专利名称：一种检测结核分枝杆菌耐药性的方法和试剂盒的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种检测结核分枝杆菌耐药性的方法和试剂盒。
背景技术：
结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)所致的一种传染性疾病。据世界卫生组织(WHO)提供的数据，2002年世界结核病的形势为感染人数约30亿，新发结核病例880万。其中，新涂阳结核病例390万，发病率比2001年增长I. 1%，新发病例中耐多药比例为3. 2%，结核病的死亡人数达180万。回顾性调查结果表明，中国MTB的总耐药率为27. 8%，初始耐药率和获得耐药率分别为18. 6%和46. 5%，耐多药率为10.7%，其中初始和获得性耐多药率分别为7. 6%和17. 1%。由于耐药结核杆菌的流行，使结核病成为由单一微生物导致死亡的主要原因，占世界人口数的1%，占可预防死亡数的26%。随着分子生物学理论和技术的发展，MTB的耐药机制及耐药的分子基础逐步被阐明，建立了快速检测MTB耐药基因的方法，为MTB快速药物敏感性试验开辟了一条新的途径。研究表明MTB产生耐药性机制包括药物失活酶、胞壁通透性改变、靶结构基因突变和代谢途径改变等，而主要机制是菌内药物作用靶基因的突变所致。利福平和异烟肼是治疗结核最主要的一线药物，通过各种分子生物学工具对这两种药物的耐药性的遗传基础进行了深入研究，结果显示，在正常情况下，利福平(RFP)与RNA聚合酶B亚基(rpoB)特异性结合，通过阻断RNA的合成而起到抑制细菌生长的作用，rpoB基因在利福平的药物选择压力下发生突变而改变所编码的rpoB亚基构象，从而降低与利福平的亲和力。rpoB基因突变一般发生在该基因内一个高度保守的81bp区域内(507-533位27个氨基酸密码子)。其中最常见的密码子突变点为531位丝氨酸(Ser)—亮氨酸(Leu) (53ITCG — TTG)，526位组氨酸(His)—酪氨酸(Tyr) (526CAC — GAC)，此外，常见的点突变还有511CTG — CCG，533CTG — CCG (Taniguchi H. Molecularmechanisms of multidrug resistance inMycobacterium tuberculosis[J]. J Uoch,2000,22 (3) :269-282)。异烟肼耐药性的分子基础比较复杂，已发现几个涉及异烟肼体内代谢过程中活性中间体形成有关的基因，其中与过氧化氢酶-过氧化物酶编码基因katG和/或烯酰基还原酶编码基因inbA等基因突变有关。这两种酶都直接或间接的参与异烟肼中间体的形成。katG基因常见的密码子突变点为第315发生突变(315AGC — ACC、315AGC — AAC, Herrara L, Valverde A, Saiz P, et al. Molecular characterizationofisoniazid-resistant mycobacterium tuberculosis clinical strains isolatedinthe Philippines [J]. Int J Antimicrob Agents, 2004, 23 (6) 572-576.)它的发生频率约为67.2%。inhA基因的耐异烟肼突变主要发生在其启动子区的-15T位脱氧核糖核苷酸QnhA基因在其启动子区的-15C突变为T，Basso LA，Zhang R，Musser JM, etal. Mechanisms of isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis enzymaticcharacterization of enoyl reductase mutants identified inisoniazid-resistantclinical isolates [J]. J Infect Dis, 1998,178 (3) :769-775.)上。结核分枝杆菌的临床检测一直以来主要依靠药物敏感试验，但传统的在固体培养基上进行的药物敏感试验周期长。敏感性低，严重影响了患者的早期诊断和治疗。生物学方法为耐药结核病的快速检测打开了广阔的前景。在许多的核酸扩增方法中，PCR方法被最广泛地应用于临床结核的检测目前常用的结核杆菌基因突变检测方法如下(I) DNA测序法(DNA sequencing)对耐药基因片段的PCR产物进行直接测序，然后与标准敏感菌株的同一 DNA片段比较，分析碱基突变的位置与分布，但是此方法比较繁琐，且所需设备多集中在一些大的测序公司，难于普及。