一种短颈剑线虫的分子鉴定方法

专利名称：一种短颈剑线虫的分子鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种检疫方法，特别涉及一种短颈剑线虫的分子鉴定方法。
背景技术：
2008年10月-2010年2月，对广东省的园林植物进行寄生线虫病害调查，共采集了 512份样品进行线虫分离。根据形态特征、形态测量值及结合分子数据，共鉴定出潜在传毒线虫4属12个种总计在33份样品中发现美洲剑线虫组(ZZMiz^ffl3 americanum group)内群体，在20份样品中发现标明剑线虫(Ζ i/^i卵￠0群体，在27份样品中发现巴西剑线虫(Ζ brasiliense),分别占检测到传毒类线虫群体总数的31. 9%、19. 1%和 12.8%。其中中国新记录种1个腔室剑线虫(Z da 力ers)；中国大陆新记录种1个 克鲁克剑线虫(Z Ar^"/) ;2种传毒线虫胼胝拟毛刺线虫和短颈剑线虫 (Z brevicollum)；其它重要的病原线虫2种标明剑线虫(Z iasi卵e)、雪松毛刺线 ^kCTrichodorus cedarus)；本研究所鉴定的12个种中，克鲁克剑线虫和荔枝长针线虫 Uongidorus litchii) ^^XCroton iiWi腫)上的新记录；肾形拟毛刺线虫和胼胝拟毛刺线虫是灰木莲glanca)上的新记录；短颈剑线虫O brevicollum) 是灰木莲、红背 {Excoecaria cochinchinensis)> 石 Ilf iPhotinia serrulata、、秋枫(Mischofia javanica )和羊蹄甲QBauhinia bIakearm )上的新记录；巴西剑线虫 (Z brasiliense )是梅叶冬青(//ez asprella )、杜英 iMlaeocarpus syl ves tris )禾口火力楠(Mchelia macclurei )上的新记录；标明剑线虫(Z insigne )是黄葛榕、Ficus Fii-e/75·)、木棉{Bombax malabaricumMM 口十楽积才{Koelreuteria bipinnata )禾口散尾奏 (Chrysalidocarpus Iu tescens )上的新记录。胼胝拟毛刺线虫寄主范围广泛，多达100多种。主要危害的农作物和经济作物包括疲菜(Spinacia oleracea )、古月萝卜(Daucus caro )、大豆(Glycine max )、豆 MXPisum sa ti vum ) > 51 ii (vigna sinensis ) > # ^jp (.Lycopersicon esculentum)、畏官 (.Lactuca sa i>a ) > ΞΕ(Zea mays ) > ^ ipyrus pyrifolia ) > ^^ (Prunus ^ersica )、香舊 iMusa spp.)、葡萄(K/ tis Vinifera )、柑橘(CY trus spp.)、梓檬(CY trus linion )、无花果 QFicus carica)、油橄榄(0/ea)等(Decraemer，1995)。在日本，此线虫还可寄生5 种针叶树和26种阔叶树，其中包括日本厚朴(ife卵o/ia obvataXMamiya, 1967 ；Shishida, 1979)。此树隶属于木兰科(Magnoliaceae)，木兰属Ofe卵o/ia Linn\而灰木莲也属于木兰科，应提高对此虫的重视程度。据报道，此线虫能够严重破坏山茶花的根部，在人工控制条件下还能够危害玉米和高粱(5br功腫nil gar e\ Ayala等(1968)报道了在人工控制条件，胼胝拟毛刺线虫能够在取食被病毒侵染的烟草后传播烟草脆裂病毒的加利福尼亚分离物。Weischer等(2000)也报道了在北美此线虫是烟草脆裂病毒的传毒介体。肾形拟毛刺线虫U3, renifer)是Siddiqi在马铃薯、Solanum tuberosum)根部发现的。