检测与抗病毒感染性有关的基因oas1中的突变的方法

专利名称：检测与抗病毒感染性有关的基因oas1中的突变的方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测人类寡腺苷酸合成酶基因中的突变的方法及所编码的蛋白质及其抗体的用途，其中突变赋予对黄病毒感染(包括C型肝炎感染)的抗性，且突变与包括前列腺癌和糖尿病的其他病状有关。
背景技术：
迄今为止已鉴别许多疾病，其中人类群体中存在天然的感染抗性。Alter和 Moyer, J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum Retrovirol. 18 ±曾干Ij 1 :S6_10(1998) 艮导在诸如注射药物使用者的高危群组中的C型肝炎病毒感染(HCV)高达90%。然而，尚未有文献确认剩余的10%明显对抗感染的机制为何。在HCV感染中起作用的蛋白质包括2-端、 5-端寡腺苷酸合成酶。OAS是干扰素诱导的蛋白质，其特征为能催化2-端、5-端腺苷寡聚物 (2-5A)的合成。Hovanessian等人，EMBO 6:1273-1280(1987)发现经干扰素治疗的人类细胞含有数种与40 (OASl)、46 (OASl)、69及IOOkD的蛋白质对应的OAS。Marie等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 160 :580-587(1989)产生高度特异性的抗 p69 (69_kD OAS)多克隆抗体。通过以抗P69抗体筛检经干扰素治疗的人类细胞表达文库，Marie和Hovanessian， J. Biol. Chem. 267 :9933-9939 (1992)分离出部分0AS2 cDNA。他们以部分cDNA筛检另外的文库并回收编码两个0AS2同功异型物(isoform)的cDNA。较小的同功异型物由两个3-端未转译区长度不同的mRNA编码。Northern印迹分析揭示0AS2表达为人类细胞中四个由干扰素诱导的mRNA。所预测的0AS2蛋白质具有共同的683-氨基酸序列及不同的3-端末端。根据活体外转录/转译产物的SDS-PAGE，两个同功异型物的分子质量为69和71kD。两个同功异型物在活体外均显示出OAS活性。序列分析表明0AS2含有两个由富含脯氨酸的假定连接子区所分隔的 OASl同源域。N末端及C末端域分别为41%和53%相同于OASl。通过荧光原位杂交和通过包含于定位克隆之内，Hovanian等人，Genomics 52 267-277(1998)确定 0AS1、0AS2 和 0AS3 基因是由 12q24. 2 上的 130_kb 区丛集。2-5A 结合至降解病毒及细胞RNA的核糖核酸酶I并激活其，从而导致细胞蛋白质合成的抑制和病毒复制的削弱。被称为OASL的第四种人类OAS基因与0AS1、0AS2和0AS3的不同在于OASL缺乏酶活性。OASL基因编码双域蛋白质，其是由融合至与泛素的串联重复同源的164-氨基酸 C 末端域的 OAS 单元组成。(Eskildsen 等人，Nuc. Acids Res. 31 :3166-3173,2003 ；Kakuta 等人，J. Interferon & Cytokine Res. 22 :981-993,2002)由于其在抑制病毒复制和病毒感染中的作用，因此此项技术中需要抑制与OASl活性有关的病毒复制的方法和组合物，包括进一步需要抑制HCV复制的基于抑制剂的疗法。

发明内容
本发明涉及检测与C型肝炎抗性有关的突变，所述突变的特征在于其为寡腺苷酸合成酶1基因中的点突变。在一实施例中，涵盖一种人类基因筛检方法。所述方法包含对分离自人类的核酸样本分析寡腺苷酸合成酶ι基因点突变的存在，所述点突变的特征为在根据Genbank序列登记号第NT_009775. 13号(连续核苷酸2，130,000-2，157，999，其以SEQ ID NO: 19显示于图2 中)的寡腺苷酸合成酶 1 基因(OASl)的 2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、 2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、2156523 或 2156638 核苷酸位置处的碱基取代或在2156595核苷酸位置处的碱基缺失。在一优选实施例中，所述方法包含于扩增条件下以聚合酶链式反应(PCR)引物对处理来自人类的基因组DNA样本，以扩增含有寡腺苷酸合成酶1基因NT_009775. 13 的 2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、 2139587、214似94、2144985、2156523、2156595 或 2156638 核苷酸位置的人类基因组DNA 区。 PCR处理产生含有所述区的扩增产物，然后分析其点突变的存在。在另一实施例中，本发明提供一种由在NT_009775. 13的2135728、2135749、 2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、 2144985、2156523、2156595或2156638位置处具有至少一个突变的基因所编码的蛋白质， 和所述蛋白质用以制备抗病毒感染、优选为黄病毒感染、最优选为C型肝炎感染用的诊断剂的用途。在特定实施例中，所述诊断剂为抗体。在另一实施例中，本发明提供一种用于预防或抑制病毒感染、优选为黄病毒感染、最优选为C型肝炎病毒感染的治疗化合物，其中所述治疗化合物为由在NT_009775. 13 的 2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、 2139587、214似94、2144985、2156523、2156595 或 2156638 位置处具有至少一个突变的 OASl 基因所编码的蛋白质。在其他实施例中，所述治疗化合物为编码蛋白质的聚核苷酸，诸如 DNA 或 RNA。在另一实施例中，本发明提供一种用于预防或抑制病毒感染、优选为黄病毒感染、 最优选为C型肝炎病毒感染的治疗化合物，其中所述治疗化合物为具有以下序列的蛋白质SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO 25,SEQ ID NO 26、SEQ ID NO 27、SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29、SEQID NO 32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO 47 和 / 或 SEQ ID NO 48。在另一实施例中，本发明提供一种用于预防或抑制病毒感染、优选为黄病毒感染、最优选为C型肝炎病毒感染的治疗化合物，其中所述治疗化合物模拟在NT_009775. 13 的 2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、 2139587、214似94、2144985、2156523、2156595或2156638位置处的至少一个突变的有利作用。所述治疗化合物可为小分子、蛋白质、肽、DNA或RNA分子或抗体。
在另一实施例中，本发明提供一种用于预防或治疗癌症、优选为前列腺癌的治疗化合物，其中所述治疗化合物为由在NT_009775. 13的2135728、2135749、2135978、 2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、 2156523、2156595或2156638位置处具有至少一个突变的OASl基因所编码的蛋白质。在其他实施例中，所述治疗化合物为编码蛋白质的聚核苷酸，诸如DNA或RNA。在另一实施例中，本发明提供一种用于预防或治疗癌症、优选为前列腺癌的治疗化合物，其中所述治疗化合物为具有以下序列的蛋白质SEQ ID NO :20,SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22,SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :26、SEQID NO :27、SEQ ID NO :28,SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ IDNO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :46, SEQ ID NO :47 和 / 或 SEQ ID NO :48。在另一实施例中，本发明提供一种用于预防或治疗癌症、优选为前列腺癌的治疗化合物，其中所述治疗化合模拟在NT_009775. 13的21357沘、2135749、2135978、2144072、 2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、2156523、 2156595或2156638位置处的至少一个突变的有利作用。所述治疗化合物可为小分子、蛋白质、肽、DNA或RNA分子或抗体。在其他实施例中，所述治疗化合物能够抑制OASl或整个蛋白质的至少一个子区或子功能的活性，且所述化合物的代表为能特异性结合至OASl聚核苷酸的反义分子、核酶和RNAi分子，以及能特异性结合至OASl蛋白质和多肽的抗体及其片段。在另一实施例中，本发明提供OASl的抑制剂。本发明的抑制剂包括(但不限于) 反义分子、核酶、RNAi、抗体或抗体片段、蛋白质或多肽以及小分子。例示性反义分子包含 SEQ ID N0:19的至少10、15或20个连续核苷酸，或是在严格条件下杂交至SEQID NO 19 的聚核苷酸的反义分子。更优选的是包含SEQ ID N0:19的至少25个连续核苷酸或在严格条件下杂交至SEQ ID NO 19的序列的反义分子。在另一实施例中，设想OASl的抑制剂特异性结合至由SEQ ID NO 30的多肽所界定的蛋白质区。本发明的抑制剂包括(但不限于)抗体、抗体片段、小分子、蛋白质或多肽。在另一实施例中，设想OASl的抑制剂包含特异性结合或杂交至SEQ ID NO 31的聚核苷酸的反义或RNAi分子。在另一实施例中，提供包含在医药学上可接受的载剂中的一种或一种以上OASl 抑制剂的组合物。额外的实施例提供降低OASl基因表达或生物学活性的方法。额外的实施例提供特异性增加或降低在NT_009775. 13的2135728、2135749、 2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、 2144985、2156523、2156595或2156638位置处具有至少一个突变的OASl基因的某些形式的