(2) PCR-SSCP法PCR-SSCP，即聚合酶链反应一单链构象多态性(polymerasechainreact ion-single stranded conforma-tional polymorphism, PCR-SSCP),但是此方法检测单碱基的变化的DNA片段长度应小于200bp，且从小片段中不能得到较完整的耐药信息，且随DNA长度的增加灵敏度下降。(3)限制性片段长度多态性分析(restriction fragmant length polymorphism,RFLP) RFLP分析是限制性内切酶、核酸电泳、印迹技术、探针杂交技术的综合应用。此法特异性高，但是只能分析已知序列特定位点的基因突变。(4)多列探针检测法(line probe assay, LiPA) LiPA成本昂贵,较难普及。(5)基因芯片技术虽已取得很大进展，但仍存在缺陷，比如在合成探针时可能会有错误的核苷酸混入。另外，其操作过程复杂，所需材料昂贵，都阻碍了该项技术的推广。因此，建立一种简单快速的突变检测方法对与早期诊断结核病和防治结核病的传播具有重要意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种鉴定结核杆菌耐药性的专用引物。本发明提供的专用引物，其由一个以上引物组组成，每个所述引物组针对一种耐药基因，所述每个引物组扩增的靶序列为包括突变位点在内的所有等位基因片段；每个所述引物组包括用于扩增所述靶序列的特异性引物和一条共用引物。所述耐药基因为耐利福平基因和/或耐异烟肼基因；所述特异性引物的3’末端碱基与所述等位基因片段的突变位点的碱基相同或互补。所述专用引物由如下3个引物组组成用于扩增耐利福平基因的引物组由4条用于扩增GenBank Accession Number为 NC_000962 第 759807-763325 位核苷酸的 rpoB 基因的 51ICTG — CCG、526CAC — GAC、531TCG — TTG、533CTG — CCG突变位点分别对应的等位基因片段的特异性引物和I条共用引物I组成；所述4 条用于扩增 GenBank Accession Number 为 NC_000962 第 759807-763325 位核苷酸的 rpoB 基因的 51ICTG — CCG、526CAC — GAC、53ITCG — TTG.533CTG — CCG 突变位点分别对应的等位基因片段的特异性引物的核苷酸序列分别为序列表中序列5、4、3和2 ；所述共用引物I的核苷酸序列为序列表中序列I ;
用于扩增耐异烟肼基因的引物组A由I条用于扩增GenBank Accession Number为NC_000962第1674202-1675011位核苷酸的inhA基因的inhA_15T突变位点对应的等位基因片段的特异性引物和I条共用引物2组成； 所述用于扩增GenBank Accession Number 为 NC_000962 第 1674202-1675011 位核苷酸的inhA基因的inhA-15T突变位点对应的等位基因片段的特异性引物的核苷酸序列为序列表中序列7 ；所述共用引物2的核苷酸序列为序列表中序列6 ；用于扩增耐异烟肼基因的引物组B由2条用于扩增GenBank Accession Number为 NC_000962 第 2153889-2156111 位核苷酸的 katG 基因的 315AGC — AAC、315AGC — ACC突变位点分别对应的等位基因片段的特异性引物和共用引物3组成；所述用于扩增GenBank Accession Number 为 NC_000962 第 2153889-2156111 位核苷酸的katG基因的315AGC — AAC、315AGC — ACC突变位点分别对应的等位基因片段的特异性引物的核苷酸序列分别为序列表中序列9和序列10 ；所述共用引物3的核苷酸序列为序列表中序列8。“511CTG — CCG、526CAC — GAC,53ITCG — TTG、533CTG — CCG”中的 511、526、531、533为突变的氨基酸的位置(密码子的位置)，“一”表示突变，“一前面的碱基”为未突变的氨基酸的密码子，“一后面的碱基”为突变的氨基酸的密码子。“315AGC — ACC、315AGC — AAC”中的315位为突变的氨基酸的位置(密码子的位