它的次异名有..Paratrichodorus (Mnidorus)renifer Siddiqi，1Θ74 禾口 renifer Siddiqi，1974。这种线虫在印度、西澳大利亚州、喀麦隆、美国、英国、加拿大、斯洛伐克共和国、巴基斯坦、中国等地分布，可以寄生马铃薯、葡萄、茶(snensis )、狗牙 {Cynodon dactylon )>￠1 {Rhododendron japonicum)>Μ (Semen Trigonellae)> ^1 ilachca sativa)、姜取 ijiedychium coronariums)(Siddiqi, 1974 ； Jana et
al, 1984 ；Cotton et al, 1991 ；Nasira et al, 1994 ；Ye, 1995 ；Kazi et al, 1996 ；谢辉等， 1996 ；Forge et al, 2009)，能够对多种作物造成严重损失，应重视对它的检测防治。雪松毛刺线虫(7cedarus )是 Yookoo (1964 )在日本的柳杉(Cryp tomeria japonica )根部发现的。它的次异名有-.Trichodorus Longistylus, Yokoo，1964 和 Trichodorus kurumeensis, Xokoo, 。这种线虫分布的国家不多，仅在中国、日本、韩国和美国的佛罗里达州报道过。(Yookoo, 1964 ；Mamiya, Y. 1967 ；Baek et al, 1995 ；Xu et al, 1995).该种线虫可以寄生多种植物。在日本，雪松毛刺线虫广泛分布，成为日本森林苗圃中最重要的植物寄生线虫之一。据报道，它可以危害柳杉、日本厚朴、日本落叶松 {Iari χ 1 epto 1印i s)、矫饿We 11 i s sifleasis)等30多种乔木植物。此虫还可以危害大豆、结球甘蓝(^ra1S1Sica oleracea)与大轰(Jtordeum vuIgare )等农作物。在中国，它可以寄生梨、桃、苹果、柿树(历仍/？斤仍kaki、、奄饿QPrunus armeniaca)等果树和福州杉 (Cunninghamia lanceolata ) (Shishida, 1979 ；Lee, 1976 ；Xu et al, 1995)。 Yokoo (1964) 认为雪松毛刺线虫是引起黑松GdZzw1S thunbergii)和雪松ifeoi/ara)短粗根病的病原物。它还可以寄生多种果树，因此对该线虫，生产上需予以高度重视，以便防患于未然。其他各种传毒线虫同样对林业、农业有着不良的影响，同样需要高度重视，以便防患于未然。传统的植物寄生线虫的分类鉴定是以线虫形态学特征，结合形态测量值为主要依据的，对于生理小种或致病型等种下群体的鉴定，则基于对鉴别寄主或寄主植物不同品种的反应型的生物测定法来确定。对于长针科线虫和毛刺科线虫的传统鉴定，主要依据形态学特征结合形态测量值来进行分类。目前，剑线虫属的形态学鉴定主要依据Loof等(1990) 的多歧检索表及其增补(Loof et W，1993，1996)。该多歧检索表根据剑线虫形态特征设置 A-L共12个代码，每个代码对应的形态特征都被分为至少2个选项，研究者按顺序确定全部或者大多数代码对应的选项后即可查到与需鉴定线虫的代码相同或相近的种类，进而进行进一步比较鉴别。关于剑属线虫中的美洲组剑线虫的鉴定，由于存在长期的学术争议而导致状态比较混乱，较具代表性的是Luc等(1998)和Lamberti等(2000)对美洲剑线虫组的定义。这也反映了对于美洲剑线虫的鉴定至今没有令人满意的检索表或者鉴定手段可用， 只能在各个种中寻找与之最相近的原始形态学记录中来鉴定，由此往往引致对鉴定结果的怀疑(武扬，2007)。长针属线虫的形态鉴定主要依据Chen等(1997)的多歧检索表及其增补(Loof et W，1999)来进行初步确认，再结合具体文献材料进一步确认。