专利名称：一种用油厂土壤中筛选的菌株固态发酵生产脂肪酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种用油厂土壤中筛选的菌株固态发酵生产脂肪酶的方法。
背景技术：
脂肪酶(lipase，EC3. 1. 1. 3)，又称甘油酯水解酶，可作用于脂肪分子中的羧酸酯键，催化脂肪水解为脂肪酸和二酰甘油、单酰甘油或甘油，也可催化甘油酯及水不溶性酯类的醇解、酯化、酯交换以及合成等反应。催化反应不需要辅酶，且反应条件温和、副产物少， 反应通常具有高度立体异构专一性和化学选择性。脂肪酶广泛存在于自然界中，是最早被研究的酶类之一。20世纪初国外的研究人员首次发现了微生物脂肪酶，由于微生物资源丰富，同时微生物脂肪酶相对于动物、植物脂肪酶而言，具有种类繁多、反应条件和底物的专一性类型广泛、便于进行工业化生产、容易获得高纯度的酶制剂以及制取成本较低等优点，因而微生物脂肪酶研究受到各国研究人员的广泛关注，并极大的带动了其在基础和实际应用方面的的研究。由于国内产脂肪酶的方法大多还是液态产脂肪酶，固态发酵产脂肪酶的报道较少，因此，用筛选得到的产脂肪酶菌株固态发酵生产脂肪酶，不仅可作为今后生产和工业化生产上的出发菌株，而且也为脂肪酶基因的克隆、工程菌的构建奠定基础。
发明内容
本发明是为了解决菌种在固态发酵条件下产脂肪酶的问题，而采用在油厂附近土壤里提取出的菌株固态发酵产脂肪酶。用油厂附近的土壤来提取菌株固态发酵生产脂肪酶的方法通过以下步骤实现一、将从大庆油厂附近的土壤，取2g 土样与9ml无菌水混合，加玻璃珠振荡摇勻后静置片刻，取5ml上清液加入到富集培养基中，28°C 31°C，160r/min 190r/min振荡培养2d 5d。取IOml培养液加到另一新鲜富集培养基中继续振荡培养，重复此操作两次后，涂布在含有溴甲酚紫的固态脂肪酶筛选平板上。^TC倒置培养4d 5d， 可观察到菌落周围形成黄色变色圈，表明该菌株可产脂肪酶。并筛选生长状况良好的菌株 5株；二、将初筛到的5株菌株纯化后的斜面菌株接种至脂肪酶液体种子培养基培养3d，按 0. 3%的接种量将液体菌种接入液体产酶培养基中，将三角瓶置于 31°C培养箱中振荡培养，结果测得发酵液中XjA的脂肪酶活力最高，为3. lU/ml ；将XjA转接到发酵培养基中发酵培养2d 5d，再将菌株以同样的接种量(0.3%)转接到固态发酵产酶培养基中，发酵培养。当种龄为3 时脂肪酶活力最高为1450U/g，确定产酶量最高的菌株为XjA ；三、把筛选得到产酶量最高的菌株XjA进行固态发酵培养，在种龄为36h，以0. 3%接种量，在碳源和氮源为麸皮和豆粕的培养基上，分别考查了当碳氮比为0 5，1 4,2 3,3 2,4 1， 5 0，培养基含水量为1 0. 5，1 1,1 1.5,1 2,1 2. 5 (培养基水)，发酵温度为25°C 33°C，发酵时间为Id 8d时发酵产脂肪酶的活力，确定了产脂肪酶的最佳固态发酵条件；四、在最佳碳氮比、培养基含水量、发酵温度和发酵时间的条件下接入XjA菌株， 固体发酵产脂肪酶，对此时生产出的脂肪酶检测其活力，并测定此时发酵产出的脂肪酶活
4力为 1450U/g。在采用固态发酵法产脂肪酶的方法中，由于水分活度低，基质水不溶性高，微生物易生长，酶活力高，而且固态基质中气、液、固三相并存的优势，因此，本文筛选的脂肪酶菌株可作为今后生产和工业化生产上的出发菌株，为脂肪酶基因的克隆、工程菌的构建奠定基础。
具体实施例方式具体实施方式