置)，“一”表示突变，“一前面的碱基”为未突变的氨基酸的密码子，“一后面的碱基”为突变的氨基酸的密码子。inhA_15T中的-15T位表示将inhA基因在其启动子区的-15的核苷酸C突变为核苷酸T。本发明的第二个目的是提供一种检测结核杆菌的耐药性的试剂。本发明提供的试剂，由所述的专用引物和专用探针组成；所述专用探针的数目与所述引物组的数目相同，一种所述专用探针与所述专用引物中的一个引物组扩增的靶序列特异结合。所述耐药性为耐利福平和/或耐异烟肼；所述专用探针均为荧光标记探针,所述荧光标记探针的标记物具体为荧光素；所述荧光标记探针的标记物具体为荧光素；所述荧光素具体为6-羧基荧光素(FAM)或六氯荧光素(HEX)；所述专用探针由如下3种组成专用探针I为与所述用于扩增耐利福平基因的引物组扩增的靶序列特异结合的探针，所述专用探针I的5’末端标记FAM，所述专用探针I的核苷酸序列为序列表中的序列
11;专用探针2为与所述用于扩增耐异烟肼基因的引物组A扩增的靶序列特异结合的探针，所述专用探针2的5’末端标记HEX，所述专用探针2的核苷酸序列为序列表中的序列12 ；专用探针3为与所述用于扩增耐异烟肼基因的引物组B扩增的靶序列特异结合的探针，所述专用探针3的5’末端标记HEX，所述专用探针3的核苷酸序列为序列表中的序列13。
本发明的第三个目的是提供一种检测结核杆菌的耐药性的PCR试剂。本发明提供的PCR试剂，由所述的试剂、dNTP、DNA聚合酶、Mg2+及PCR缓冲液组成；所述引物对中各引物在所述PCR试剂中的浓度均为0. 2 ii M ;所述dNTP在所述的PCR试剂中的浓度为200 ii M ;所述DNA聚合酶在所述的PCR试剂中的浓度为0. 075U/ U L ；所述Mg2+在所述的PCR试剂中的浓度为200 U M。含有所述的试剂或所述的PCR试剂的试剂盒也是本发明保护的范围。所述的专用引物或所述的PCR试剂或所述试剂盒在检测结核杆菌的耐药性中的应用也是本发明保护的范围；所述耐药性为耐利福平和/或异烟肼。本发明第三个目的是提供一种辅助检测待测样品中结核杆菌的耐药性的方法。本发明提供的方法包括如下步骤用所述的专用引物或所述的试剂或所述的PCR试剂或所述试剂盒对待测样品进行实时荧光双重TaqmanPCR扩增，若荧光PCR仪FAM通道有扩增荧光，则所述待测样品耐利福平，若荧光PCR仪HEX通道有扩增荧光，则所述待测样品耐异烟肼。实时荧光双重TaqmanPCR技术是分别针对不同的结核耐药基因的特异性序列设计探针，并按基因耐药种类(利福平/异烟肼)的不同标记不同的荧光，通过检测不同通道的荧光信号，来进行结核耐药基因的区分检测。这种技术与传统实时荧光PCR技术不同，通常使用的实时荧光PCR技术是一个PCR反应体系中只使用一种荧光标记的探针，结果只能通过荧光信号的变化判断某一 PCR产物的扩增。如果某些基因座位有多个等位基因(如HLA-DRB位点或地中海贫血突变基因等)，用这种荧光法检测就很繁杂，甚至很难完成。而双重Taqman荧光PCR技术则是针对各等位基因设计序列特异性引物，并在目标序列上游引物和下游引物之间设计序列特异性探针，所述PCR扩增中，以待测样品的基因组DNA为模板；所述PCR扩增的退火温度为62°C ；所述待测样品为含有结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的痰液。本发明的实验证明，本发明提供的专用的引物和专用的探针，可以通过高效灵敏的双重Taqman实时突光PCR技术和序列特异性引物扩增技术(Sequence specificprimer,SSP)相结合，在较短时间内检测待测样品中结核杆菌的耐药性。还提供了检测临床生物样品中结核分枝杆菌耐药性的方法和试剂盒，临床生物样品可以为临床痰液、支气管灌洗液、血液、腹水、脑脊液等。检者痰液、血液、支气管灌洗液、腹水以及脑脊液中结核分枝杆菌基因组DNA。本发明还利用了双重Taqman实时荧光PCR技术，按基因耐药种类(利福平/异烟肼)的不同标记不同的荧光，通过检测不同通道的荧光信号，来进行结核耐药基因的区分检测。这样大大提高了检测的灵敏度和扩增效率，使用本发明的方法和试剂盒，从样本的处理到判读基因型检测结果仅需3小时左右的时间。因此，本发明的方法和试剂盒特别适用于临床标本的快速检测和大样本的普查。
图I为实时荧光定量PCR反应模式示意图
图2为各靶DNA扩增片段灵敏度实验结果图3为样本检测结果
