专利名称：一种利用喜树aoc基因转化提高烟草尼古丁含量的方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用转基因技术提高烟草尼古丁含量的方法。本发明还涉及利用基因工程获得的尼古丁含量高的烟草细胞和植株及其培养的子代、再生植株、植物组织或种子。
背景技术：
茉莉酸类物质是植物界中普遍存在的一种激素，参与植物发育和逆境胁迫下应激反应的信号传导过程。内源和外源的茉莉酸类化合物能显著提高植物对机械损伤、动物撕咬、病虫害侵染、低温、高盐等不利外界环境的耐受能力。在植物中，茉莉酸类物质的合成途径是从细胞膜上释放的亚麻酸开始，在脂氧合酶、丙二烯氧化物合成酶、丙二烯氧化物环化酶、OPDA (12-0X0-(10, 15Z)-phytodienoic acid)还原酶、β -氧化酶、茉莉酸甲基化酶等一系列酶的催化生成茉莉酸和甲基茉莉酸。其中由于丙二烯氧化物会自发水解，由此丙二烯氧化物环化酶的作用在茉莉酸类物质的合成途径中尤为重要。烟草作为一种重要的模式植物，且易于进行遗传转化，是植物的信号途径研究中的热门对象；作为一种广泛种植的经济作物，烟草的尼古丁含量在物种品质和经济价值上具有非常重要的意义。常态下，纯尼古丁是一种难闻、味苦、无色透明的油质液体，挥发性强，能迅速溶于水和乙醇，对人体有毒性。同时又是一种非常宝贵的医药、化工原料和良好的高效低毒杀虫剂。烟草的尼古丁生物合成途径中起关键作用的有喹啉磷酸核糖转移酶 (QPT)和N-甲基腐胺转移酶(PMT)两种酶。在烟草根部这两种酶的活性直接影响烟叶的尼古丁含量。相比较而言，利用来源于喜树的茉莉酸类物质合成途径的关键酶丙二烯氧化物环化酶的基因工程来系统性地提高烟草的尼古丁含量具有很大的优势(1)在茉莉酸类物质的合成和信号传导研究领域，全世界的研究人员已经进行了几十年的深入研究，其生理作用和生化机制比较清楚，为在基因工程中利用茉莉酸类物质生物合成途径的基因打下了良好的理论和实践基础。(2)提供一种全新的思路，采用转aoc基因提高烟草中尼古丁含量的方法。喜树是一种和烟草亲缘关系比较远的植物，来源于喜树的丙二烯氧化物环化酶在烟草中能顺利表达并达到高活性效果，提高了尼古丁含量。这为开展植物基因工程研究提供了一个新的方向。目前，尚未有任何与本专利申请中所提及的应用基因工程技术把喜树的茉莉酸物质生物合成途径的酶基因尤其是丙二烯氧化物环化酶转到烟草中，提高烟草尼古丁含量的相关报道，包括专利和文献。
发明内容
本发明的第一目的就是提供一种利用基因工程技术提高烟草尼古丁含量的方法， 该方法将来源于喜树的丙二烯氧化物环化酶基因转到烟草中。本发明的第二目的是提供一种高效表达载体，它包含上述喜树的丙二烯氧化物环化酶基因片断。本发明的第三目的是提供一种用上述高效表达载体转化的宿主细胞。在实例中该宿主细胞是烟草。本发明分离出的DNA分子具有编码丙二烯氧化物环化酶的核苷酸序列的核心片断，该核心片断来源于由申请人在GenBank中登录的喜树(Ca刚ioiAeca acuminata )丙二烯氧化物环化酶基因(登录号AY863^8)的核苷酸序列，用引物Pl (5’-gg actagt Atg get get tea tea act tc-3' ,酶切位点用下划线表示)禾口 P2 (5' -ga ggttacc Tea gtc agt gaa gtt agg aa_3'，feiEII酶切位点用下划线表示)，采用PCR法可以从喜树cDNA文库中扩增出该核心片断，喜树丙二烯氧化物环化酶基因的cDNA序列见SEQ IDNO :1。全长 ll^bp，开放阅读框位置为第72位碱基到第812位碱基。本发明提出的利用转基因技术提高烟草尼古丁含量的方法，利用具有编码喜树丙二烯氧化物环化酶(AOC)的核苷酸序列(Genbank No. :AY863428)的植物表达载体，采用转基因方法在烟草细胞、组织、器官、植株中过量表达喜树丙二烯氧化物环化酶基因的DNA分子。其具体步骤如下