一用油厂附近的土壤来提取菌株固态发酵生产脂肪酶的方法通过以下步骤实现一、将从大庆油厂附近的土壤，取2g 土样与9ml无菌水混合，加玻璃珠振荡摇勻后静置片刻，取5ml上清液加入到富集培养基中 3rC，160r/min 190r/min 振荡培养2d 5d。取IOml培养液加到另一新鲜富集培养基中继续振荡培养，重复此操作两次后，涂布在含有溴甲酚紫的固态脂肪酶筛选平板上。^TC倒置培养3d 5d，可观察到菌落周围形成黄色变色圈，表明该菌株可产脂肪酶。并筛选生长状况良好的菌株5株；二、 将初筛到的5株菌株纯化后的斜面菌株接种至脂肪酶液体种子培养基培养3d，按0. 3%的接种量将液体菌种接入液体产酶培养基中，将三角瓶置于26°C 33°C培养箱中振荡培养， 结果测得发酵液中XjA的脂肪酶活力最高，为3. lU/ml ；将XjA转接到发酵培养基中发酵培养2d 5d，再将菌株以同样的接种量(0.3%)转接到固态发酵产酶培养基中，发酵培养。当种龄为36h时脂肪酶活力最高为1450U/g，确定产酶量最高的菌株为XjA ；三、把筛选得到产酶量最高的菌株XjA进行固态发酵培养，在种龄为36h，以0. 3%接种量，在碳源和氮源为麸皮和豆粕的培养基上，分别考查了当碳氮比为0 5，1 4，2 3,3 2,4 1， 5 0，培养基含水量为1 0. 5，1 1，1 1.5，1 2，1 2. 5 (培养基水)，发酵温度为25°C 33°C，发酵时间为Id 8d时发酵产脂肪酶的活力，确定了产脂肪酶的最佳固态发酵条件；四、在最佳碳氮比、培养基含水量、发酵温度和发酵时间的条件下接入XjA菌株， 固体发酵产脂肪酶，对此时生产出的脂肪酶检测其活力，并测定此时发酵产出的脂肪酶活力为 1450U/g。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一的不同点在于步骤一中将土壤与水混合后的上清液在富集培养基中，以 30°C，160r/min 180r/min振荡培养2d 5d。其它步骤与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一的不同点在于步骤一中将土壤与水混合后的上清液在富集培养基中，振荡培养3d 5d，^rc倒置培养4d 5d。其它步骤与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一的不同点在于步骤二中将初筛到的5株菌株，按0. 3 %的接种量将液体菌种接入液体产酶培养基中，置于^TC 31°C培养箱中振荡。其它步骤与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一的不同点在于步骤二中将将XjA 转接到发酵培养基中发酵培养3d 5d。其它步骤与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一的不同点在于步骤三中在调节碳氮比为 1 4，2 3,3 2,4 1，培养基含水量为 1 0. 5，1 1，1 1. 5，1 2，1 2. 5， 发酵温度为25°C 33°C，发酵时间为Id 8d等固态发酵参数。其它步骤与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一的不同点在于步骤三中将调节碳氮比为1 4，2 3,3 2,4 1，培养基含水量为1 0. 5，1 1,1 1.5，发酵温度在 25°C 33°C，发酵时间Id 8d等固态发酵参数。其它步骤与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一的不同点在于步骤三中调节调节碳氮比为1 4，2 3，3 2，4 1，培养基含水量为1 0. 5，1 1,1 1.5，发酵温度在27°C 31°C，发酵时间Id 8d，等固态发酵参数。其它步骤与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