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、检测结核分枝杆菌耐药基因突变的引物和探针I、引物的设计和合成为了特异、高效地扩增待检核酸样品中的目的基因，从GenBank中调出结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)全基因组 DNA(BX842578)序列，针对rpoB (NC_000962 第 759807-763325 位核苷酸)，katG (NC_000962 第 2153889-2156111 位核苷酸)，inhA(NC_000962第1674202-1675011位核苷酸)基因多态性位点，按照引物设计的一般性原则，采用Primer Premier5. 0和01igo6. 0软件分别设计并合成了实时荧光PCR所用的正向和反向引物。引物组I:rpoB_comF2 :5，AGCCGATGACCACCCAGGAC 3，(序列 I)533_R3 :5’ AGACCGCCGAGCCCCG 3’ (序列 2)531_Ri2 :5，CCGAGCCCCAGCGCCA 3’ (序列 3)526_R3 :5，CGGCAGTCGGCGCTTGTC 3，(序列 4)511_W7 :5，TTCTGGTCCATGAATAGGCTCG 3，(序列 5)引物组2:inhA_comR2 :5’ GCGTAACCCCAGTGCGAAAGTTCC 3’ (序列 6)inh_F12 :5，GTCACCCCGACAACCTAGCA 3，(序列 7)引物组3:katG_comRl :5，GCTCCCACTCGTAGCCGTACAGGAT 3，(序列 8)katG(315g-a)F7 :5，GTAAGGACGCGATCACGAA 3’ (序列 9)katG(315g-c)F6_2 :5，AAGGACGCGATCACGAC 3’(序列 10)2、探针的合成和标记针对rpoB, inhA, katG基因多态性位点，设计并合成了 3条探针。为了保证各探针均能在同一温度下与特定的靶DNA成功地配对，须将探针的Tm值和GC含量严格控制在特定范围内。探针的5’端标记荧光基团(FAM/HEX)，3’端标记淬灭基团(Eclipse)。PCR反应中使用的寡核苷酸探针分别是探针1:5’ AGGCGATCACACCGCAGACGTTG 3’ (序列 11，标记 FAM，针对 rpoB 基因)探针2 :5’ CCGGAAATCGCAGCCACGTT 3’ (序列 12，标记 HEX，针对 inhA 基因)探针3 :5’ CTGTTGTCCCATTTCGTCGGGGTGT 3’ (序列 I3，标记 HEX，针对 katG 基因)实施例2、实时荧光PCR的条件摸索I、模板的制备根据NC_000962 第 759807-763325 位核苷酸、NC_000962 第 1674202-1675011 位核苷酸、NC_000962第2153889-2156111位核苷酸，分别人工合成rpoB基因、inhA基因、katG基因，经过测序人工合成的rpoB基因、inhA基因、katG基因的核苷酸序列分别与NC_000962第 759807-763325 位核苷酸、NC_000962 第 1674202-1675011 位核苷酸、NC_000962 第2153889-2156111 位核苷酸一致。将人工合成的rpoB基因、inhA基因、katG基因分别于pGEM-T EasyVector (Promega公司，目录号A1380)连接,分别得到野生型质粒rpoB、野生型质粒inhA、野生型质粒katG。经过测序
野生型质粒rpoB为将rpoB (NC_000962第759807-763325位核苷酸)基因与pGEM-TEasy Vector连接得到的质粒。野生型质粒inhA为将inhA(NC_000962第1674202-1675011位核苷酸)基因与pGEM-T Easy Vector连接得到的质粒。野生型质粒katG为将katG(NC_000962第2153889-2156111位核苷酸)基因与pGEM-T Easy Vector连接得到的质粒。含有rpoB突变位点(533位)的痰液(由解放军第三0九医院提供)为模板，rpoB_comF2、533_R3为引物，进行PCR扩增，得到PCR产物，送去测序，结果为该PCR产物的核苷酸与rpoB(NC_000962第759807-763325位核苷酸)相比，不同的为第533位氨基酸(密码子)的CTG突变为CCG，其余均相同；将该PCR产物与pGEM-T Easy Vector连接得到的质粒即为突变533CTG — CCG位点突变质粒。含有rpoB突变位点(531位)的痰液(由解放军第三0九医院提供)，rp0B_C0mF2、531_R12为引物，进行PCR扩增，得到PCR产物，送去测序，结果为该PCR产物的核苷酸与rpoB(NC_000962第759807-763325位核苷酸)相比，不同的为第531位氨基酸(密码子)的TCG突变为TTG，其余均相同；将该PCR产物与pGEM_T Easy Vector连接得到的质粒即为突变531TCG — TTG位点突变质粒。