1、采用任何可能的手段(如基因克隆、人工合成基因等方法)获得喜树丙二烯氧化物环化酶基因的核心片断；
2、把喜树丙二烯氧化物环化酶基因核心片断可操作地连于表达调控序列，形成表达载
体；
3、采用任何转基因方法转移喜树丙二烯氧化物环化酶基因核心片断到烟草细胞、组织、器官或植株中；
4、在特定的条件下筛选和鉴定转化子；
5、在适合的条件下培养尼古丁含量提高的烟草转化子，获得转基因后代。本发明涉及的载体包含具有编码喜树丙二烯氧化物环化酶的核苷酸序列的核心片断的DNA。用上述方法获得的生命体，它是尼古丁含量提高了的烟草的细胞、组织、器官、植株。本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒等。在本发明中，术语“生命体”指烟草的细胞、组织、器官、或植株。本发明中，术语“任何可能的手段”为获得喜树丙二烯氧化物环化酶基因的方法， 具体包括同源性克隆(如RT-PCR、RACE等)、文库筛选而后人工合成喜树丙二烯氧化物环化酶基因及其变异体。本发明中，术语“任何转基因方法”包括根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化、发根农杆菌Ri质粒介导基因转化、植物病毒载体介导基因转化、PEG介导基因转化、脂质体介导基因转化、电击法介导基因转化、超声波介导基因转化、显微注射介导基因转化、激光微束介导基因转化、基因枪介导基因转化、花粉管通道介导基因转化、生殖细胞浸泡法介导基因转化。本发明中，术语“在特定的条件下筛选和鉴定转化子”是指在离体培养的条件下用抗生素(卡那霉素、潮霉素、G418等)选择出有抗生素抗性的转化子；可以使用PCR、 Southern杂交、Northern杂交和^festern印迹等方法来鉴定转化子。
本发明中，术语“在适合的条件下培养尼古丁含量提高的烟草转化子，获得转基因后代”是指对经过鉴定的转化子离体培养，并检测尼古丁含量，筛选尼古丁含量提高的优良转化子进行培养，获得转基因后代。本发明中，我们从喜树中克隆丙二烯氧化物环化酶基因核心片断，并构建了植物高效表达载体，导入农杆菌并遗传转化烟草，以提高烟草的尼古丁含量，提高烟草的品质。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件， 例如《分子克隆》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照厂商所建议的条件。实施例1
胃_二_北講仆聽贿心賭白始成汰裁麵工禾早細_聿。1、喜树丙二烯氧化物环化酶基因核心片断的获得
根据喜树丙二烯氧化物环化酶基因的全长序列，在该基因的内部第72碱基至第812碱基之间设计引物，扩增741bp序列作为基因片断，并根据植物表达载体pCAMBIA1304的多克隆酶切位点，分别设计两条含有分el和ifeiEII限制性内切酶位点以及保护碱基的PCR扩增引物，其引物序列为
Pl 5' -RgactagtAtggctgcttcatcaact tc_3，(SEQ ID NO 2),加I 酶切位点用下划线表示；