一的不同点在于步骤三中调节调节碳氮比为1 4，2 3，3 2，4 1，培养基含水量为1 0. 5，1 1,1 1.5，发酵温度在27°C 31°C，发酵时间2d 5d等固态发酵参数。其它步骤与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
一的不同点在于步骤四中选用最佳固态发酵参数产脂肪酶，并测定其脂肪酶活力。其它步骤与具体实施方式
一相同。
权利要求
1.一种在大庆日月星油厂附近土壤里提取出的菌株固态发酵产脂肪酶的方法，其特征在于用大庆日月星油厂附近土壤筛选得到的菌株固态发酵的方法产脂肪酶，其最佳发酵参数的确定通过以下步骤实现一、将从大庆油厂附近的土壤，取2g 土样与9ml无菌水混合，加玻璃珠振荡摇勻后静置片刻，取5ml上清液加入到富集培养基中，28°C 31°C，160r/ min 190r/min振荡培养2d 5d。取IOml培养液加到另一新鲜富集培养基中继续振荡培养，重复此操作两次后，涂布在含有溴甲酚紫的固态脂肪酶筛选平板上。^rc倒置培养 4d 5d，可观察到菌落周围形成黄色变色圈，表明该菌株可产脂肪酶。并筛选生长状况良好的菌株5株；二、将初筛到的5株菌株纯化后的斜面菌株接种至脂肪酶液体种子培养基培养3d，按0. 3%的接种量将液体菌种接入液体产酶培养基中，将三角瓶置于 31°C培养箱中振荡培养，结果测得发酵液中XjA的脂肪酶活力最高，为3. lU/ml ；将XjA转接到发酵培养基中发酵培养2d 5d，再将菌株以同样的接种量(0.3% )转接到固态发酵产酶培养基中，发酵培养。当种龄为36h时脂肪酶活力最高为1450U/g，确定产酶量最高的菌株为 XjA ；三、把筛选得到产酶量最高的菌株XjA进行固态发酵培养，在种龄为36h，以0. 3%接种量，在碳源和氮源为麸皮和豆粕的培养基上，分别考查了当碳氮比为0 5，1 4,2 3， 3 2,4 1,5 0，培养基含水量为 1 0. 5，1 1，1 1. 5，1 2，1 2. 5 (培养基 水)，发酵温度为25°C 33°C，发酵时间为Id 8d时发酵产脂肪酶的活力，确定了产脂肪酶的最佳固态发酵条件；四、在最佳碳氮比、培养基含水量、发酵温度和发酵时间的条件下接入XjA菌株，固体发酵产脂肪酶，对此时生产出的脂肪酶检测其活力，并测定此时发酵产出的脂肪酶活力为1450U/g。
2.根据权利要求1所述的用油厂土壤中筛选的菌株固态发酵生产脂肪酶的方法，其特征在于步骤一中将土壤与水混合的5ml上清液加入到培养基中，28°C 31°C，160r/min 180r/min振荡培养2d 5d。
3.根据权利要求1所述的用油厂土壤中筛选的菌株固态发酵生产脂肪酶的方法，其特征在于步骤一中将土壤与水混合的5ml上清液加入到培养基中，28°C 31°C，160r/min 180r/min振荡培养3d 5d。取IOml培养液加到另一新鲜富集培养基中继续振荡培养，重复此操作两次后，涂布在含有溴甲酚紫的固态脂肪酶筛选平板上。^TC倒置培养3d 5d， 可观察到菌落周围形成黄色变色圈，表明该菌株可产脂肪酶。并筛选生长状况良好的菌株 5株。