含有rpoB突变位点(526位)的痰液(由解放军第三0九医院提供)，rp0B_C0mF2、526_R3为引物，进行PCR扩增，得到PCR产物，送去测序，结果为该PCR产物的核苷酸与rpoB(NC_000962第759807-763325位核苷酸)相比，不同的为第526位氨基酸(密码子)的CAC突变为GAC，其余均相同；将该PCR产物与pGEM-T Easy Vector连接得到的质粒即为突变526CAC — GAC位点突变质粒。含有rpoB突变位点(511位)的痰液(由解放军第三0九医院提供)，rp0B_C0mF2、511_W7为引物，进行PCR扩增，得到PCR产物，送去测序，结果为该PCR产物的核苷酸与rpoB(NC_000962第759807-763325位核苷酸)相比，不同的为第511位氨基酸(密码子)的CTG突变为CCG，其余均相同；将该PCR产物与pGEM-T Easy Vector连接得到的质粒即为突变511CTG — CCG位点突变质粒。含有katG基因315AGC — AAC突变的痰液(由解放军第三0九医院提供)，katG_comRl、katG(g-a)F7为引物，进行PCR扩增，得到PCR产物，送去测序，结果为该PCR产物的核苷酸与katG基因(NC_000962第2153889-2156111)相比，不同的为第315位氨基酸(密码子)的AGC突变为AAC，其余均相同；将该PCR产物与pGEM-TEasy Vector连接得到的质粒即为突变315AGC — AAC位点突变质粒。含有katG基因315AGC — ACC突变的痰液(由解放军第三0九医院提供)，katG_comRl、katG(g-c)F6为引物，进行PCR扩增，得到PCR产物，送去测序，结果为该PCR产物的核苷酸与katG基因(NC_000962第2153889-2156111)相比，不同的为第315位氨基酸(密码子)的AGC突变为ACC，其余均相同；将该PCR产物与pGEM-TEasy Vector连接得到的质粒即为突变315AGC — ACC位点突变质粒。
含有inhA突变点的痰液(由解放军第三0九医院提供)，inhA_comR2、inh_F12为引物，进行PCR扩增，得到PCR产物，送去测序，结果为该PCR产物的核苷酸与inhA基因(NC_000962第1674202-1675011位核苷酸)相比，不同的是将第-15位核苷酸C突变为T，其余均相同；将该PCR产物与pGEM-T Easy Vector连接得到的质粒即为突变inhA_15T位点突变质粒。2、实时荧光PCR检测灵敏性实时荧光PCR的反应模式示意图如图I所示，其中，上游引物分别为序列表中的序列1、6、8，下游引物分别为序列表中的序列2，3，4，5，7，9，10，Taqman探针为序列表中的序列 11，12，13。PCR反应液的最佳反应体系如下20ul反应体系中0. 4ul引物(引物的终浓度为0. 2uM)；0. 4ul Mg2+(Mg2+的终浓度为 200uM)；I. 6u I dNTP (dNTP 的终浓度为 200uM)；2ul Buffer(购自 Qiagen China，产品目录号为 203203)，0. 3ul DNA聚合酶(DNA聚合酶的终浓度为0. 075U/ul)；0. 4ul已标记的探针(探针的终浓度为0. 2uM)；用水补足体积。PCR反应的最佳反应条件如下95°C 15min(预变性)，95°C 15s，62°C 40s (退火和延伸合并)(40个循环)。取出上述最佳扩增反应液，置于冰盒上，样品取2ul，加入核酸反应管中。每次检测应设阴性和阳性对照，阴阳性对照品加入量均为2ul。阳性对照为野生型质粒rpoB、野生型质粒inhA和野生型质粒katG,阴性对照为不加入模板。采用上述体系和条件，对步骤3制备的模板进行不同程度的稀释，进行实时荧光定量PCR，引物为引物组I、引物组2和引物组3，探针为探针1-3。结果如图2所示，其中，A为rpoB基因51IT — C位点扩增图，模板为51ICTG — CCG位点突变质粒为rpoB基因526CAC — GAC位点扩增图，模板为526CAC — GAC位点突变质粒；C为rpoB基因531TCG — TTG位点扩增图，模板为531TCG — TTG位点突变质粒；D为rpoB基因533CTG — CCG位点扩增图，模板为533CTG — CCG位点突变质粒；E为inhA基因突变位点15C — T位点扩增图，模板为inhA 15C — T位点突变质粒；F为katG基因315G — C位点扩增图，模板为katG315G — C位点突变质粒；G为katG基因315G — A位点扩增图，模板为katG315G —A位点突变质粒。