P2 5' -gaggttaccTcagtcagtgaagttaggaa-3' (SEQ ID NO :3)，feiEII 酶切位点用下划线表示。从喜树的叶片抽提总RNA (上海华舜生物工程有限公司植物RNA提取试剂盒)，反转录成cDNA (TaKaRa RNA PCR Kit)，然后进行PCR扩增，PCR反应体系为50 μ L，包含去离子水，10XPCR 缓冲液 5 μ L，dNTP 1 μ L，MgCl2 3 μ L，引物各 1 μ L，cDNA 模板 1 μ L，Taq 酶 0. 5 μ L。PCR条件为94° C 3分钟，随之以94° C 50秒、60° C 50秒、和72° C 50秒进行观个循环，最后在72° C延伸8分钟。1%琼脂糖电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片断长度为75^ρ。电泳分离后，回收(上海华舜生物工程有限公司PCR产物回收试剂盒)目的片断， 取适量回收产物与pMD 18-T载体(TaKaRa PMD 18-T Vector试剂盒)连接后转入大肠杆菌 DH5ci，在LB+氨苄青霉素(lOOmgL—1)固体培养基上抗性筛选阳性克隆，PCR鉴定后测序(上海博亚生物工程公司完成)。2、CaMV35S组成型启动子表达载体pCAMBIA-HnAOC的构建
将经过测序验证正确后的DH5 α (已经转入带有喜树丙二烯氧化物环化酶基因核心片断的pMD 18-T载体)摇菌，扩大培养，提取质粒，用和feiEII双酶切，1%琼脂糖电泳后回收小片断。将pCAMBIA1304用和feiEII双酶切，1%琼脂糖电泳后回收大片断。将回收的pCAMBIA1304大片断和喜树丙二烯氧化物环化酶基因核心片断用T4连接酶连接后，转化DH5ci感受态细胞，LB+卡那霉素(100 mgL—1)固体培养基上筛选阳性抗性克隆，PCR和双酶切鉴定。获得转喜树丙二烯氧化物环化酶基因核心片断的重组质粒并命名为 pCAMBIA1304-CaA0C。3、pCAMBIA1304-CaA0C 转化农杆菌 EHA105
将pCAMBIA1304-CaA0C转化入农杆菌菌株EHA105，划板挑取阳性单菌落摇菌，取少量菌液抽提质粒，进行PCR和酶切鉴定。阳性克隆定义为EHA105-CaA0C。实施例2
获得尼古丁含量提高的转基因烟草。1、农杆菌EHA105-CaA0C。使用前自冰箱取出，接种于50 ml YEB液体(Rif+，Str+， Kan+), 28°C，200rpm振荡培养两次。2、第二次活化0D_达0. 3时加100 μ mol Γ1乙酰丁香酮，继续，200rmp振荡培养，OD600达0. 6时室温下4000rpm离心10分钟。3、弃上清，菌体用MS (加100 μ mol L—1乙酰丁香酮)液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，使菌液的0D_=0. 3左右，称为转化液。4、取烟草无菌苗的幼嫩、健壮叶片，去主脉，将叶片剪成0.8 cmXO.8 cm左右的叶盘，放在MSCtol mg Γ1 6-苄氨基嘌呤，1 mg L—1萘乙酸)培养基上，防止叶盘脱水；将叶盘放入农杆菌培养液中，190 rpmJ8°C摇床上浸染10 min ；用药勺捞出叶盘，放在灭菌的吸水纸上，吸干叶盘上的多余菌液；将吸干的叶盘平放在加盖一层滤纸的MS (加1 mg L—1 6-苄氨基嘌呤，1 mg L—1萘乙酸)培养基上，25°C左右，于暗处共培养约2天。5、共培养后，按以下步骤将叶盘表面的农杆菌洗掉，其间不时摇动，使叶盘充分接触溶液
a)无菌水15分钟
b)无菌水+羧苄青霉素(500mg Γ1)15分钟
c)MS+羧苄青霉素(500 mg L—1)20分钟