毛刺科线虫的形态鉴定主要依据Decraemer (1998)的多歧检索表来进行一步步确认定种。这些依据形态学特征所进行的多歧分类和数值分类法，提高了线虫类群鉴定的准确性，但以形态学为基础的分类不能揭示不同类植物寄生线虫在进化过程中的亲缘关系(Blok et a7,1997)0近二十年来，生物技术的迅速发展弥补了传统形态分类技术在线虫分类上存在的局限和不足。同工酶电泳技术、核型分析技术、DNA杂交技术、DNA限制性内切酶图谱、PCR 及其相关技术已逐渐渗透到线虫研究的各个领域，对线虫的系统分类学起了非常重要的作用，为植物线虫的分类鉴定提供了新的、强有力的工具和手段。应用分子生物学技术进行线虫分类的直接目的就是使得鉴别种类容易、准确和快速；鉴定线虫种类分子标记的使用增加了在样品中的鉴定的敏感性，加快了鉴定的速度；这种基于“多聚酶链式反应(PCR)”的分子诊断技术克服了传统的形态学鉴定存在的局限性，缩短了检测时间，提高了检测灵敏度和准确度，漏诊和误诊率明显减少，对于保护我国农林业生产安全、维护生态平衡、保证公共卫生安全以及在解决贸易纠纷、促进对外贸易等方面都具有重要的意义。限制性片段长度多态性(RFLP，restriction fragment length polymorphism) 是最早发展起来的分子标记技术之一。其原理是对特定的DNA片段的限制性内切酶产物进行分析，根据片段的大小不同以及标记片段种类和数量的不同，从而分析在同源序列上产生的DNA片段长度多态性差异。此技术及其从中发展起来的一些变型均包括以下基本步骤DNA的提取、用限制性内切酶酶切DNA、用凝胶电泳分开DNA片段、把DNA片段转移到滤膜上、利用放射性标记的探针显示特定的DNA片段(通过Southern杂交)和分析结果。 二十世纪八九十年代，该方法在植物线虫学中应用较多。如1986年Curran首先用该技术成功区分了 Trichinella和根结线虫(Meloidogyne )；Burrows和Boffey用该技术区分了马铃薯金线虫(67ο力ο /era rostochiensis)及马铃薯白线虫(G. pallida ) ；Bolla等应用RFLP 方法区分了松材线虫(Mursaphelenchus xylophilus )与拟松材线虫(Λ mucrona tus )； Webster等构建了松材线虫的基因文库，从中筛选了来自rDNA的内切酶片段，并正确区分了不同来源的松材线虫与日本和欧洲的拟松材线虫。RFLP标记具有重复性好、稳定性高和共显性遗传等特点。但是，RFLP分析操作过程中涉及了 DNA的提取、酶切、电泳分离、探针的制备和Southern杂交等一系列分子生物学技术，步骤繁杂，工作量大，而且对DNA的需求量很大，检测多态性频率较低，特别是放射性同位素及核酸杂交技术，既不安全又不易自动化。因此很大程度上限制了该项技术的应用，逐渐被其他新型标记所替代。RAPD技术是由Williams等(1990)发明的一种新的分子标记技术，基本原理是利用一系列不同的碱基随机排列的寡聚核苷酸单链作为引物对所研究的基因组DNA进行PCR 扩增，扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离，EB显色或放射性自显影来检测扩增DNA片段的多态性，这些扩增的DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。 RAPD反应引物是随机排列的，无须专门设计，引物较短，可以在对物种没有任何分子生物学研究的情况下，构建基因组的指纹图谱，通过统计分析为物种进化和分类提供DNA水平上的理论依据，对于种、亚种、变种的鉴别与演化关系的研究具有重要意义。Irdani 等(1995)、Braasch 和 BurgermeisteK 1995)、郑经武等(1998)、汪来发等 (2001)用RAPD技术成功的区分了松材线虫与拟松材线虫。