2，3，4，5分别表示样本含量为102，103，104，IO5拷贝/ml, W为野生型质粒rpoB、野生型质粒inhA或野生型质粒katG, N为阴性对照,扩增大小均在预期范围。“511CTG — CCG、526CAC — GAC,53ITCG — TTG、533CTG — CCG”中的 511、526、531、533为突变的氨基酸的位置(密码子的位置)，“一”表示突变，“一前面的碱基”为未突变的氨基酸的密码子，“一后面的碱基”为突变的氨基酸的密码子。“315AGC — ACC、315AGC — AAC”中的315位为突变的氨基酸的位置(密码子的位
置)，“一”表示突变，“一前面的碱基”为未突变的氨基酸的密码子，“一后面的碱基”为突变的氨基酸的密码子。
inhA-15T中的-15T位表示将inhA基因在其启动子区的-15C突变为T。从图中可以看出，该方法可以使低拷贝数的样品DNA得到很好的扩增效果，其检测下限达到IO2拷贝/ml反应体系，优化的体系及PCR条件，可以提高核酸扩增的特异性和闻效性，从而大大提闻了检测灵敏度，有利于防止和减少污染。实施例3、检测样品中结核分枝杆菌的耐药性I、不同的生物样品实时荧光定量PCR检测采用实施例I得到3个引物组和3种探针，用实施例2优化的条件与体系，对155份临床涂阳样本(痰液，已知含有结核分枝杆菌，由解放军第三0九医院提供)进行实时荧光定量PCR检测。检测判断标准为如果实时荧光PCR仪FAM通道有扩增荧光，则判断为结核分枝杆菌rpoB基因某一位点突变，该临床样品存在抗利福平抗性；若实时荧光PCR仪HEX通道有扩增荧光，则判断为结核分枝杆菌inhA基因或katG基因某一位点有突变，该临床样品存在抗异烟肼抗性。结果为耐利福平株I例，耐异烟肼株13例，耐利福平和异烟肼株33例，野生型株(注不存在耐利福平和耐异烟肼的突变基因)106例，I例未检出。上述检测结果与临床涂片结果符合率达99%。部分实时荧光PCR的结果如图3所示，从图中可以看出，FAM通道有荧光扩增曲线，而HEX通道无荧光扩增曲线，判定该样品为耐利福平样品。为了证明用实施例I得到3个引物组和3种探针检测的准确性，对其中155例临床样本的PCR产物进行序列测定，结果表明使用实施例I得到3个引物组和3种探针检测I例耐利福平株的PCR产物测序结果如下编号为I的耐利福平株的PCR产物具有rpoB基因(NC_000962第759807-763325位核苷酸)53ITCG — TTG得到的核苷酸；13例耐异烟肼株的PCR产物测序结果如下编号为2的耐利福平株的PCR产物具有inhA基因(NC_000962第1674202-1675011位核苷酸)_15C — T得到的核苷酸；编号为3-14的耐利福平株的PCR产物具有katG基因(NC_000962第2153889-2156111位核苷酸)315G — C得到的核苷酸；33例耐利福平和异烟肼株的PCR产物测序结果如下编号为15-20的耐利福平株的PCR产物即具有inhA基因(NC_000962第1674202-1675011位核苷酸)-15C — T得到的核苷酸，又具有rpoB基因(NC_000962第759807-763325位核苷酸)531TCG — TTG得到的核苷酸；编号为21的耐利福平株的PCR产物即具有katG基因(NC_000962第2153889-2156111位核苷酸)315G — C得到的核苷酸，又具有rpoB基因(NC_000962第759807-763325位核苷酸)51IT — C得到的核苷酸；编号为22-23的耐利福平株的PCR产物即具有katG基因(NC_000962第2153889-2156111位核苷酸)315G — A得到的核苷酸，又具有rpoB基因(NC_000962第759807-763325位核苷酸)531TCG — TTG得到的核苷酸；编号为24-47的耐利福平株的PCR产物即具有katG基因(NC—000962第2153889-2156111位核苷酸)315G —C得到的核苷酸，又具有rpoB基因(NC—000962第759807-763325位核苷酸)531TCG — TTG得到的核苷酸。从上述可以看出测序结果和使用实施例I得到3个引物组和3种探针检测结果基本吻合，证明本发明的方法有很高的准确性。