表达的方法。本发明提供包含至少一个经修饰的核苷间键合的反义寡核苷酸。本发明进一步提供具有硫代磷酸酯键合的反义寡核苷酸。本发明又进一步提供包含至少一个经修饰的糖部分的反义寡核苷酸。本发明也提供包含至少一个经修饰的糖部分的反义寡核苷酸，其中所述糖部分为 2' -0-甲基糖部分。
本发明进一步提供包含至少一个经修饰的核苷酸碱基的反义寡核苷酸。本发明又进一步提供具有经修饰的核苷酸碱基的反义寡核苷酸，其中所述经修饰的核苷酸碱基为5-甲基胞嘧啶。本发明也提供一种反义化合物，其中所述反义化合物为嵌合寡核苷酸。本发明提供一种抑制人类细胞或组织中人类OASl的表达的方法，其包含使活体内细胞或组织与靶向于编码人类OASl的核酸分子的长度为8至35个核苷酸的反义化合物或核酶接触，从而抑制人类OASl的表达。本发明进一步提供一种使用反义或RNAi化合物或核酶降低或增加活体内OASl 的特定形式的表达的方法，所述形式是由在NT_009775. 13的2135728、2135749、2135978、 2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、 2156523,2156595或2156638位置处具有至少一个突变来界定。本发明进一步提供一种调节癌细胞生长的方法，其包含使活体内癌细胞与靶向于编码人类OASl的核酸分子的长度为8至35个核苷酸的反义化合物或核酶接触，从而抑制人类OASl的表达。本发明又进一步提供鉴别OASl聚核苷酸的目标区。本发明也提供用于通过原位杂交鉴别OASl聚核苷酸的经标记的探针。本发明提供根据本发明的OASl抑制剂用以制备预防或抑制HCV感染用的药剂的用途。本发明进一步提供使OASl抑制剂针对OASl蛋白质的特定区或所述蛋白质的特定功能。本发明也提供一种用于抑制OASl表达的医药组合物，其包含本发明的反义寡核苷酸与生理学上可接受的载剂或稀释剂的混合物。本发明进一步提供能特异性裂解OASl RNA的核酶和包含所述核酶的医药组合物。本发明也提供OASl的小分子抑制剂，其中所述抑制剂能降低OASl的活性或能降低或阻碍OASl mRNA的表达。本发明进一步提供除修饰2' -5'寡腺苷酸的合成外还修饰蛋白质的特定功能的OASl抑制剂，所述功能包括与诸如C型肝炎病毒NS5A蛋白的其他蛋白质的相互作用。本发明进一步提供改变包括(但不限于)糖基化和磷酸化作用的OASl转译后修饰的化合物。本发明进一步提供用于鉴别寡腺苷酸合成酶基因突变的人类基因筛检方法，其包含(a)于扩增条件下以聚合酶链式反应(PCR)引物对处理来自人类的基因组DNA 样本，以扩增含有寡腺苷酸合成酶基因的2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、 2144116,2144321,2131025,2133961,2139587,2144294,2144985,2156523,2156595 或 2156638核苷酸位置的人类基因组DNA区，所述处理产生含有所述区的扩增产物；及(b) 检测步骤(a)的扩增产物中在 21357沘、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、 2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、2156523、2156595 或 2156638 核苷酸位置处的核苷酸点突变的存在，从而鉴别所述突变。在此方法的某些实施例中，所述区包含以选自由SEQ ID N0:l_7及SEQ IDNO 57-64组成的群组的序列所代表的核苷酸序列。在其他实施例中，所述区基本上由选自由 SEQ ID NO :1-7及SEQ ID NO :57-64组成的群组的核苷酸序列组成。本发明也提供一种检测方法，其中所述检测包含在杂交条件下以对点突变特异的寡核苷酸探针处理以上步骤 (a)的扩增产物，并检测杂交产物的形成。在所述方法的某些实施例中，寡核苷酸探针包含选自由SEQ ID NO :12-18组成的群组的核苷酸序列。本发明也涉及在人类中检测含有点突变的C型肝炎感染抗性疾病等位基因的方法，所述点突变包含在寡腺苷酸合成酶基因(OASl)的2135728、2135749、2135978、 2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、 2156523,2156595或2156638核苷酸位置处以非野生型核苷酸取代野生型核苷酸，所述方法包含(a)通过将来自所述人类的基因组DNA样本与选自由SEQ ID NO :8及9和SEQ ID NO :10及11组成的群组的寡腺苷酸合成酶基因特异性PCR引物对在PCR缓冲液中组合而形成聚合酶链式反应(PCR)混合物；(b)使PCR混合物经受多个PCR热循环以产生寡腺苷酸合成酶基因扩增产物；和(c)在杂交条件下以选自由SEQ ID NO :12-18组成的群组的探针处理步骤(b)中所产生的产物，从而检测所述突变。本发明也提供一种经分离的OASl抑制剂，其是选自由下列各物组成的群组反义寡核苷酸、核酶、抑制性小RNA(RNAi)、蛋白质、多肽、抗体和小分子。所述经分离的抑制剂可为包含至少15个SEQ ID NO :19序列的连续核酸的反义分子或其互补序列。在其他实施例中，所述经分离的OASl抑制剂(反义分子或其互补序列)在高度严格条件下与SEQ ID NO 19的序列杂交。所述经分离的OASl抑制剂可选自由抗体和抗体片段组成的群组。本发明也提供一种组合物，其包含在医药学上可接受的载剂中的治疗有效量的至少一种OASl抑制剂。本发明也涉及一种抑制哺乳动物细胞中OASl表达的方法，其包含向所述细胞投与选自由下列各物组成的群组的OASl抑制剂反义寡核苷酸、核酶、蛋白质、RNAi、多肽、抗体和小分子。本发明进一步涉及一种抑制受检者中OASl基因表达的方法，其包含向所述受检者投与在医药学上有效的媒剂中的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸的量可有效地与衍生自所述OASl基因的经选定目标核酸序列的全部或部分特异性杂交。本发明又进一步涉及一种预防易受感染的人类受检者中黄病毒感染的方法，其包含向所述人类受检者投与选自由下列各物组成的群组的OASl抑制剂反义寡核苷酸、核酶、RNAi、蛋白质、多肽、抗体和小分子，其中所述OASl抑制剂预防所述黄病毒的感染。本发明又进一步涉及一种预防或治愈易受感染的人类受检者中黄病毒或其他病毒感染的方法，其包含向所述人类受检者投与选自由下列各物组成的群组的OASl抑制剂 反义寡核苷酸、核酶、RNAi、蛋白质、多肽、抗体和小分子，其中所述OASl抑制剂预防所述黄病毒或其他病毒感染且其中所述OASl抑制剂针对一种或一种以上由在NT_009775. 13 的 2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、 2139587、214似94、2144985、2156523、2156595或2156638位置处的突变所界定的蛋白质的特定形式。本发明也进一步涉及一种通过投与具有下列序列的多肽中的一者来预防或治愈易受感染的人类受检者中黄病毒或任何其他病毒感染的方法SEQ ID NO :20, SEQ ID NO 21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ED NO :25、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO 27,SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 33、SEQID NO 34、SEQ IDNO :35、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO 47 和 / 或 SEQ ID NO :48。本发明也涉及人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的治疗。本发明又进一步涉及一种预防人类受检者中的胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)的方法，其包含向所述人类受检者投与选自由下列各物组成的群组的OASl抑制剂反义寡核苷酸、核酶、RNAi、蛋白质、多肽、抗体和小分子，其中所述OASl抑制剂预防IDDM。本发明又进一步涉及一种预防人类受检者中的IDDM的方法，其包含向所述人类受检者投与选自由下列各物组成的群组的OASl抑制剂反义寡核苷酸、核酶、RNAi、蛋白质、多肽、抗体和小分子，其中所述OASl抑制剂预防IDDM且其中所述OASl抑制剂针对一种或一种以上由在 NT_009775. 13 的 2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、 2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、2156523、2156595 或 2156638 位置处的突变所界定的蛋白质的特定形式。本发明又进一步涉及一种通过增加OASl基因表达或通过治疗性投与本文中所揭示的多肽来治疗癌症(诸如前列腺癌)的方法。本发明也提供一种抑制活体外细胞中OASl目标基因表达的方法，其包含将足以抑制OASl目标基因表达的量的核糖核酸(RNA)引入细胞中，其中所述RNA为双股分子，第一股基本上由与OASl目标基因的核苷酸序列对应的核糖核苷酸序列组成，且第二股基本上由与OASl目标基因的核苷酸序列互补的核糖核苷酸序列组成，其中第一与第二核糖核苷酸股为互相杂交而形成所述双股分子的独立互补股，且所述双股分子抑制目标基因的表达。在所述方法的某些实施例中，第一核糖核苷酸序列包含至少20个与OASl目标基因对应的碱基且第二核糖核苷酸序列包含至少20个与OASl目标基因的核苷酸序列互补的碱基。在其他实施例中，目标基因表达被抑制至少10%。在所述方法的其他实施例中，双股核糖核酸结构为长度至少20个碱基且每一核