此外张路平等(2002)对松材线虫与拟松材线虫的线粒体DNA进行了 RAPD分析，将松材线虫的群体分成日本株系与北美洲株系。Amiri等(2003)应用RAPD技术构建了区分甜菜胞囊线虫Ofeteroifera schachtii)M H. betae的图谱；Carneiro等(2004)利用RAPD技术对来自巴西、美国咖啡上的根结线虫进行遗传学变异分析；Lax等(2004)首次对来自阿根廷的大豆胞囊线虫0 ^/j^i/ ^)进行了 RAPD分析，指出两群体间存在明显的遗传学差异，并分析可能是由于基因漂移或不同管理措施所造成的结果。此外，RAPD标记成功应用于鳞球茎线虫iDi tylenchus dipsaci )、 马铃薯金线虫与白线虫等。RAPD技术是一种优于RFLP技术的DNA分子标记方法，具有效率高、样品用量少、灵敏度高、成本较低和检测容易等优点。但是RAPD技术也存在一些不足，实验的稳定性和重复性差。首先是显性遗传，不能识别杂合子位点，这使得遗传分析相对复杂，在基因定位、 作连锁遗传图时，会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性下降；其次，RAPD 对反应条件相当敏感，无论是模板质量和浓度，单一短引物序列，非特异性扩增，基因组DNA 的复杂性，技术设备等都是导致RAPD技术重复性差的原因。Paran和Micrhlmore (1993)首次提出SCAR标记，该标记是在RAPD标记的基础上发展的。基本步骤先做RAPD分析，然后将RAPD标记片段从凝胶上回收并进行克降和测序，根据RAPD片段的两末端序列设计一对特异引物(一般18-24bps左右)，对基因组DNA 进行PCR扩增，筛选鉴定对应RAPD片段的单一位点。该标记由于所用引物较长及引物序列和模板DNA完全互补，因此可在严格条件下扩增，结果稳定性好，可重复性强，比较属内种间差异能力更强，在基因定位和做图在的应用前景广泛。Zijlstra等利用SCAR标记成功鉴定了南方根结线虫(傲iflco^Hiia)、爪哇根结线虫和花生根结线(#. armaria)虫，而且结果显示所获得的标记能特异性鉴定根结线虫生活史各龄期。扩增片段长度多态性(AFLP)是基于RAPD和RFLP相结合的一种DNA指纹技术。 其原理是利用限制性内切酶消化基因组DNA产生不同大小的DNA片段再进行选择性扩增，使用双链人工接头与基因组DNA的酶切片段相连接作为扩增反应的模板DNA，用含有选择性碱基的引物对模板DNA基因选择性扩增，获得的DNA扩增片段通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测。既具有RFLP标记的专一性、可靠性，又具有RAPD标记的随机性、方便性。由于该标记是通过选用不同的内切酶达到选择性扩增的目的，因此又被称作选择性限制片段扩增标记(Selective restriction fragment amplification, SRFA)，AFLP 是目前在种群遗传多样性研究中应用较广的分子标记技术。Folkertsma等(1996)用AFLP方法对2种马铃薯胞囊线虫的M个群体的遗传多样性进行了分析，可明显将马铃薯金线虫分为 3个不同的致病型。Samblat等对3种根结线虫的15个群体的遗传多样性进行了 AFLP研究，结果表明种间遗传差异显著，种内遗传变异不同，花生根结线虫的遗传多态性最丰富。 Kaplan等(1999)利用AFLP标记能探测到甜菜胞囊线虫种内群体基因的变异。Marche 等(2001)对来自美国和墨西哥的烟草胞囊线虫0 tabacum^进行了 AFLP分析，明确指出两者属于烟草胞囊线虫的不同亚组。AFLP技术与其它的DNA指纹技术相比具有效率高、重复性好、多态性强分辨率高以及不受基因组遗传背景信息局限等优点。其缺点主要是AFLP是一项专利技术，受专利权保护，实验成分和造价费用昂贵；对基因组的复杂性认知程度有限，内切酶的选择具有盲目性；对DNA纯度和内切酶的质量要求较高，操作技术难度大等方面。