2、13种常见非结核分枝杆菌实时荧光定量PCR检测结果判定釆用实施例I得到3个引物组和3种探针，用实施例2优化的条件与体系，对浓度均为lmg/ml的13种常见非结核分枝杆菌(均由中国药品生物制品鉴定所提供)进行特异性测试，13种常见非结核分枝杆菌如下鸟分枝杆菌(Mycobacteriumavium subsp. avium Chester) ATCC 25291 ;胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare (Cuttino and McCabe) Runyon) ATCC13950 ;療病分枝杆菌(Mycobacterium scrofulaceum Prissick and Masson)ATCC 19981 ;海分枝杆菌(Mycobacterium marinum Aronson)ATCC 927 ;猿猴分枝杆菌(Mycobacterium simiaeKarassova et al.) ATCC 25275 ;勘萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii Hauduroy)ATCC 12478 ;偶然分枝杆菌(Mycobacteriumfortuitum subsp. fortuitum da Costa Cruz)ATCC 6841 ;耳止垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis (Trevisan) Lehmann and Neumann)ATCC 19420 ;母牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis Karlson and Lessel)ATCC 19210 ；浅黄分枝杆菌(Mycobacterium gilvum Stanford and Gunthorpe)ATCC 43909 ;草分枝杆菌(Mycobacterium phlei Lehmann and Neumann)ATCC 11758 ;龟分枝杆菌胺肿亚种(Mycobacterium abscessus)ATCC 19977。结果为均未出现假阳性。
权利要求
1.一种鉴定结核杆菌耐药性的专用引物，其由一个以上引物组组成，每个所述引物组针对一种耐药基因，所述每个引物组扩增的靶序列为包括突变位点在内的所有等位基因片段； 每个所述引物组包括用于扩增所述靶序列的特异性引物和一条共用引物。
2.根据权利要求I所述的专用引物，其特征在于 所述耐药基因为耐利福平基因和/或耐异烟肼基因。
3.根据权利要求I或2所述的专用引物，其特征在于 所述特异性引物的3’末端碱基与所述等位基因片段的突变位点的碱基相同或互补。
4.根据权利要求1-3中任一所述的专用引物，其特征在于 所述专用引物由如下3个引物组组成 用于扩增耐利福平基因的引物组由4条用于扩增GenBank Accession Number为NC_000962 第 759807-763325 位核苷酸的 rpoB 基因的 51ICTG — CCG、526CAC — GAC、531TCG — TTG、533CTG — CCG突变位点分别对应的等位基因片段的特异性引物和I条共用引物I组成； 所述 4 条用于扩增 GenBank Accession Number 为 NC_000962 第 759807-763325 位核苷酸的 rpoB 基因的 51ICTG — CCG、526CAC — GAC、53ITCG — TTG、533CTG — CCG 突变位点分别对应的等位基因片段的特异性引物的核苷酸序列分别为序列表中序列5、4、3和2 ；所述共用引物I的核苷酸序列为序列表中序列I ; 用于扩增耐异烟肼基因的引物组A由I条用于扩增GenBank Accession Number为NC_000962第1674202-1675011位核苷酸的inhA基因的inhA_15T突变位点对应的等位基因片段的特异性引物和I条共用引物2组成； 所述用于扩增 GenBank Accession Number 为 NC_000962 第 1674202-1675011 位核苷酸的inhA基因的inhA-15T突变位点对应的等位基因片段的特异性引物的核苷酸序列为序列表中序列7 ； 所述共用引物2的核苷酸序列为序列表中序列6 ； 用于扩增耐异烟肼基因的引物组B由2条用于扩增GenBank Accession Number为NC_000962 第 2153889-2156111 位核苷酸的 katG 基因的 315AGC — AAC、315AGC — ACC 突变位点分别对应的等位基因片段的特异性引物和共用引物3组成； 所述用于扩增 GenBank Accession Number 为 NC_000962 第 2153889-2156111 位核苷酸的katG基因的315AGC — AAC、315AGC — ACC突变位点分别对应的等位基因片段的特异性引物的核苷酸序列分别为序列表中序列9和序列10 ； 所述共用引物3的核苷酸序列为序列表中序列8。