糖核酸链都能特异性地与超过所述至少20个碱基的OASl目标基因的脱氧核糖核酸链杂 、-父。本发明提供能恢复可能由于基因突变而减弱或失去的OASl功能的多肽或蛋白质。在某些实施例中，所述多肽或蛋白质具有由包含SEQ ID NO :19的基因所编码的野生型 OASl的氨基酸序列。在其他实施例中，其中OASl基因中的突变赋予OASl蛋白增加的活性、 稳定性和/或半衰期或其他使OASl蛋白更适合于抗病毒活性的变化，由经突变的OASl基因所编码的蛋白质或多肽是优选的。任何上述蛋白质和多肽均可作为治疗组合物的组份来提供。本发明也提供由以下各序列组成的蛋白质中的任一者作为治疗组合物的组份的用途SEQ ID NO 20,SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25, SEQ ID UNO 26, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33,SEQ ID NO 34、SEQ ID NO 35,SEQ ID NO 46、SEQ IDNO :47 禾口 / 或 SEQ ID NO: 48。在另一实施例中，编码OASl蛋白、OASl突变型蛋白或OASl多肽的核酸可以基因疗法形式来投与。
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图1是显示OASl基因中本发明突变的位置、等位基因变异体(碱基取代)、基因组序列上突变的座标和(若有的话)NCBI dbSNP ID的表。图 2 (SEQ ID NO 19)是由在 NCBI 登记号 NT_009775. 13 的 2，130，000-2，157，999 位置处的连续核苷酸碱基组成的聚核苷酸序列OASl。图 3 显示 SEQ ID NO 20-64。图4显示高加索群体中OASl基因内的大致单倍体分布。图5A及B阐明本发明所揭示的转录物变异体的种类及其与本发明所揭示的突变的关系。图5A显示转录物变异体(TV)形式1-6，且图5B显示TV形式7-10。图5C进一步阐明黑猩猩和大猩猩变异体相对于人类的推测结构。图6是描述非人类的灵长类相对于人类的OASl基因的突变和在对应人类基因组序列上的突变座标的表。图7表明本发明的例示性多肽当自大肠杆菌表达和回收时的酶活性。图8表明由本发明的聚核苷酸产生的例示性多肽于HeLa细胞中表达时的酶活性。图9表明本发明的例示性多肽的抗体的显影。图10是详述例示性蛋白质转导域多肽的表。
具体实施例方式引言和定义本发明涉及寡腺苷酸合成酶基因的新颖突变、所述突变用于诊断对病毒感染的易感性或抗性的用途、由具有根据本发明的突变的基因所编码的蛋白质和使用所述蛋白质、 抗体及相关核酸预防或抑制病毒感染。所述突变与携带者对黄病毒感染、尤其是C型肝炎病毒感染的抗性有关。许多当前的医学研究集中于鉴别引起或有助于疾病的突变和缺陷。设计所述研究以导致针对病状来治疗的化合物和方法。对于尽管暴露于感染剂及其他危险因素下但仍然使人们保持健康的基因影响的研究则较少关注。本发明表示由发明者所研制的方法的成功应用，由此确定并分析人类受检者的特定群体以便揭示赋予对疾病的抗性的基因变异或突变。对具有对特定疾病或生物学病症的天然抗性的亚群体部分的鉴别使得能进一步鉴别对于药物介入、诊断评估或预防(诸如预防性接种)为适合目标的基因和蛋白质。本文中所鉴别的亚群体部分包含尽管反复暴露于C型肝炎病毒(HCV)下但是仍保持血清阴性而同类者已受感染(血清阳性)的个体。所研究的群体包括经受反复输血的血友病患者，和通过共用的针及其他危险因素而暴露的静脉内药物使用者。HCV感染包括一组共同作用以达成一定感染水平的复杂蛋白质和免疫系统组份， 当所述感染水平引起疾病时，其可于受感染细胞内发展成病毒的低稳态，从而显然允许 HCV逃离宿主免疫监视系统，同时促成病毒持久感染(Dansako等人，Virus Research97 17-30,2003)。本发明集中于这个系统中的一种组份，即可由干扰素诱导的2' -5'-寡腺苷酸合成酶基因，尤其是OASl。OASl基因通过激活核糖核酸酶L (RNase L)以裂解病毒RNA 而于人类宿主细胞的抗病毒活性方面起主要作用。HCV RNA激活2' -5' -OAS/RNaseL途径。如Dansako等人所指出，HCV RNA激活导致病毒RNA裂解的途径可看似矛盾。然而，所述活性可用来保持宿主免疫防御与可杀死宿主的感染水平之间的平衡。鉴于OASl基因的这种复杂作用，本发明已确定OASl基因中的突变与所述突变的携带者中抗HCV感染性之间的强相关性具有显著重要性。现在所述个体的存在可允许阐明尽管反复暴露于感染水平的病毒下但是OASl仍如何有助于对HCV感染产生抗性。这个信息随后将导致开发用于在缺少天然抗性的个体中复制抗性机制的方法和组合物。因此，本发明提供本文中所鉴别的突变无论机制为何均适用于鉴别抗HCV感染的个体。抗性可通过OASl蛋白的功能丧失来产生，在此情况下预测HCV病毒含量将足够高以阻止病毒自宿主免疫监视系统逃离，从而有利于病毒的破坏。抗性也可通过功能的获得而产生，因为OASl蛋白含量增加，蛋白质半衰期增加和/或蛋白质结构以增强其激活核糖核酸酶L裂解病毒RNA的能力的方式受影响。抗性也可通过对OASl蛋白的修饰而产生，所述修饰阻止HCV病毒蛋白或核苷酸对正常OASl蛋白功能的抑制。抗性也可通过对OASl蛋白的修饰而产生，所述修饰阻止蛋白与正常HCV病毒寿命所必需的HCV病毒蛋白或核苷酸之间的相互作用。本发明不受限于一种机制。此外，尽管本文中揭示几种不同的点突变，然而这并非想要表明每一突变对于OASl蛋白结构或功能均具有相同的作用。OASl在由HCV为其中一员的黄病毒家族的其他病毒引起的感染方面起作用。黄病毒家族也包括引起黄热病、登革热、圣路易斯脑炎(St. Louis enc印halitis)、日本脑炎 (Japanese encephalitis)和本文中所揭示的其他病毒疾病的病毒。宿主对于这些病毒的防御包括可由病毒诱导的干扰素。所述干扰素诱导2' -5'-寡腺苷酸合成酶，如上所讨论所述合成酶涉及于RNaseL的活化作用中。RNaseL接着裂解病毒RNA。其他病毒感染可通过本文中所揭示的方法得以预防和/或抑制，包括RSV。关于详细描述和优选实施例，使用下列定义A 腺嘌呤；C 胞嘧啶；G 鸟嘌呤；T 胸腺嘧啶(DNA中)；和U 尿嘧啶(RNA中)等位基因特定基因的DNA序列的变异体。二倍体细胞中最多将存在两个等位基因，其各自位于染色体组的同源染色体的相同的相对位置或基因座上。当位于任一基因座上的等位基因相同时，认为就那个基因座而言个体是纯合的，而当其不同时，认为就那个基因座而言个体是杂合的。因为任一基因的不同等位基因可能仅有单个碱基改变，所以任一基因的等位基因的可能数目十分巨大。当等位基因不同时，一个相对于另一个是显性而另一个则被认为是隐性的。显性是表现型的性质且并不意味隐性等位基因由显性基因导致失活。在许多实例中，正常发挥功能(野生型)的等位基因对于所有或多或少缺陷功能的突变型等位基因均呈显性。在所述情况下，一般的解释是两个功能等位基因中的一个足以产生足够活性的基因产物以支持有机体的正常发育(即基因产物的数量通常存在2倍安全限度)。单倍体许多可能的多个等位基因中的一者，其通过染色体定位而连续排列，且呈现由染色体组的一个特定同源染色体所携带的等位基因组。核苷酸DNA或RNA的单体单元，由糖部分(戊糖)、磷酸酯和含氮杂环碱基组成。 碱基与糖部分经由糖苷碳(戊糖的1'碳)连接，且碱基与糖的所述组合为核苷。当核苷含有键结于戊糖的3'或5'位置的磷酸酯基团时，称其为核苷酸。可经由操作连接的核苷酸的序列于本文中通常称为“碱基序列”或“核苷酸序列”及其合乎文法的等效物，且本文中由自左至右方向为5'-末端至3'-末端的常规定向的式来表示。