但随着AFLP操作步骤的简单化、规范化和自动化，其分析效率会进一步提高，应用范围会不断扩大。SSR也称微卫星(Microsatellite)，是一种由2_5个核苷酸为重复单位串联组成的长达几十个核苷酸的序列，其广泛分布于整个真核生物基因组的不同座位上，具有重复性好、多态性高、实验程序简单和对模板DNA的要求低。SSR是目前较好的遗传标记之一，具有重复性好、多态性高、实验程序简单和对模板DNA的要求低等特点，但获得SSR标记一般需要建立、筛选基因组文库，克隆测序，引物设计等一系列实验，特别是依赖测序设计引物， 成本较高。而且，SSR标记中所用引物不同，实验结果差异较大。但随着微卫星研究的深入，新的序列大量涌入GeneBank中，SSR标记必定会在DNA多态性领域发挥更重要的作用。Thiery和Mugniery (2000)首次将微卫星分离技术应用到植物寄生线虫上，对马铃薯白线虫的基因库进行了分析，获得含有效微卫星重复子的克隆，并以此设计特异性引物，对不同的马铃薯白线虫群体及球形胞囊线虫属的部分线虫进行了检测。分子标记技术作为一种新型的分子生物学技术，已经广泛的应用于植物寄生线虫基因定位、疾病诊断、遗传变异、品种鉴定以及亲缘进化关系等相关领域。分子标记技术由于不受线虫发育阶段、环境条件以及虫量的限制，只用单条线虫就可以将其鉴定到种或种以下的水平，解决形态学上不能解决的分类鉴定中的难题，特别是以其快速、准确、微量、灵敏度高、程序简单等优点广泛应用于植物检疫检测中，是目前线虫学中发展较快的一种鉴定手段。然而DNA分子标记技术运用于植物病原线虫学中的研究仅有10余年的时间，从实验研究技术到数据处理分析都有着很多不完善的地方。如何把传统的形态标记、细胞标记和生化标记研究方法与现代分子标记技术有机的结合起来是一个关键的问题；如何从病原线虫复杂的基因组中选择有效的、具有丰富遗传信息的并能够真实反映遗传关系的分子标记，也是一个很大的难题；如何建立广泛认可的分子标记研究技术是研究者们所面临的难题。虽然有关植物线虫的分子分类和鉴定有了较大的突破，但是目前为止所有的线虫分类仍是以传统的形态学分类为坚实基础的，离开了这个基础，分子分类鉴定是难以进行的。这些分类技术现在往往被综合利用起来去分析某一群体的分类地位。

发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、准确的传毒线虫鉴定方法。本发明所采取的技术方案是
一种短颈剑线虫实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤
(1)取待检样品，提取基因组DNA，制备模板DNA；
(2)建立PCR反应体系
取正向引物XB-F、反向引物XB-R、弓丨物探针XB-P、10XPCR缓冲液、MgCl2、dNTP混合物、 Taq DNA聚合酶和ddH20，加入待检模板DNA，配成PCR反应体系；
其中所述正向引物CC-F6、反向引物CC-R8和探针CC-TZ-6的核苷酸序列分别为 正向引物XB-F 5，-CGTAACCAGCTCGTTCGGTAGA-3，(SEQ ID NO 1)， 反向引物XB-R 5，-TCGATGCACACATATAGATCCG -3，(SEQ ID NO 2)， 探针序列:XB-P 5' -FAM-GAACCTGCGAGCAGGTACCGA-TAMRA-3' FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团；
(3)进行PCR扩增；
(4)荧光PCR仪读取Ct值判断检测的结果。优选的，待测线虫DNA的提取方法为配制提取液提取液中含有2. 5 mmol/L的 DTT, 1. 125%的吐温20，0. 025%的明胶，2. 5倍的PCR缓冲液，余量为水，PCR缓冲液含有 125 mmol/L KCl，25 mmol/L 的 pH =8.3 的 Tris-HCl，3. 75 mmol/L MgCl2，余量为水；
