCR扩增产物中加入2μ 1加样缓冲液，用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶检测。凝胶大小为180cmX 120cmX lmm,电极缓冲液为1 XTBE，每个点样孔加2 μ 1 样品，180V恒压下电泳约1. Oh0电泳结束，银染法染色。先将胶放入固定液(450mL H20+50mL 无水乙醇+2. 5mL冰醋酸)，在摇床上轻摇6min。固定2次。倒掉固定液，加入银染液(500ml H20+lg硝酸银)，在摇床上轻摇12min。倒掉银染液，清洗两次。第一次用500ml蒸馏水洗 30s ；第二次在500ml蒸馏水中加入120ul硫代硫酸钠洗30s。清洗后，倒掉蒸馏水加入显色液(500ml H20+7. 5g Na0H+1500ul甲醛)，轻摇至DNA条带显出为止，当条带清晰时，倒掉显影液，加入固定液，固定2分钟。倒掉固定液，用蒸馏水中漂洗5分钟。照相并统计带型。 某位置若有条带记为‘1’，若无则记为‘0’。1.2. 3核心引物筛选利用重测序材料97103和PI296341-FR获得的重组自交系群体RILltl，本实验室构建了高密度遗传图谱。图谱包含1023个SSR标记，覆盖基因组长度679.8cM。本发明利用17份重测序材料中的4份材料-97103(Citrullus lanatus var. lanatus)、 PI296341_FR(Citrullus lanatus var.citroides)> PI386019(Citrullus colocynthis) 和PI595203 (Citrullus lanatus var. lanatus)对1023个来自遗传图谱的引物进行初步筛选，获得在 Citrullus lanatus 和 Citrullus colocynthis 2 个种之间、Citrullus lanatus var· lanatus禾口 CitrulIus lanatus var. citroidesM^h^ft^lEO ^,S-Citrullus lanatus var. lanatus栽培种和野生种之间有差异的引物。利用2个重测序材料(97103和 Sugarlee，分别属于东亚生态类型和美洲生态类型)对初步筛选引物进行复筛，获得在变种Citrullus lanatus var. lanatus不同生态型间具有多态性的引物。最后以条带清晰、 便于统计，在不同栽培种之间具有多态、且来自不同连锁群作为核心引物的标准，在鉴别17 份重测序材料的基础上，筛选核心引物组合。1. 2. 4数据统计依据西瓜重测序序列中3030194个SNP信息，利用Mega软件绘制17份重测序材料的系统发育树。利用带型统计结果进行遗传多样性分析。使用NTSYS-pc Ver. 2. 10软件进行基于 UPGMA法的聚类分析。使用Picalc 0. 6软件计算各引物的PIC值(多态性信息量)。
表117份重测序材料
权利要求
1.基于西瓜全基因组序列信息开发分析的SSR核心引物组，其特征在于，所述引物组包括核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 1 46所示引物。
2.权利要求1所述的基于西瓜全基因组序列信息开发分析的SSR核心引物组在西瓜品种遗传多样性分析中的应用。
3.权利要求1所述的基于西瓜全基因组序列信息开发分析的SSR核心引物组在西瓜品种真伪性鉴别中的应用。
4.权利要求1所述的基于西瓜全基因组序列信息开发分析的SSR核心引物组在杂种纯度鉴定中的应用。
5.利用权利要求1所述的SSR核心引物组进行西瓜品种资源遗传多样性评价分析的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤(1)提取待测西瓜样品基因组DNA；(2)采用如序列表SEQID No. 1 46所示引物进行PCR扩增；(3)将步骤(2)的扩增产物经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法染色，照相并统计结果，某位置若有条带记为‘1’，若无则记为‘0’ ；(4)利用步骤(3)的统计结果进行遗传多样性分析。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)是采用CTAB小量法快速提取待测西瓜样本基因组DNA，步骤为1ml/管96孔管加入叶片2 3片；加入400ul CTAB 缓冲液，在48孔研磨器上研磨；65°C水浴1小时；4°C冰箱冷却至15°C以下，10 40分钟； 加入200ul体积比为24 1，4°C预冷的氯仿/异戊醇，200ul酚，上下混勻5分钟；4500rpm 离心30分钟；取上清液300ul，加入预先加好的300ul异丙醇的96深孔板中，在台面上轻轻晃勻；4°C冰箱静止30分钟以上；4500rpm离心1小时，弃上清夜；自然吹干DNA，让异丙醇挥发干净，彡1小时；加入IOOul的H2O溶解DNA，_20°C保存备用。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)为所述的引物核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 1 46所示；PCR反应条件是12. 5μ 1的反应体系中含有1.25μ 1 10父1311打61~(含]\%2+)，1.(^1 2. 5mMdNTP, IU Taq DNA 聚合酶，30ng SSR 引物，60ng 模板 DNA;反应程序为，94°C预变性 5min，然后 94°C 15s，55°C 15s，72°C 30s，循环 35 次，72°C延伸4min后保存在10°C条件下。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)是使用NTSYS-pcVer. 2. IOe 软件进行基于UPGMA法的聚类分析；使用Picalc 0. 6软件计算各引物的PIC值。
全文摘要
基于西瓜全基因组序列信息开发分析的SSR核心引物组，所述引物组包括核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1～46所示引物。本发明获得的SSR核心引物组合具有最大限度反映西瓜种质材料遗传多样性、多态性高、重复性好，标记稳定可靠，便于统计等优点。利用该套引物进行遗传多样性分析，能最大限度准确反映供试材料的遗传亲缘关系。
文档编号C12N15/11GK102220315SQ20111009567
公开日2011年10月19日 申请日期2011年4月15日 优先权日2011年4月15日
发明者任毅, 宫国义, 张岩, 张海英, 王慧, 许勇, 郭绍贵 申请人:北京市农林科学院