碱基对(bp)双股DNA分子中腺嘌呤㈧与胸腺嘧啶⑴的配对或胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的配对。在RNA中，以尿嘧啶⑶替代胸腺嘧啶。当本文中提及RNA时，可互换使用符号T与U来表示处于RNA分子中的特定位置的尿嘧啶。核酸单股或双股的核苷酸聚合物。聚核苷酸单股或双股核苷酸的聚合物。本文中所用的“聚核苷酸”及其合乎文法的等效物包括全部范围的核酸。聚核苷酸通常意指包含两种或两种以上脱氧核糖核苷酸和 /或核糖核苷酸的直链的核酸分子。如此项技术中所熟知的，精确尺寸将取决于许多因素， 而这些因素又取决于最终使用条件。本发明的聚核苷酸包括引物、探针、RNA/DNA节段、寡核苷酸(相对短的聚核苷酸)、基因、载体、质粒等等。RNAi =RNA干扰(RNAi)是一种藉以将干扰性小RNA (siRNA)(通常约21-23个核苷酸长度的双螺旋)引入细胞内，最终导致含有相同或互补序列的目标基因的信使RNA降解并有效地使其沉默的方法。基因其核苷酸序列编码RNA或多肽的核酸。基因可为RNA或DNA。双螺旋DNA 双股核酸分子，其包含两股由一个或一个以上存在于双螺旋碱基对中的每一互补碱基之间的氢键保持在一起的实质上互补的聚核苷酸。由于形成碱基对的核苷酸可为核糖核苷酸碱基或脱氧核糖核苷酸碱基，因此短语“双螺旋DNA”意指包含两股 DNA (ds DNA)的DNA-DNA双螺旋，或包含一股DNA和一股RNA的RNA-DNA双螺旋。互补碱基当DNA或RNA采用双股构型时正常配对的核苷酸。互补核苷酸序列DNA或RNA的单股分子中的核苷酸序列，其与另一单股上的核苷酸序列充分互补，从而以所产生的氢键与其特异性地杂交。保守若核苷酸序列与预选(参考)序列的精确互补序列非随机杂交，则所述核苷酸序列对所述预选序列保守。杂交通过互补碱基对之间建立氢键的使实质上互补的核苷酸序列(核酸链)配对以形成双螺旋或异源双螺旋。其为两条互补聚核苷酸之间可竞争性抑制的特异性(即非随机的)相互作用。核苷酸类似物结构上与A、T、G、C或U不同但足够类似以取代核酸分子中的正常核苷酸的嘌呤或嘧啶核苷酸。DNA同源体具有预选保守核苷酸序列和编码能结合预选配位体的受体的序列的核酸。上游在与DNA转录方向相反的方向上，且因此在非编码链上为自5'至3'行进， 或在mRNA上为自3'至5'行进。下游进一步在序列转录或读取的方向上沿着DNA序列，其沿DNA非编码链的3' 至5'方向行进，或沿RNA转录物的5'至3'方向行进。终止密码子不编码氨基酸而是导致蛋白质合成终止的三个密码子中的任一者。 它们是UAG、UAA及UGA且也称为无义或终止密码子。阅读框转译中使用的邻近核苷酸三联体(密码子)的特定序列。阅读框取决于转译起始密码子的位置。内含子也称为插入序列，其为最初复制入RNA但由最终RNA转录物切除的DNA非编码序列。
本发明的实施模式本发明提供一种用于筛检人类中与对黄病毒感染、尤其是C型肝炎感染的抗性有关的寡腺苷酸合成酶等位基因的新颖方法。本发明是基于所述抗性与寡腺苷酸合成酶基因DNA序列中在编码人类OASl基因的Genbank登记号NT_009775. 13 (SEQ ID NO :19) 的 2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、 2139587、214似94、2144985、2156523、2156595或2156638核苷酸位置处的点突变(碱基取代)有关的发现。本发明揭示鉴别对C型肝炎病毒(HCV)感染具有抗性或部分抗性的受检者群体和进一步鉴别赋予这种有益作用的基因突变的研究结果。鉴别2' -5'-寡腺苷酸合成酶基因中的几种基因突变，其与对HCV感染的抗性显著相关。所使用的研究设计为病例-对照型等位基因关联分析。指定为受检者的病例已经连续证实或推测暴露于HCV，但由于发展对病毒的抗体而经证实并未发展感染(即HCV血清阴性)。对照受检者为连续暴露且血清转变为HCV阳性的受检者。病例和对照受检者募集自三种群体来自加拿大不列颠哥伦比亚省的范库弗峰(Vancouver)的血友病患者；来自法国西北部的血友病患者；和来自西雅图 (Seattle)大都会地区的注射药物使用者。病例和对照的定义在血友病组与注射药物使用者(IDU)组之间不同且是基于文献中所发表的感染风险的流行病学模型和如本文中所述由发明者提出的其他模型。对于血友病群体，使用商业诊断实验室测试证实对照受检者对于HCV抗体呈血清阳性。证实病例受检者为HCV血清阴性、具有低于5%的正常凝血因子且于1987年1月前已经接收浓缩凝血因子。将对照注射药物使用者定义为经证实的HCV血清阳性。将病例注射药物使用者定义为经证实的HCV血清阴性，其注射药物超过10年以上，且据报导其参与一种或一种以上额外的危险行为。额外的危险行为包括与另一名IDU共用注射器、蒸煮锅或棉球。在一特定高加索(Caucasian)群体中有20名病例和42名对照包括于本研究中。病例和对照受检者的选择基本上如美国专利申请案09/707，576中所述使用受感染的有风险(“对照”)和未受感染的有风险(“病例”)群体群组进行。鉴别与HCV感染抗性有关的基因突变的本发明方法包括选择候选基因。调查约 50种在病毒结合至细胞表面、细胞内病毒繁殖、干扰素反应和先天免疫系统方面和抗病毒反应中所涉及的候选基因。通过使用聚合酶链式反应以扩增来自每一受检者的基因组 DNA的目标序列而在病例和对照中为候选基因测序。使用基于荧光的自动化DNA测序法和 ABI3730自动化测序仪来直接测序来自候选基因的PCR产物。鉴别寡腺苷酸合成酶基因(OASl)中的基因突变，其单独或以联合形式与HCV感染抗性显著相关(P < 0. 05)。图1中显示构成这些突变的碱基取代和缺失。OASl基因的变异形式(“0AS1R”)是因本发明突变中的一种或一种以上的存在而产生(确定为SEQID NO 1-7和SEQ ID NO :57-64)。据信OASl基因的这些变异OASlR形式赋予抗病毒感染性。自通过所属领域技术人员已知的期望最大化(Expectation Maximation)方法建立的病例-对照基因型数据计算推测包含多个OASl突变(SEQ ID NO :1_7和SEQ IDNO 57-64)的群体和受检者亲本单倍体(Excoffier 和 Slatkin, Mol. Biol. Evol. 12 :921-927, 1995)。本发明涵盖使用用于单倍体分析的全部范围的OASl突变以及使用出于计算便利的 OASl突变的子集。对单倍体和单倍体子集的分离样式与病例和对照组的比较分析鉴别关于病毒抗性或易感性的特定功效的突变。在一说明性实例中，计算包含多个由SEQ ID NO :2至SEQ ID NO :6确定的OASl 突变的单倍体。通过此分析鉴别高加索人病例和对照群体中的数个单倍体。图4中显示这些单倍体的定义。确定两种常见单倍体(确定为HAPl和HAP2)，其占所推测的单倍体约 85%且处于哈迪-韦伯格(Hardy-Weinberg)平衡中，所述平衡尤其是关于群体中单倍体纯合子的出现。各种人类群体和灵长类中的OASl的进一步分析表明HAP2是遗传的灵长类单倍体，其预先表明旧世纪猴与原始人类的趋异。一种额外的单倍体(确定为HAP； )与这一特定群体中的持久HCV-抗性病例组有关。因此携带HAP3单倍体的受检者处于对HCV感染的实质上较低风险中。HAP3单倍体似乎是经由一系列源自遗传单倍体的复杂重组和突变而出现。与单倍体HAP3高发生率相结合的所述事件的结合少见性表明作出在群体中发展和保持单倍体HAP3的积极选择，其可能随时间推移作为对复发病毒攻毒的反应。在这个实例中，单倍体HAP3是以可评估的群体频率发生的仅有单倍体，其将单一前体RNA中的突变 SEQ ID NO 2的G核苷酸的作用与突变SEQ ID NO 4的A核苷酸的作用相结合。本发明不受限于上述说明性实例。本发明也不受限于提供对特定OASl突变的相关性和效用的了解的其他说明性实例。在另一说明性实例中，SEQ ID NO :2中G核苷酸取代A核苷酸引起所预测的丝氨酸对甘氨酸的氨基酸取代。所属领域技术人员已知的计算预测高度表明丝氨酸是磷酸化作用位点而甘氨酸不会经磷酸化。在另一说明性实例中，突变SEQ ID NO :4中的A核苷酸取代G核苷酸发生于OASl 中的野生型第六外显子的一致剪接受体位点。此取代替代剪接受体辨别信号中所必需的G， 但在这个过程中创造新的剪接识别位点，即一个下游碱基对。因此经突变形式于转译蛋白中创造移码。经突变位点也为较少有效的剪接信号，且因而促进除移码外显子6剪接之外的前体RNA的额外替代性剪接。图5A和5B中提供这些替代性剪接形式的优选实施例。以下提供基因分析的其他说明性实例。OASl转录物变异体的混乱剪接通过来源于自新鲜人血清分离而得的淋巴细胞系和周边血液单核细胞(PBMC)的RNA的逆转录而独立地确定。对来自携带各种单倍体的细胞系和PBMC的逆转录RNA产物的PCR分析表明携带突变SEQ ID NO :4的A核苷酸的RNA 形式导致众多转录物变异体OASlR形式。这些OASlR转录物变异体于图5A及5B中图示描述且包含如图3中所提供的SEQ ID NO 36至SEQ ID NO :47。据信OASl基因的这些变异OASlR形式和相应的转录物变异体编码由SEQ IDNO 20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 27、SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 32、SEQ IDNO 35、SEQ ID N0:46和/或SEQ ID NO :47组成的多肽中的一种或一种以上。单个或多个上述多肽于本文中可互换地称作OASlR多肽或OASlR蛋白。许多上述多肽的共同特征在于其主要在其羧基末端不同而保留氨基末端部分。除其自身替代性转录物的产生之外，基因的OASlR形式也可含有或除去特定序列背景(诸如外显子剪接增强子)，其改变对于特定转录物变异体的选择性优选。此举又引起大量所得蛋白质的相对含量不同。OASl基因的这些变异OASlR形式也可改变所得蛋白质的定位或转译后修饰。所属领域技术人员应了解特定OASl蛋白形式的丰度增加或其他改良其活性、稳定性或可用性的修饰可改良2' -5' -OAS/RNase L途径的总体抗病毒性能。所属领域技术人员同样可了解在特定OASl形式与其他特定OASl形式相比并不有利或甚至不利的情况下，抑制所述特定蛋白的活性或可用性也可改良2' -5' -OAS/RNaseL途径的总体抗病毒性能。不利的OASl蛋白的一实施例为(非局限于)以消除所述特定OASl蛋白的酶活性的方式由病毒蛋白特异性靶向的蛋白。非有利的OASl蛋白的另一实施例为具有与其他活性形式聚合的较低酶活性因此降低或消除聚合蛋白的总酶活性(且因而降低总体抗病毒效果)的蛋白。上述机制中的一种或一种以上可有助于对病毒感染产生抗性。然而，本发明不受限于所揭示的变异聚核苷酸或多肽的特定作用机制。因此，本发明提供人类2' -5'-寡腺苷酸合成酶基因的新颖形式、新颖mRNA转录物和相关蛋白质。本发明也揭示新颖mRNA转录物和新颖蛋白质的效用。这些新颖形式的特征在于基因中存在公共数据库中未揭示的数种罕见基因突变或单倍体中的一种或一种以上。