将配制好的提取液预冷至4°C，并滴加至载玻片上，取待测线虫置于提取液中； 将线虫切成段，吸取段状线虫悬浮液8 PL至含有10 PL无菌水的Eppendorf管中，再向管中加入2 μ 预冷的ang/mL蛋白酶K，使总体积为20 μ ,迅速放入_70°C冰箱冷冻10min以上；
将冷冻处理的Eppendorf管置于65°C恒温60 min，95°C恒温10 min, 12000 g离心0.5 min，得到线虫DNA悬浮液。优选的，实时PCR的反应体系的总体积为20 μ ，含有2 μ 1的10XPCR缓冲液、2 μ 1的MgCl2 (25 mmol/mL)、l. 6 μ 1的dNTP混合物，其浓度均为10 mmol/mL，上反向引物 XB-F/XB-R 各 0. 5μ 1，其浓度均为 10 μ mol/mL、XB_P 探针 0. 25 μ 1，其浓度均为 10 μ mol/ mL)、Taq DNA 聚合酶0. 5 U,模板 DNA 2 μ 1 ；
PCR反应条件是94°C预变性，1 min ；95°C变性15s，60°C退火延伸1 min,45个循环。本发明的鉴定方法，检测限低，特异性好，可以快速、准确地鉴定出线虫的种类。


图1是本发明方法对不同样本进行实时荧光PCR的结果图。图2是本发明方法实时荧光PCR的灵敏度检测结果图。
具体实施例方式下面结合实施例，进一步说明本发明。配制提取液提取液中含有2. 5 mmol/L的DTT，1. 125%的吐温20，0. 025%的明胶， 2. 5倍的PCR缓冲液，余量为水，PCR缓冲液含有125 mmol/L KCl, 25 mmol/L的pH =8.3 的 Tris-HCl, 3. 75 mmol/L MgCl2，余量为水；
将配制好的提取液预冷至4°C，并滴加至载玻片上，取待测线虫置于提取液中； 将线虫切成段，吸取段状线虫悬浮液8 PL至含有10 PL无菌水的Eppendorf管中，再向管中加入2 μ 预冷的ang/mL蛋白酶K，使总体积为20 μ ,迅速放入_70°C冰箱冷冻10 min以上；
将冷冻处理的Eppendorf管置于65°C恒温60 min，95°C恒温10 min, 12000 g离心0.5 min，得到线虫DNA悬浮液。实时PCR的反应体系的总体积为20 μ 1，含有2 μ 1的10 X PCR缓冲液、2 μ 1的 MgCl2 (25 mmol/mL)、1.6 μ 1的dNTP混合物，其浓度均为10 mmol/mL，上反向引物XB-F/ XB-R 各 0. 5 μ 1，其浓度均为 10 口11101/1^、乂8- 探针0.25 4 1，其浓度均为10 ymol/mL)、 Taq DNA 聚合酶0. 5 U,模板 DNA 2 μ 1 ；
PCR反应条件是94°C预变性，1 min ；95°C变性15s，60°C退火延伸1 min, 45个循环； 其中，PCR 中使用的正向引物为 XB-F 5，-CGTAACCAGCTCGTTCGGTAGA-3，(SEQ ID NO 1)，反向引物为 XB-R :5，-TCGATGCACACATATAGATCCG -3，(SEQ ID NO 2)，探针序列为 XB-P 5，-GAACCTGCGAGCAGGTACCGA-3，(SEQ ID NO 3)。所有供试样本均经华南农业大学廖金铃教授的形态学鉴定，以确定其分类。对所有供试样本进行实时荧光PCR反应，以检测XB-F/ XB-R/ XB-P的特异性。PCR结果如图1反示，短颈剑线虫不同种群的3个样本都出现了荧光信号，Ct值在22左右，而标明剑线虫、巴西剑线虫、移去剑线虫、腔室剑线虫、克鲁克剑线虫、湖南剑线虫、胼胝拟毛刺线虫、荔枝长针线虫和雪松毛刺线虫等样本都没有荧光信号，表明该方法能够对短颈剑线虫进行特异性的扩增。