5.一种检测结核杆菌的耐药性的试剂，由权利要求1-4中任一所述的专用引物和专用探针组成； 所述专用探针的数目与所述引物组的数目相同，一种所述专用探针与权利要求1-4中任一所述的专用引物中的一个引物组扩增的靶序列特异结合。
6.根据权利要求5所述的试剂，其特征在于 所述耐药性为耐利福平和/或耐异烟肼。
7.根据权利要求5或6所述的试剂，其特征在于所述专用探针均为荧光标记探针，所述荧光标记探针的标记物具体为荧光素。
8.根据权利要求5-7中任一所述的试剂，其特征在于 所述荧光素为6-羧基荧光素或六氯荧光素。
9.根据权利要求5-8中任一所述的试剂，其特征在于 所述专用探针由如下3种组成 专用探针I为与所述用于扩增耐利福平基因的引物组扩增的靶序列特异结合的探针，所述专用探针I的5’末端标记6-羧基荧光素，所述专用探针I的核苷酸序列为序列表中的序列11 ; 专用探针2为与所述用于扩增耐异烟肼基因的引物组A扩增的靶序列特异结合的探针，所述专用探针2的5’末端标记六氯荧光素，所述专用探针2的核苷酸序列为序列表中的序列12 ； 专用探针3为与所述用于扩增耐异烟肼基因的引物组B扩增的靶序列特异结合的探针，所述专用探针3的5’末端标记六氯荧光素，所述专用探针3的核苷酸序列为序列表中的序列13。
10.一种检测结核杆菌的耐药性的PCR试剂，由权利要求5-9中任一所述的试剂、dNTP、DNA聚合酶、Mg2+及PCR缓冲液组成； 所述引物对中各引物在所述PCR试剂中的浓度均为O. 2μΜ ; 所述dNTP在所述的PCR试剂中的浓度为200 μ M ; 所述DNA聚合酶在所述的PCR试剂中的浓度为O. 075U/ μ L ； 所述Mg2+在所述的PCR试剂中的浓度为200 μ M0
11.含有权利要求5-9中任一所述的试剂或权利要求10所述的PCR试剂的试剂盒。
12.权利要求1-4中任一所述的专用引物在检测结核杆菌的耐药性中的应用。
13.权利要求5-9中任一所述的试剂或权利要求10所述的PCR试剂在检测结核杆菌的耐药性中的应用。
14.权利要求11所述试剂盒在检测结核杆菌的耐药性中的应用。
15.根据权利要求12-14中任一所述的应用，其特征在于 所述耐药性为耐利福平和/或异烟肼。
16.一种辅助检测待测样品中结核杆菌的耐药性的方法，包括如下步骤用权利要求1-4中任一所述的专用引物或权利要求5-9中任一所述的试剂或权利要求10所述的PCR试剂或权利要求11所述试剂盒对待测样品进行实时荧光双重TaqmanPCR扩增，若荧光PCR仪6-羧基荧光素通道有扩增荧光，则所述待测样品耐利福平，若荧光PCR仪六氯荧光素通道有扩增荧光，则所述待测样品耐异烟肼。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于 所述PCR扩增中，以待测样品的基因组DNA为模板。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其特征在于 所述PCR扩增的退火温度为62°C。
19.根据权利要求16-18中任一所述的方法,其特征在于 所述待测样品为含有结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的痰液。
全文摘要
本发明公开了一种检测结核分枝杆菌耐药性的方法和试剂盒。本发明提供的鉴定待测样品中结核杆菌的耐药性的专用引物和专用探针，其中，所述专用引物包括多个引物组，每个所述引物组包括多条用于扩增同一目的基因的每个突变位点对应的等位基因的特异性引物和一条共用引物；所述专用探针包括多种探针，所述每种探针与对应所述引物组中的所述共用引物和所有所述特异性引物的靶序列特异结合。本发明的实验证明，本发明提供的专用的引物和专用的探针，可以通过高效灵敏的双重Taqman实时荧光PCR技术和序列特异性引物扩增技术(Sequence specific primer，SSP)相结合，在较短时间内检测待测样品中结核杆菌的耐药性。
文档编号C12Q1/68GK102618625SQ201110030149
公开日2012年8月1日 申请日期2011年1月27日 优先权日2011年1月27日
发明者李洪敏, 王思贤, 高华方, 魏运荣 申请人:中国人民解放军第三O九医院, 博奥生物有限公司, 清华大学