OASl的这些新颖形式OASlR赋予携带者对C型肝炎病毒和相关黄病毒一定程度的抗性，所述相关黄病毒包括(但不限于)西尼罗河病毒(West Nile virus)、登革热病毒、 黄热病病毒、蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus)、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、墨累谷病毒(Murray Valley virus)、玻瓦桑病毒(Powassan virus)、罗西奥病毒(Rocio virus)、跳跃病病毒(louping-ill virus)、班奇病毒(Banzi virus)、伊列乌斯病毒(Ilheus virus)、禾斗禾斗贝拉病毒(Kokobera virus)、昆金病毒(Kunjin virus)、沃父病毒(Alfuy virus)、牛痢疾病毒禾口卡萨诺尔森林病病毒(Kyasanur forest diseasevirus)。 OAS蛋白也已显示其在实验性呼吸融合病毒和小核糖核酸病毒细胞培养物感染系统的感染减弱中是重要的。已将受人类免疫缺陷病毒-I(HIV-I)感染的细胞无法释放病毒与高浓度的OAS和/或2-5A联系起来。此外，HIV-I反式激活蛋白(tat)已显示阻断OAS的活化 (Muller 等人，J Biol Chem. 1990Mar 5 ；265 (7) :3803-8)，因而表明 OAS 的新颖形式可避开 HIV-I防御机制且提供有效的治疗。因此本文中所揭示的这些OASl的0AS1R形式也可赋予对这些非黄病毒感染剂的抗性。本发明也提供对OASl的黑猩猩(Pan troglodytes)和大猩猩(Gorilla gorilla) 形式的新颖描述，每一形式均导致具有效用的新颖mRNA和多肽。虽然基因在关系密切的灵长类(诸如人类、黑猩猩和大猩猩)中通常高度保守，但是观察到三种物种之间OASl的重要差异。最亲的人类亲属黑猩猩在OASl外显子5中具有单个碱基取代(位于相当于人类 NT_009775. 13中的2，142，351的位点且由SEQ ID NO :53所界定)，其导致生成截短型蛋白质产物。黑猩猩OASl多肽和mRNA序列分别由SEQ ID NO 51和SEQ IDNO 55提供。大猩猩也在靠近受体剪接位点的外显子6中具有两碱基对缺失(位于相当于人类NT_009775. 13 中的2，144，089-2，144，090的位点且由SEQ ID NO 54所界定)，其导致转译提前终止。大猩猩部分多肽和部分mRNA序列分别由SEQ ID N0:52和SEQ IDNO :56提供。图5C中提供相对于人类的黑猩猩和大猩猩转录物的推测结构。这些情况中的每一种(类似于人类0AS1R 多肽)均具有高度保守的多肽序列，其在羧基末端尾部的结构和内容物方面最显著不同。 这些多肽的共有氨基末端部分含有先前证实为OASl酶活性所必需的所有元件。由于黑猩猩和大猩猩已经受与非洲人的病毒攻毒类似的病毒攻毒，因此这些不同但功能上类似的灵长类变异体的流行提供进一步证据表明较长OASl形式的羧基末端部分对于病毒攻毒后的继续存活为非必要或甚至不利的。黑猩猩具有OASl多肽的完全截短(其与人类转录物变异体的异质性相对)的事实与以下观察相一致尽管黑猩猩为已知的易受HCV感染的仅有其他灵长类，但黑猩猩确实具有相对于人类的非典型性感染，其特征为病毒清除频率增加和不导致纤维化或肝细胞癌。每一新颖OASlR cDNA都是克隆自携带这些突变的人类受检者。克隆是通过标准 cDNA克隆方法进行，这些方法包括自细胞或组织分离RNAjf RNA转化为cDNA和将cDNA转化为适于克隆的双股DNA。正如所属领域技术人员将认识到的，所有这些步骤都是常规分子生物学分析。其他方法包括使用逆转录酶PCR、5' RACE(cDNA末端快速扩增)或传统的 cDNA文库构建和Southern杂交筛检。本文中所述的所有OASlR等位基因都是自患者携带者回收。对每一新近克隆的OASlR cDNA测序以确定其身份且鉴别相对于野生型的任何额外序列差异。新颖OASlR基因突变可通过改变所得OASl mRNA的性质而影响对病毒感染的抗性。因此，评估OASlR等位基因携带者与纯合野生型受检者之间的mRNA稳定性差异。使用包括Taqman 和简单Northern杂交法的已知分析来评估并比较RNA稳定性。这些构成分子生物学中的常规方法。OASlR突变可通过改变OASl基因的调控来影响感染抗性。已知OAS基因的表达是由干扰素治疗诱导且于病毒感染期间诱导。OASlR等位基因可经由组成性表达、过度表达或其他不受调控型表达来赋予对病毒感染的抗性。使用数种方法评估具有或不具有干扰素或病毒刺激的基因表达。这些方法包括表达微阵列分析、Northern杂交法、Taqman 及其他方法。自已知表达OAS基因的组织(诸如周边血液单核细胞)采集样本。比较来自 0AS1R携带者和非携带者的组织之间的基因表达。在一实施例中，自携带者和非携带者采集周边血液单核细胞，在培养物中繁殖且由干扰素刺激。将干扰素诱导期间0AS1R等位基因的表达水平与野生型等位基因进行比较。在另一实施例中，以干扰素治疗人类受检者并评估0AS1R突变的携带者中相对于非携带者中的OASl基因的诱导程度。正如所属领域技术人员可了解，将组织、实验设计和分析方法的许多组合用于评估0AS1R基因调控。一旦对每一 0AS1R的新颖cDNA进行克隆，即可使用众多不同的已知表达克隆系统中的任一种将其用于制备重组0AS1R蛋白。在此方法的一实施例中，0AS1R cDNA是通过标准分子生物学方法克隆至大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体中邻近于含有编码聚组氨酸多肽的DNA序列的附加表位。随后使用固定化金属亲和色谱法或类似方法自大肠杆菌溶解产物纯化重组蛋白。所属领域技术人员将认识到有许多可用于纯化重组蛋白的不同表达载体和宿主细胞，包括(但不限于)酵母表达系统、杆状病毒表达系统、中国仓鼠卵巢细胞等等。使用计算方法鉴别来自0AS1R蛋白的短肽序列，其独特地将这些蛋白与野生型 OASl蛋白区别开来。各种计算方法和市售软件包可用于肽选择。可使用FMOC肽合成化学或类似方法制备这些经计算选择的肽序列。所属领域技术人员将认识到有大量用于根据所供应序列合成短多肽的化学方法。可使用来自0AS1R基因的肽片段和重组蛋白开发对此基因产物呈特异性的抗体。 正如所属领域技术人员将认识到的，存在大量用于抗体开发的方法，包括使用多个不同的宿主有机体、佐剂等等。在一经典实施例中，将少量(150微克)纯化重组蛋白皮下注射入新西兰白兔(New Zealand White Rabbit)背部，随后每几个月注射类似数量作为辅助剂。 随后通过静脉穿刺收集兔血清并可收集血清、纯化IgG或对免疫蛋白呈特异性的亲和纯化抗体。正如所属领域技术人员将认识到的，可使用类似方法开发大鼠、小鼠、山羊及其他有机体中的抗体。也可使用如上所述的肽片段开发对OASlR蛋白呈特异性的抗体。单克隆抗体和多克隆抗体的开发都适于实施本发明。可通过标准分子技术产生分泌OASlR蛋白的特异性单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞系。可使用如上所述制备的抗体开发用于评估细胞、组织和有机体中OASlR蛋白的存在或不存在的诊断方法。在此方法的一实施例中，可使用经纯化的重组OASlR蛋白和特异性抗体开发酶联免疫吸附分析以检测人类血清中的这些蛋白。可使用这些诊断方法验证上述基因突变的携带者和非携带者的组织中OASlR蛋白的存在或不存在。也可使用如上所述制备的抗体自那些携带这些突变的患者纯化天然OASlR蛋白。 对于使用抗体自人类细胞和组织纯化天然蛋白有大量方法可利用。在一实施例中，抗体可用于包括均质化人类组织和使用蛋白A捕捉抗体的免疫沉淀实验中。这个方法能够浓缩且进一步评估突变型OASlR蛋白。可利用许多其他用于分离OASlR的天然形式的方法，包括柱色谱法、亲和色谱法、高压液相色谱法、盐析法、透析法、电泳法、等电聚焦法、差速离心法寸寸。使用蛋白质体方法评估OASlR突变对二级、三级和四级蛋白质结构的影响。也使用蛋白质体方法评估OASlR突变对OAS蛋白的转译后修饰的影响。存在许多已知可能的蛋白质转译后修饰，包括蛋白酶裂解、糖基化、磷酸化、硫酸化、加入化学基团或复合分子等等。评估二级和三级蛋白质结构的一般方法为核磁共振(NMR)光谱法。使用NMR探测野生型OASl蛋白与OASlR蛋白之间二级和三级结构的差异。传统NMR的修改方案也是适合的，包括评估功能位点活性的方法，包括核转移欧佛豪瑟光谱法(TrNOESY)等等。正如所属领域技术人员将认识到的，可采用此方法和用于结果的数据解释的方法的许多微小修改方案。所有这些方法都意欲包括于本发明的实施之中。使用通过结晶和X光衍射来确定蛋白质结构的其他方法。也可使用质谱法评估突变型与野生型OAS蛋白之间的差异。可使用此方法评估结构差异以及蛋白质转译后修饰的差异。在此方法的一典型实施例中，使用上述方法中的一种自人类周边血液单核细胞纯化野生型OASl蛋白和突变型OASlR蛋白。这些细胞可如上所述经干扰素刺激以增加OAS蛋白的表达。以特异性蛋白酶(诸如胰蛋白酶)消化经纯化蛋白并使用质谱法评估。正如所属领域技术人员将认识到的，也可使用许多替代方法。本发明涵盖这些额外的替代方法。例如，可使用基质辅助激光解吸附/电离法(MALDI)或电喷雾电离(ESI)质谱法。此外，质谱法可与细胞蛋白的二维凝胶电泳分离法联用以作为对综合预纯化法的替代。质谱法也可与肽指纹数据库和各种检索算法联用。也可通过质谱法与各种预处理(诸如以糖基化酶及磷酸酶预处理)联用来探测转译后修饰(诸如磷酸化或糖基化作用)的差异。将所有这些方法都视为本申请案的一部分。OASl为四聚物形式时有活性，且干扰自身缔合的突变影响酶活性。使用已知方法评估OASlR突变对四聚物形成的影响。例如，以OASl和OASlR特异性抗体进行免疫沉淀以自患者细胞、细胞培养物或过度表达OASl或OASlR的经转染细胞分离0AS1/0AS1R复合物。 随后可通过凝胶电泳法或所属领域技术人员熟知的其他色谱方法来评估这些复合物。OASl可通过与其他蛋白相互作用而赋予抗病毒性。