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使用不同浓度的模板进行PCR，模板浓度为100ng、10ng、lng、0. lng、0. Olng时，扩增的Ct值分别为18. 1，21.5，24.2，27.9和31. 1。在0. Olng的浓度下荧光PCR扩增曲线明显，两个平行样间的Ct值分别为31. 1和31.2，体现了良好重复性，表明该方法的检测限度在0.01 ng以下。PCR扩增产物进行测序，测序结果与短颈剑线虫重组质粒的DNA序列完全吻合，进一步证明上述检测方法是对短颈剑线虫的特异性扩增。
权利要求
1. 一种短颈剑线虫实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤(1)取待检样品，提取基因组DNA，制备模板DNA；(2)建立PCR反应体系取正向引物XB-F、反向引物XB-R、弓丨物探针XB-P、IOXPCR缓冲液、MgCl2、dNTP混合物、 Taq DNA聚合酶和ddH20，加入待检模板DNA，配成PCR反应体系；其中所述正向引物CC-F6、反向引物CC-R8和探针CC-TZ-6的核苷酸序列分别为正向引物XB-F 5，-CGTAACCAGCTCGTTCGGTAGA-3，(SEQ ID NO 1)，反向引物XB-R 5，-TCGATGCACACATATAGATCCG -3，(SEQ ID NO 2)，探针序列:XB-P 5' -FAM-GAACCTGCGAGCAGGTACCGA-TAMRA-3'FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团；(3)进行PCR扩增；(4)荧光PCR仪读取Ct值判断检测的结果。
2.根据权利要求1所述的短颈剑线虫实时荧光PCR检测方法，其特征在于待测线虫 DNA的提取方法如下1)配制提取液提取液中含有2.5 mmol/L的DTT，1. 125%的吐温20，0. 025%的明胶， 2. 5倍的PCR缓冲液，余量为水，PCR缓冲液含有125 mmol/L KCl, 25 mmol/L的pH =8.3 的 Tris-HCl，3. 75 mmol/L MgCl2，余量为水；2)将配制好的提取液预冷至4°C，并滴加至载玻片上，取待测线虫置于提取液中切成多段，吸取段状线虫悬浮液8 PL至含有10 PL无菌水的Eppendorf管中，再向管中加入2 μ 预冷的2mg/mL蛋白酶K，使总体积为20 μ ，迅速放入_70°C冰箱冷冻10 min以上；3)将冷冻处理的Eppendorf管置于65°C恒温60min，95°C恒温10 min, 12000 g离心 1 min，得到线虫DNA悬浮液。
3.根据权利要求1所述的短颈剑线虫实时荧光PCR检测方法，其特征在于实时PCR的反应体系的总体积为20 μ 1，含有2 μ 1的10XPCR缓冲液、2 μ 1的MgCl2(25 mmol/mL)、 1.6 μ 1 的 dNTP 混合物(10 mmol/mL)、0. 5μ 1 的正向引物 XB-F(10 μ mol/mL)、0. 5 μ 1 的反向引物 XB-R (10 口11101/11^)、0.25口1的探针父8- (10 ymol/mL)、0. 5 U 的 Taq DNA 聚合酶、模板DNA 2 μ 1。
4.根据权利要求1所述的短颈剑线虫实时荧光PCR检测方法，其特征在于PCR反应条件是:94°C预变性，1 min ；95°C变性15s，60°C退火延伸1 min，45个循环。
5.根据权利要求1所述的短颈剑线虫实时荧光PCR检测方法，其特征在于所述模板 DNA的检测限度在O.Olng。
全文摘要
本发明公开了短颈剑线虫的鉴定方法，包括以下步骤提取待测线虫的DNA；使用正向引物、反向引物、探针序列进行实时PCR；根据Ct值的不同，判断线虫是否为短颈剑线虫。本发明方法可快速、准确、稳定的鉴别线虫是否为短颈剑线虫。
文档编号C12Q1/68GK102154499SQ20111008410
公开日2011年8月17日 申请日期2011年4月6日 优先权日2011年4月6日
发明者廖力, 张卫东, 徐淼锋, 迟远丽 申请人:中华人民共和国珠海出入境检验检疫局