4.根据权利要求1所述的用油厂土壤中筛选的菌株固态发酵生产脂肪酶的方法，其特征在于步骤二中将按0. 3%的接种量将液体菌种接入液体产酶培养基中，将三角瓶置于 ^TC 31°C培养箱中振荡培养，结果测得发酵液中XjA的脂肪酶活力最高，为3. lU/ml。
5.根据权利要求1所述的用油厂土壤中筛选的菌株固态发酵生产脂肪酶的方法，其特征在于步骤二中将按0. 3%的接种量将液体菌种接入液体产酶培养基中，将三角瓶置于 ^TC 31°C培养箱中振荡培养，结果测得发酵液中XjA的脂肪酶活力最高，为3. lU/ml，将 XjA转接到发酵培养基中发酵培养3d 5d，再将菌株以同样的接种量(0.3%)转接到固态发酵产酶培养基中，发酵培养。
6.根据权利要求1所述的用油厂土壤中筛选的菌株固态发酵生产脂肪酶的方法，其特征在于步骤三中将在种龄为36h，以0. 3%接种量，在碳源和氮源为麸皮和豆粕的培养基上，当碳氮比为1 4，2 3,3 2,4 1，培养基含水量为1 0. 5，1 1，1 1. 5，1 2，(1 2.5(培养基水)，发酵温度为25°C 33°C，发酵时间为Id 8d时发酵产脂肪酶的活力，确定了产脂肪酶的最佳固态发酵条件。
7.根据权利要求1所述的用油厂土壤中筛选的菌株固态发酵生产脂肪酶的方法，其特征在于步骤三中将在种龄为36h，以0. 3%接种量，在碳源和氮源为麸皮和豆粕的培养基上，当碳氮比为1 4，2 3，3 2，4 1，培养基含水量为1 0. 5，1 1,1 1. 5，(培养基水)，发酵温度为25°C 33°C，发酵时间为Id 8d时发酵产脂肪酶的活力，确定了产脂肪酶的最佳固态发酵条件。
8.根据权利要求1所述的用油厂土壤中筛选的菌株固态发酵生产脂肪酶的方法，其特征在于步骤三中将在种龄为36h，以0. 3%接种量，在碳源和氮源为麸皮和豆粕的培养基上，当碳氮比为1 4，2 3,3 2,4 1，培养基含水量为1 0. 5，1 1,1 1. 5，(培养基水)，发酵温度为27°C 31°C，发酵时间为Id 8d时发酵产脂肪酶的活力，确定了产脂肪酶的最佳固态发酵条件。
9.根据权利要求1所述的用油厂土壤中筛选的菌株固态发酵生产脂肪酶的方法，其特征在于步骤三中将在种龄为36h，以0. 3%接种量，在碳源和氮源为麸皮和豆粕的培养基上，当碳氮比为1 4，2 3,3 2,4 1，培养基含水量为1 0. 5，1 1,1 1. 5，(培养基水)，发酵温度为27°C 31°C，发酵时间为2d 5d时发酵产脂肪酶的活力，确定了产脂肪酶的最佳固态发酵条件。
10.根据权利要求1所述的用油厂土壤中筛选的菌株固态发酵生产脂肪酶的方法，其特征在于步骤四中在最佳的固态发酵条件下产脂肪酶，对此时生产出的脂肪酶检测其活力，并测定此时发酵产出的脂肪酶活力为1450U/g。
全文摘要
一种用大庆日月星油厂附近土壤中筛选的菌株固态发酵生产脂肪酶的方法，本发明涉及采用筛选分离的方法从土壤中提取产脂肪酶的菌株，并对其采用固态发酵的方法生产脂肪酶。将分离纯化后的该菌接入到固态发酵培养基中，在此过程中确定产脂肪酶获利最高的发酵参数在种龄36h，接种量0.3％的脂肪酶固态发酵条件下，麸皮和豆粕的比为1∶4，含水量为50％(V/W)，发酵温度29℃，发酵时间3d。此时，固态培养基中脂肪酶的活力可达1450U/g。
文档编号C12N9/20GK102191232SQ20111008248
公开日2011年9月21日 申请日期2011年4月2日 优先权日2011年4月2日
发明者于殿宇, 刘晶, 张佳宁, 徐速, 时敏, 李志平, 李越, 江连洲, 陈晓惠, 韩春然 申请人:东北农业大学