酶含有与bcl-2家族的BH3域在结构上同源的区。此域可能对OASl的功能是关键性的。根据本发明，可使用OASl特异性抗体分离蛋白复合物，包括来自如上讨论的各种来源的OASl蛋白。随后可通过凝胶电泳法评估这些复合物以分离相互作用的复合物的成员。可使用包括Western印迹法的许多方法探测凝胶，且可使用肽测序法分离并鉴别新颖的相互作用的蛋白质。也将评估野生型与 OASlR提取物中OAS复合物含量的差异。正如所属领域技术人员将认识到的，所述方法仅为许多可用于纯化、鉴别和评估OAS复合物中相互作用的蛋白质的不同方法中的一些。额外方法包括(但不限于)噬菌体展示技术和使用酵母双杂交体方法。已知OASl与C型肝炎病毒NS5A蛋白相互作用(Taguchi，T.等人，J. Gen. Virol. 85 :959-969, 2004)。不受机制的约束，本发明因此涉及不与NS5A蛋白相互作用的 OASl蛋白，其中所述蛋白为本发明的多肽，其由本发明的聚核苷酸表达、由OASl的剪接变异体所编码的mRNA表达、由含有至少一个本发明的突变的OASl聚核苷酸表达、由编码区内具有至少一个突变的OASl聚核苷酸表达和/或由具有至少一个碱基取代、缺失或添加的 OASl聚核苷酸表达，其中与NS5A蛋白的结合被改变或阻碍。NS5A蛋白可通过抑制干扰素的抗病毒活性而发挥生物学活性。当干扰素在诸如双股RNA的辅因子的存在下刺激OASl活性时，此抗病毒活性处于一正常实施的模型中。OASl 使ATP聚合成2' -5'-连接的寡腺苷酸，其激活RNase L以裂解包括mRNA的单股RNA。 NS5A与OASl的结合可抑制其活性，因此抑制或阻碍将另外导致病毒RNA破坏的活性级联。尽管本发明并非取决于此模型，但是NS5A与OASl的结合与其中OASl的突变形式避免NS5A结合和抑制且因而能够实现聚合ATP的正常功能的模型相一致。在与本文中所述的临床结果相一致的这些情况下，携带这一突变的人对C型肝炎病毒感染存在抗性。类似地，如上所揭示黑猩猩所具有的OASl的截短形式可避开与NS5A或其他病毒蛋白结合且因此可观察到更高的黑猩猩病毒清除频率。在某些情况下突变可直接影响OASl用于NS5A 的结合位点。在其他情况下，突变可位于与实际结合位点分开的位点，但引起构象改变使得 OASl与NS5A的结合受到抑制、减慢或阻止。因此OASl与NS5A以生理学和病理学上相关方式的结合提供用于分析OASl聚核苷酸中碱基突变、缺失或添加对所编码的OASl蛋白的生物学功能的影响的客观测试。 以此项技术中已知的方式分析所述结合。在一诸如Taguchi，T.等人(J. Gen. Virol. 85 959-969，2004)所述之例示性而非限制性方法中，HeLa细胞经编码GST标记的NS5A和HA 标记的OASl的表达质粒瞬时转染。此实例中的OASl意指根据本发明的0AS1，包括由OASl 的剪接变异体、由在编码区内具有至少一个突变的OASl聚核苷酸和/或由具有至少一个碱基取代、缺失或添加的OASl聚核苷酸所编码的0AS1。在诸如12-16小时的适当培育时间之后，将细胞洗涤、溶解并离心，并将所得上清液与结合谷胱甘肽的琼脂糖(kpharose)珠粒混合，此举有助于分离经GST标记的蛋白。通过使用并成像抗NS5A的抗体和抗HA抗体来鉴别经GST标记的NS5A与经HA标记的OASl蛋白的复合物。此方法的变型包括对个别蛋白使用其他标记，诸如FLAG-标记。在本发明上下文中，主要变数为OASl蛋白或多肽。使用这些分析法客观地测试OASl蛋白或多肽进行一个生物学相关活动(即结合至已知对于病毒在宿主中复制的能力具有保护性的C型肝炎蛋白)的能力。未与NS5A结合的OASl蛋白和多肽是作为治疗性蛋白的合适候选者。OASl蛋白是催化ATP转化为寡腺苷酸分子的酶。可利用数种方法来评估OASl酶的活性。使用这些方法来确定0AS1R突变对突变型蛋白相对于野生型酶的活性的影响。例如，可通过量化并入聚腺苷酸中的经32P放射性同位素标记的ATP来测量寡腺苷酸合成活性。可通过包括电泳法或离子交换色谱法的许多色谱方法对经放射性同位素标记的聚腺苷酸的长度进行量化及表征。这些分析也能够表征底物(ATP)结合和酶动力学。OASl是由 dsRNA激活。使用本文中所述的活性分析和此项技术中所述的合成dsRNA来分析OASl中此活化作用的动力学并与OASlR作比较。通过这些和此项技术中已知的其他方法证实本发明的多肽具有寡腺苷酸合成活性。图7和图8证实本发明的数种例示性多肽的活性。不管其活性的量化水平为何，这种产生2' -5'-寡腺苷酸的能力经由RNaseL的活化而产生抗病毒效果都为所属领域技术人员所十分了解。同样，本发明的多肽具有寡腺苷酸合成活性的纯粹事实表明所述多肽尤其是因为其于以下揭示的治疗用途而具有效用。执行生物学研究以评估OASlR突变基因使得免受病毒感染的程度。这些生物学研究一般采用以下形式将突变型OASlR基因或蛋白引入细胞或整个有机体中，并相对于野生型对照物评估其生物学及抗病毒活性。在此方法的一典型实施例中，通过将如本文中所述经分离的cDNA克隆到哺乳动物表达载体(所述载体驱动所克隆的cDNA自SV40启动子序列表达)中，从而将OASlR基因引入培养物中的非洲绿猴肾(Vero)细胞中。此载体也含有 SV40和细胞巨化病毒增强子元件，其允许OASlR基因和用于在培养物中选择的新霉素抗性基因的有效表达。随后可评估在感染登革热病毒的Vero细胞中OASlR表达的生物学作用。 在OASlR赋予对多种黄病毒的广泛抗性的情况下，将预期到表达这些OASl突变形式的细胞系中的病毒繁殖相对于野生型有所减少。正如所属领域技术人员将认识到的，有多种不同实验方法可用于评估细胞和有机体中对不同感染剂有反应的OASlR基因及蛋白的生物学效应。例如，在以上实例中，不同的表达载体、细胞类型和病毒物种可用于评估OASlR抗性效应。相对于细胞系评估培养物中的初级人类细胞。在病毒引入前，细胞可由双股RNA或干扰素刺激。可评估含有替代启动子和增强子序列的表达载体。评估除黄病毒之外的病毒 (例如呼吸融合病毒和小核糖核酸病毒)。开发转基因动物模型以评定OASl的突变形式在保护整个有机体不受病毒感染方面的适用性。在一实施例中，将OASlR基因引入易受黄病毒感染的小鼠的基因组中(例如 C3H/He近交系实验室菌株)。评估这些OASlR基因于易受感染的小鼠中调节感染或赋予感染抗性的能力。正如所属领域技术人员将了解的，可使用许多标准方法将转基因人类OASlR 基因引入小鼠中。这些方法可与影响组织特异性表达样式或允许经由引入内源性化学品、 使用可诱导性或组织特异性启动子等来调控转基因的其他方法联合。作为C型肝炎感染的模型，评估表达OASlR基因的细胞系对牛痢疾病毒(BVDV) 感染的易感性、抗性或调节。BVDV是用于测试潜在抗HCV抗病毒药物的功效的常用模型 (Buckwold等人，Antiviral Research 60 :1-15,2003) 在一实施例中，可使用基本上如上所述的表达载体将OASlR基因引入KL(小牛肺)细胞中并测试其于此细胞系中调节BVDV感染的能力。此外，也可对HCV感染的小鼠模型(例如，人肝脏移植入小鼠中、人肝细胞注入小鼠肝脏中等等)评估OASlR基因的转基因组中HCV感染的改变。可进行实验由此在HCV 病毒培养系统中评定OASlR基因的表达效果。也可使用细胞培养系统来评定突变型OASlR基因在不同条件下在促进细胞凋亡方面的影响。在一实施例中，可相对于野生型OASl序列评定OASlR的细胞培养突变形式在受包括BVDV、HCV及其他黄病毒的许多病毒所感染的细胞中促进细胞凋亡的能力。正如所属领域技术人员将认识到的，可利用许多方法测量细胞凋亡。最常用的方法包括联合使用荧光结合方法与琼脂糖凝胶电泳法检测凋亡细胞中的特征性基因组“DNA阶梯(DNA laddering)，，效应。可在细胞培养物和小动物模型中测试缺陷型干扰病毒增强OASlR突变形式的效应的能力。也可检测OASlR基因型的存在或不存在影响其他人类表现型的程度。例如，评估 OASlR突变在感染HCV的受检者中与病毒滴度和自发病毒清除的相关性。也可采取将宿主 OASl基因型与其他黄病毒感染的过程相联系的类似方法。也检测在感染HCV的患者中干扰素治疗或干扰素与病毒唑(rikwirin)治疗期间OASlR突变在促进成功结果方面的影响。 这些突变不仅可赋予一定程度的感染抗性，而且也促进经或未经干扰素-病毒唑治疗的受感染受检者中的自发病毒清除。此外，已报导精神分裂症在黄病毒感染具地域性的地理区域发生频率较高，表明黄病毒抗性等位基因与易患精神分裂症的体质之间存在联系。通过进行额外的涉及精神分裂症表现型和OASlR突变的基因关联性研究来评估此联系。也将评估OASlR突变对IDDM、前列腺癌及其他癌症及精神分裂症的易感性的影响。本发明揭示新颖且具有效用的OASlR变异型mRNA(确定为SEQ ID N0:36至SEQID N0:43)。本发明不受限于所揭示的变异型mRNA的使用模式。在一优选实施例中，这些变异型mRNA是用于差别筛检人类受检者增加或降低的病毒(包括HCV)易感性。在其他优选实施例中，这些变异型mRNA适用于筛检对IDDM、前列腺癌及其他癌症和/或精神分裂症的易感性。通过所属领域技术人员已知的表达分析执行所述差别筛检以测定一种或一种以上存在于来源于给定人类受检者的样本中的变异型OASlR mRNA的相对量。相对于对照样本而言，人类受检者样本中一种或一种以上OASlR mRNA变异体的量增加或降低表明受检者易感染病毒、IDDM、前列腺癌及其他癌症和/或精神分裂症的程度，此适于所考虑的测试。如本文中所讨论，2' ,5'-寡腺苷酸合成酶(OAS)为IFN- α诱导性、RNA依赖性效应分子酶家族，其自ATP合成短的2'至5'连接的寡腺苷酸0-5Α)分子。OAS酶构成对病毒感染的非特异性免疫防御的重要部分且已用作病毒感染的细胞标记物。除在本文中所讨论的C型肝炎感染中的作用外，在其他病状、尤其是那些其中病毒感染起作用的病状中也涉及OAS活性。虽然当前分析的主题为特异性致病机制，但是据信病毒感染在诸如糖尿病的疾病的发展中起作用。1型糖尿病患者中淋巴细胞OAS活性显著提高，表明OAS可能为病毒感染与疾病发展之间的重要联系。在涉及来自单卵双生对的糖尿病双胞胎的研究中， Bonnevie-Nielsen 等人(Clin Immunol. 2000Jul ；96(1) :11-8)显示 OAS 在新近发作和长期存在的1型糖尿病中均得以持久激活。1型糖尿病中连续升高的OAS活性与正常抗病毒反应明显不同且可能表示酶的慢性刺激、下调机制的失效或对内源性或外源性病毒或其产物的异常反应。病毒感染与糖尿病发展之间更直接的联系由许多研究加以例证，这些研究显示介于13%与33%之间的慢性C型肝炎患者患有糖尿病O型糖尿病)，此水平与匹配的健康对照或慢性B型肝炎患者相比显著增加(Knobler等人，Am J Gastroenterol. 2003Dec ； 98(12) :2751-6)。虽然迄今为止尚未报导OAS对在C型肝炎感染之后发展成糖尿病起作