接着用药勺捞出叶盘，放在吸水纸上，吸干多余水分；将叶盘放在MS (含30 mg Γ1潮霉素和250 mg L—1羧苄青霉素)培养基上，叶盘边缘轻压入培养基中；25°C左右，16 h/24 h光照培养；约20天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于MS(含0.5 mg Γ1萘乙酸、 30 mg/T1潮霉素和250 mg/T1羧苄青霉素)培养基上进行生根培养；约14天之后将幼苗移栽到装有1:1:1的泥炭土、蛭石和珍珠岩混合物小型的塑料花盆中在25 °C、14 h光/24 h 的条件下生长。6、用PCR分别检测潮霉素抗性基因和喜树丙二烯氧化物环化酶基因在转基因烟草的基因组中的整合，确认转基因事件。实施例3
转基因烟H禾Π非转基因'烟I^t照的M古T含量检测丨。1、尼古丁提取
1)待烟草在花盆中长至约20cm时，取烟草中部叶片，去掉中脉，在60°C烘箱中将叶片烘干，研磨成粉末。其中野生型和转基因烟草各选两份，一份用100 μ M甲基茉莉酸处理，一份不处理。2)将粉末放置于60°C烘箱，烘干至恒重。3)称取粉末0. 05g，用lml，25mM磷酸钠缓冲液(pH 7. 8)于30°C下搅动提取Mh，13. 4 krpm离心Imin,取上清。4)含水提取物减压过滤，用水稀释10倍，4°C保存待测。2、尼古丁含量测定
用HPLC首先对标准品进行条件优化，然后测定样品。首先进标准样，观察峰形是否尖而对称；然后进一个样品，观察目标峰附近有没有其它峰干扰。如果均符合要求，上样，进行 HPLC测定。非转基因烟草和转基因烟草中尼古丁含量的比较
每个样品均取三个重复。非转基因烟草叶片和八个独立转基因烟草叶片中尼古丁的含量经过检测。在非转基因烟草叶片中尼古丁的含量为0.四56%，而在转Cd基因的烟草叶片中尼古丁的含量普遍比非转基因的高，其中最高含量达到1. 9952%。
权利要求
1.一种利用喜树AOC基因转化提高烟草尼古丁含量的方法，其特征在于利用具有编码喜树丙二烯氧化物环化酶的核苷酸序列的植物表达载体，采用转基因方法在烟草细胞、组织、器官、植株中过量表达喜树丙二烯氧化物环化酶基因的DNA分子；其具体步骤如下(1)采用基因克隆或人工合成基因方法获得喜树丙二烯氧化物环化酶基因的片断；(2)把喜树丙二烯氧化物环化酶基因片断连于表达调控序列，形成植物高效表达载体；(3)采用转基因方法转移喜树丙二烯氧化物环化酶基因片断到烟草的细胞、组织、器官、植株中；(4)筛选和鉴定转化子；(5)培养转化子，获得转基因后代；(6)测定转基因后代的尼古丁含量。
2.一种植物表达载体，其特征在于它包含喜树丙二烯氧化物环化酶基因片断。
3.由权利要求1所述方法获得的生命体，其特征在于为尼古丁含量提高的细胞、组织、 器官或植株。
4.用权利要求1所述方法获得的尼古丁含量提高的细胞、组织、器官或植株转基因生命体的后代。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，具体为一种利用喜树AOC基因转化提高烟草尼古丁含量的方法。本发明涉及包含利用喜树丙二烯氧化物环化酶(AOC)基因构建植物表达载体，利用基因工程技术在烟草中过量表达喜树AOC基因提高烟草中尼古丁含量的方法。其过程是从喜树中克隆AOC基因，构建了植物高效表达载体，导入农杆菌并遗传转化烟草，测定转基因烟草叶片中尼古丁含量。本方法可以在烟草中过量表达喜树AOC基因，提高烟草中的尼古丁含量。
文档编号C12N15/52GK102181458SQ20111007995
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月31日 优先权日2011年3月31日
发明者唐克轩, 孙小芬, 皮妍, 蒋科技 申请人:复旦大学