19用，但是其可为用于抗病毒反应系统的有用标记物。此外，根据本发明所报导的结果说明， 若C型肝炎感染与糖尿病有因果关系，则使用本文中所揭示的组合物和方法抑制或消除C 型肝炎感染可有利于预防或减轻糖尿病的发展。另一公开研究已显示OAS在伤口痊愈及其病理学病症方面、尤其是在静脉溃疡和与糖尿病相关的不易痊愈伤口的情况下起本质作用(W0 02/090552)。在不易痊愈伤口的情况下，受感染组织中OAS mRNA含量减少，而不是象在来源于1型糖尿病患者的淋巴细胞中那样升高。这些发现针对OAS作为糖尿病和与糖尿病相关的伤口痊愈中的免疫反应的病因学上的重要标记物。OAS也可在前列腺癌中所涉及的细胞过程中起中间物作用。OAS的主要生物学功能为促进RNaseL的活性，RNase L是一种由2_5A分子进行酶刺激的受独特调控的核糖核酸内切酶。RNaseL在调节IFN的抗病毒效应上具有非常确实的作用，且为遗传性前列腺癌 1等位基因(HPCl)的强力候选物。已显示RNaseL中的突变倾向于增加男性中的前列腺癌发病率，在某些情况中其表现为与非RNaseL相关病例相比更具侵袭性的疾病和/或发作年龄降低。Xiang 等人(Cancer Res. 20030ct 15 ；63 (20) :6795-801)证实 2-5A 的生物稳定性硫代磷酸酯类似物诱导RNaseL活性并引起晚期转移性人类前列腺癌细胞系培养物中的细胞凋亡。他们的发现表明同时伴随2-5A含量增加的OAS活性提高可经由有效的细胞凋亡途径而有利于癌细胞的毁灭。因此，本文中所揭示的组合物和方法的使用可在前列腺癌的检测、治疗和/或预防中具有效用。另外OAS可通过其对RNaseL的调控或经由另一尚未发现的途径而在正常细胞生长调控中起作用。有大量证据支持OAS在负调控细胞生长中的重要性。Rysiecki等人 (J. Interferon Res. 1989Dec ；9(6) :649-57)证实人类OAS至神经胶母细胞瘤细胞系中的稳定转染导致细胞增殖减少。在几项将静止细胞系与增殖细胞系相比的研究中OAS含量也已显示为可测量的(例如 Hassel 和 Ts' 0,Mol Carcinog. 1992 ；5(1) :41-51 及 Kimchi 等人，Eur J Biochem. 1981 ；114(1) :5_10)且在每一情况下OAS含量均为在静止细胞中最高。其他研究已显示OAS含量与细胞周期阶段之间的相关性，其中OAS含量在后S阶段急剧上升而接着在 G2 阶段突然下降(Wells 和 Mallucci，Exp Cell Res. 1985Jul ； 159(1) 27-36)。几项研究已显示在经各种形式的干扰素刺激后OAS诱导作用与抗增殖效应发作之间的相关性(参见 Player 和 iTorrence, Pharmacol Ther. 1998May ；78 (2) :55-113)。细胞分化期间也显示出OAS的诱导作用(例如Mlzberg等人，J Cell Sci. 1996Jun ； 109(Pt6) 1517-26和 Nil son，Mol Cell Biol. 1989Sep ；9 (9) :3897-903)。关于 OAS 由血小板衍生生长因子(PDGF) (Zullo等人，Cell. 1985Dec ；43(3Pt 2) :793-800)在热休克诱导生长条件下(Chousterman 等人，J Biol Chem. 1987Apr 5 ；262(10) :4806-11)诱导的其他报导导致以下假设0AS的诱导作用为正常细胞生长控制机制。因此，本文中所揭示的组合物和方法的使用可在癌症的检测、治疗和/或预防中具有广泛效用。聚核苷酸分析寡腺苷酸合成酶基因是一种核酸，其核苷酸序列编码寡腺苷酸合成酶、突变型寡腺苷酸合成酶或寡腺苷酸合成酶假基因。其可呈基因组DNA、mRNA或cDNA形式，且呈单股或双股形式。优选使用基因组DNA，因为其相对于mRNA而言在生物学样本中具有相对稳定性。 在序列表中以SEQ ID NO :19提供由参考寡腺苷酸合成酶基因的完整基因组序列的连续核苷酸2，130, 000-2, 157，999组成的聚核苷酸序列，且对应于Genbank登记号NT_009775. 13。自细胞(通常为周边血液白细胞)获得核酸样本。在使用mRNA时，于RNase抑制条件下溶解细胞。在一实施例中，第一步为分离总细胞mRNA。随后可通过与寡聚dT纤维素柱杂交来选择Poly A+mRNA。在一优选实施例中，富集核酸样本以获得寡腺苷酸合成酶等位基因物质。通常通过使用如本文中所述的聚核苷酸合成引物使基因组DNA或mRNA经受引物延伸反应来实现富集。用于产生待分析样本的尤其优选方法为在聚合酶链式反应(PCR)中使用预选的聚核苷酸作为引物以形成扩增(PCR)产物。聚核苷酸引物的制备将本文中关于欲通过引物延伸而合成的引物、探针和核酸片段或节段所使用的术语“聚核苷酸”定义为包含两种或两种以上、优选为三种以上脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。其精确大小将取决于许多因素，这些因素又取决于最终使用条件。本文中所用的术语“引物”意指自核酸限制性消化纯化或由合成产生的聚核苷酸， 当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下(即在核苷酸和诸如DNA聚合酶、逆转录酶等等的聚合剂存在下且在合适温度和PH下)时，其能够充当核酸合成的起始点。引物优选为单股以达成最大效率，但或者可呈双股形式。若引物为双股，则在用于制备延伸产物之前首先对其加以处理以与其互补股分离。引物优选为聚脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在聚合剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的精确长度将取决于许多因素，包括温度和引物的来源。例如，视目标序列的复杂性而定，聚核苷酸引物通常含有15至 25个或更多核苷酸，虽然其也可含有较少的核苷酸。短引物分子一般需要较低温度以与模板形成足够稳定的杂交体复合物。选择本文中所用的引物以与待合成或扩增的每一特定序列的不同链“实质上”互补。此意谓引物必须充分互补以与其各自的模板链非随机杂交。因此，引物序列可能反映或可能不反映模板的精确序列。例如，非互补核苷酸片段可连接于引物的5'末端，而引物序列的剩余部分与所述链实质上互补。这些非互补片段通常编码核酸内切酶限制性位点。 或者，非互补碱基或更长序列可引入引物中，条件是引物序列具有与待合成或扩增的链序列的足够互补性以与其非随机杂交且因而在聚核苷酸合成条件下形成延伸产物。本发明的引物也可含有DNA依赖性RNA聚合酶启动子序列或其互补序列。例如参见 Krieg 等人，Nucl. Acids Res.，12 :7057-70 (1984) ；Studier 等人，J. Mol. Biol.，189 113-130(1986)；和 Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第二版，Maniatis 等人编， Cold SpringHarbor, N.Y. (1989)。当使用含DNA依赖性RNA聚合酶启动子的引物时，所述引物与待扩增的聚核苷酸链杂交且使用诸如大肠杆菌DNA聚合酶I或大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段的诱导剂完成DNA依赖性RNA聚合酶启动子的第二聚核苷酸链。起始聚核苷酸通过RNA聚核苷酸产生与DNA聚核苷酸产生之间交替来扩增。引物也可含有用于RNA指导的RNA聚合酶的模板序列或复制起始位点。典型的 RNA 指导的 RNA 聚合酶包括由 Lizardi 等人，Biotechnology, 6 :1197-1202(1988)描述的 QB复制酶。RNA指导的聚合酶自少量含有模板序列或复制起始位点的模板RNA链生成大量 RNA链。如Kramer等人，J. Mol. Biol.，89 :719-736 (1974)已描述，这些聚合酶通常使模板链扩增一百万倍。可使用任何合适方法制备聚核苷酸引物，诸如磷酸三酯法或磷酸二酯法，参见 Narang 等人，Meth. Enzymol. ,68 :90，(1979)；美国专利第 4，356，270 号、第 4，458，066 号、 第 4，416，988 号、第 4，293，652 号；和 Brown 等人，Meth. Enzymol. ,68 :109(1979)。引物的核苷酸序列的选择取决于下列因素诸如自杂交点至编码待检测突变的区的核酸距离、核酸上相对于任何待使用的第二引物的杂交位点等等。若通过PCR扩增来富集核酸样本以获得寡腺苷酸合成酶基因物质，则必须使用两个引物(即PCR引物对)以用于待扩增核酸的每一编码链。第一引物成为非编码(反义或负或互补)链的一部分且与正链或编码链上的核苷酸序列杂交。第二引物成为编码(有义或正)链的一部分且与负链或非编码链上的核苷酸序列杂交。第一和第二引物中的一者或两者可含有界定核酸内切酶识别位点的核苷酸序列。所述位点可与正在扩增的寡腺苷酸合成酶基因异源。在一实施例中，本发明使用一组形成具有位于引物3'-末端的引发区的引物的聚核苷酸。引发区通常为3'-端(3'-末端)15至30个核苷酸碱基。每一引物的3'-末端引发部分均能作为引物以催化核酸合成，即引发自其3'末端起始的引物延伸反应。引物中的一者或两者可另外含有5'-末端(5'-端)非引发部分，即不参与与优选模板杂交的区。在PCR中，每一引物与第二引物一起发挥作用以扩增目标核酸序列。用于PCR中的PCR引物对的选择是由如本文中对于生成寡腺苷酸合成酶基因区所讨论的考虑因素来决定。当选择引物序列以与寡腺苷酸合成酶基因等位基因内含子内的目标序列杂交(退火)时，目标序列在等位基因中应为保守的以确保产生待分析的目标序列。聚合酶链式反应寡腺苷酸合成酶基因包含聚核苷酸编码链，诸如mRNA和/或基因组DNA的有义链。若待分析的遗传物质呈双股基因组DNA的形式，则通常通过熔融首先将其变性成为单股。通过以PCR引物对处理(接触)样本而使核酸经受PCR反应，引物对中的每一成员具有经预选的核苷酸序列。PCR引物对能够通过与长度优选为至少约10个核苷酸、更优选为至少约20个核苷酸且在寡腺苷酸合成酶等位基因内为保守的核苷酸序列杂交来引发引物延伸反应。PCR引物对的第一引物在本文中有时称为“反义引物”，因为其与核酸的非编码链或反义链(即编码链的互补链)杂交。PCR引物对的第二引物在本文中有时称为“有义引物”，因为其与核酸的编码链或有义链杂交。通过将PCR引物对(优选为其预定量)与样本核酸(优选为其预定量)在PCR缓冲液中混合以形成PCR反应混合物来进行PCR反应。将所述混合物热循环足以形成PCR反应产物的若干周期(通常为预定的)，从而富集待分析样本以获得寡腺苷酸合成酶遗传物质。PCR通常通过热循环进行，即在下限为约30摄氏度(30°C )至约55°C和上限为约 90°C至约100°C的温度范围内重复增加及降低PCR反应混合物的温度。所述增加及降低可是连续的，但优选为在每一有利于聚核苷酸合成、变性和杂交的温度下具有相对温度稳定性时期的时相。在每一扩增中均可使用多个第一引物和/或多个第二引物，例如，一类第一引物可与许多不同的第二引物配对以形成几种不同的引物对。或者，可使用第一与第二引物的个别对。在任何情况下，均可将使用第一引物与第二引物的相同或不同组合所扩增的扩增产物组合用于分析突变。使用任何合适方法进行PCR反应。其一般于pH值优选为7-9、最优选为约8的缓冲水溶液(即PCR缓冲液)中发生。优选地，将摩尔过量(对于基因组核酸而言，通常引物模板约为IO6 1)的引物与含有模板链的缓冲液混合。优选为大量摩尔过量以提高过程的效率。PCR缓冲液也含有三磷酸脱氧核糖核苷酸(聚核苷酸合成底物)dATP、dCTP、dGTP 和dTTP和通常热稳定的聚合酶，所有物质均为用于引物延伸(聚核苷酸合成)反应的足够量。将所得溶液(PCR混合物)加热至约90°C -100°C历时约1至10分钟，优选为1至4分钟。在此加热时期之后，将溶液冷却至M°C，此温度对于引物杂交是优选的。合成反应可在室温至超过聚合酶(诱导剂)不再有效发挥作用的温度下发生。重复进行热循环直至生成所要量的PCR产物。例示性PCR缓冲液包含下列物质每100微升缓冲液中有50mM KCl ； IOmM pH 值为 8. 3 的 Tris-HCl ;1. 5mM MgCl2 ；0. 001% (重量 / 体积)明胶；200 μ M dATP ； 200 μ M dTTP ；200 μ M dCTP ；2002 μ M dGTP ；和 2. 5 单位水生栖热菌(Thermus aquaticus) (Taq)DNA聚合酶I (美国专利第4，889，818号)。诱导剂可为将发挥作用以实现引物延伸产物的合成的任何化合物或系统，包括酶。为达成此目的的合适酶例如包括大肠杆菌DNA聚合酶I、大肠杆菌DNA聚合酶I的 Klenow片段、T4 DNA聚合酶、其他可利用的DNA聚合酶、逆转录酶及其他酶(包括热稳定性酶)，其将有利于核苷酸以适当方式组合以形成与每一核酸链互补的引物延伸产物。一般来说，合成将于每一引物的3'末端引发且沿模板链以5'方向行进直至合成终止，产生不同长度的分子。然而，可存在使用如上所述的相同过程而于5'末端引发合成且以上述方向行进的诱导剂。诱导剂也可为将发挥作用以实现RNA引物延伸产物的合成的化合物或系统，包括酶。在优选实施例中，诱导剂可为DNA依赖性RNA聚合酶，诸如T7 RNA聚合酶、T3RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶。这些聚合酶生成互补RNA聚核苷酸。如Chamberlin等人，The Enzymes，P. Boyer 编，第 87-108 页，Academic Press, New York(1982)已描述，RNA 聚合酶的高转换率(turn-over rate)扩增起始聚核苷酸。基于转录的扩增系统已由Gingeras等人在 PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications，第 245-252 页，Innis 等人编，Academic Press, Inc. , San Diego, Calif. (1990)中描述。若诱导剂为DNA依赖性RNA聚合酶且因而合并三磷酸核糖核苷酸，则将足够量的 ATP、CTP、GTP和UTP与引物延伸反应混合物混合并如上所述处理所得溶液。新合成链及其互补核酸链形成可用于所述过程的随后步骤中的双股分子。PCR反应可有利地用于将适用于检测寡腺苷酸合成酶基因中的突变的预选限制性位点并入所述产物中。PCR扩增方法在美国专利第4，683，192号、第4，683，202号、第4，800，159号和第 4，965，188 号中和至少在包括 PCR Technology principles and Applications for DNAAmplification, H. Erlich 编，Stockton Press, New York(1989)禾口 PCR Protocols :A Guide toMethods and Applications, Innis 等人编，Academic Press, San Diego, Calif. (1990)的若干教科书中详细描述。
在某些实施例中，每个扩增反应使用两对第一和第二引物。自多个不同扩增反应 (每个反应使用多个不同引物对)获得的扩增反应产物可一起或单独进行分析。然而，本发明涵盖使用仅一对第一和第二引物的扩增反应。以下表1中显示用于扩增含有本文中所揭示的突变的DNA部分的例示性引物。扩增子A对应于含有SEQ IDNO 1-3中所指的突变的聚核苷酸序列。扩增子B对应于含有SEQ ID NO :4-7和SEQ IDNO 60 中所指的突变的聚核苷酸序列。扩增子C对应于含有SEQ ID NO :57中所指的突变的聚核苷酸序列。扩增子D对应于含有SEQ ID NO :58中所指的突变的聚核苷酸序列。扩增子E对应于含有SEQ ID NO :59中所指的突变的聚核苷酸序列。扩增子F对应于含有SEQ ID NO 61中所指的突变的聚核苷酸序列。扩增子G对应于含有SEQ ID NO :62-64中所指的突变的聚核苷酸序列。魁含有本发明的突变的扩增子
权利要求
1.一种经分离的聚核苷酸，其包含编码SEQ ID NO :48多肽序列的核苷酸序列。
2.一种经分离的聚核苷酸，其包含编码SEQ ID NO :20-30, SEQ ID NO :32-35、SEQ IDNO :46-52或SEQ ID NO :75_84，且与选自由下列各序列组成的群组的多肽具有至少80% 序列相似性的多肽序列的核苷酸序列(a)SEQ ID NO :22 和 SEQ ID NO 25 中任一者的氨基酸 219 至 238 ；(b)SEQID NO 23 的氨基酸 231 至 250 ；(c)SEQID NO :26-29, SEQ ID NO :33-34 和 SEQ ID NO 50 中任一者的氨基酸 347 至366 ；(d)SEQ ID NO 32 的氨基酸 295 至 314 ；(e)SEQID NO :46 的氨基酸 189 至 208 ；(f)SEQ ID NO 47的氨基酸61至80 ；或前述任一序列与SEQ ID NO :85-94的蛋白质转导域的组合。
3.一种经分离的聚核苷酸，其包含选自由SEQ ID NO 31, SEQ ID NO :36-45和SEQ IDNO 55-56组成的群组的核苷酸序列。
4.一种重组载体，其包含根据权利要求1、2或3所述的经分离的聚核苷酸。
5.一种表达载体，其包含根据权利要求1、2或3所述的经分离的聚核苷酸，所述聚核苷酸可操作地连接至表达控制序列。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其中所述载体为病毒载体。
7.根据权利要求5所述的表达载体，其中所述载体为选自由下列各载体组成的群组的病毒载体腺病毒载体、与腺病毒有关的病毒载体、杆状病毒载体、塞姆利基森林病毒 (semliki forest virus)载体、辛德毕斯病毒(sindbis virus)载体、痘病毒载体、牛痘病毒载体、鸟痘病毒载体、禽痘病毒载体、鸡痘病毒载体、金丝雀痘病毒载体、α病毒载体、鸡痘病毒载体或慢病毒载体。
全文摘要
本发明涉及一种检测与编码OAS1的基因有关的突变的方法。这一突变和其他所揭示的突变与人类对包括C型肝炎的病毒感染的抗性有关。本发明也提供一种由所述突变基因编码的蛋白质、多肽、编码所述蛋白质或多肽的聚核苷酸组成的治疗剂。本发明也提供对人类OASI呈特异性的包括反义寡核苷酸的人类OAS1抑制剂、方法和组合物。
文档编号C12Q1/70GK102174538SQ20111003635
公开日2011年9月7日 申请日期2004年10月22日 优先权日2003年10月23日
发明者克莉斯汀娜·A·席尔, 查尔斯·L·麦格尼斯, 盖瑞·罗森堡, 肖恩·P·艾度纳托, 蒂埃里·吉尔洛德约克斯 申请人:伊洛默格生物科学公司