专利名称：用于扩增产氢微藻莱茵衣藻插入突变基因侧翼序列的引物及方法
技术领域：
本发明涉及一种用于扩增产氢微藻莱茵衣藻插入突变基因侧翼序列的引物及方法。
背景技术：
莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是50多年来用于研究光合作用机理的模式生物。2007年全基因组序列信息的获得，为从基因组水平研究莱茵衣藻各种生命活动特征及分子调控机理提供了可以利用的高通量分子操作平台。在全基因组序列信息的基础上，如何确定各个基因的功能，研究基因与表型的关系是当前的主要问题。与其它的模式光合生物相比，莱茵衣藻基因组序列具有GC含量高、 重复序列多等特点，采用传统的基因克隆方法不容易成功。所以研究单个基因与表型的关系具有一定难度。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于扩增莱茵衣藻插入突变基因侧翼序列的引物及方法。本发明提供了序列表的序列I所不DNA(SpO)、序列表的序列2所不DNA(Spl)、兼并引物和序列表的序列8所示DNA (ACl)组成的引物组合物；所述兼并引物为针对莱茵衣藻的基因组DNA的兼并引物。所述兼并引物具体可为序列表的序列7所示DNA (LAD-5-RMD227)、序列表的序列3 所示DNA(LADl)、序列表的序列4所示DNA(LAD2)、序列表的序列5所示DNA(LAD3)或序列表的序列6所示DNA(LAD4)。本发明还保护一种获得莱茵衣藻突变体的基因组DNA中巴龙霉素编码基因的插入位点的方法，包括如下步骤(I)提取莱茵衣藻突变体的基因组DNA ；(2)以基因组DNA为模板，用序列表的序列I所示DNA和所述兼并引物作为引物进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物；(3)以第一轮PCR扩增产物为模板，用序列表的序列2所示DNA和序列表的序列8 所示DNA作为引物进行第二轮PCR扩增，得到第二轮PCR扩增产物；(4)将第二轮PCR扩增产物进行测序，通过与野生型莱茵衣藻的基因组序列进行比对，得到莱茵衣藻突变体的基因组DNA中巴龙霉素编码基因的插入位点；所述莱茵衣藻突变体是在莱茵衣藻中导入PSI103质粒得到的突变体。所述第一轮PCR扩增的反应条件具体如下(1)93°C2 分钟;(2) 95 °C I 分钟;
(3) 940C 30 #, 680C I 分钟，72°C 3 分钟，11 个循环；(4) 940C 30秒，25 0C 2分钟，以0. 5度/秒的速度升温至72 °C，72°C 3分钟；(5) 94°C 20 #,68°C I 分钟，72°C 3 分钟，26 个循环；(6) 72 °C 5 分钟。所述第二轮PCR扩增的反应条件具体如下(1)94。。20 #, 670C I 分钟，72°C 3 分钟，2 个循环；(2) 94 0C 20 秒，68 V I 分钟，72 V 3 分钟，94 V 20 秒，68 V I 分钟，72 V 3 分钟， 940C 20秒，500C I分钟，720C 3分钟，14个循环；(3) 72 °C 5 分钟。巴龙霉素的蛋白序列具体可如序列表的序列15所不，其编码基因具体可如序列表的序列16所示。野生型莱茵衣藻的基因组序列可以从NCBI (美国生物信息学中心)获取，也可以从衣藻基因网站(http: / / genome. igi_Dsf.org/cgi_bin/runAlignment db = Chlre4&advanced = I)中获取。所述引物组合物可用于获得莱茵衣藻突变体的基因组DNA中巴龙霉素编码基因的插入位点。所述引物组合物或所述方法可用于辅助鉴定莱茵衣藻的基因组DNA中各基因功倉泛。本发明还保护一种辅助鉴定莱茵衣藻的基因组DNA中各基因功能的试剂盒，包括 PSI103质粒和所述引物组合物。所述莱茵衣藻具体可为莱茵衣藻藻种CC400 (mt-)。本发明提供的方法，将设计的两条特异性引物与TAIL-PCR所用的兼并引物(简并引物)进行组合，在优化的PCR反应条件下，可高效特异的扩增插入莱茵衣藻基因组DNA的外源基因的侧翼序列。因此，可以将外源DNA随机插入莱茵衣藻的基因组DNA，得到各种突变株，再采用本发明的引物和方法确定外源基因的插入位点，通过比较突变株和野生株的表型差异辅助确定发生插入突变所在的基因的功能。采用本发明的引物和方法的主要优点有(1)高通量；如果采用96孔PCR仪，一次可完成数十个目的片段的扩增；(2)引物特异性强；采用本发明的引物进行PCR扩增，第二轮反应后就可以检测到特异的条带，与传统方法相比特异性明显提高；(3)操作简便快速；只需在普通PCR仪上设定反应程序，在当天(一般约8小时内)就可完成一次扩增反应。本发明对高通量克隆莱茵衣藻基因、研究基因功能具有重要意义。
图I为TAIL-PCR扩增产物的电泳图；1-1 :以第一个突变体的基因组DNA为模板，用SpO和LAD-I进行第一轮扩增，用 Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；1-2 :以第一个突变体的基因组DNA为模板，用 SpO和LAD-2进行第一轮扩增，用Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；1_3 以第一个突变体的基因组DNA为模板，用SpO和LAD-3进行第一轮扩增，用Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；1-4 :以第一个突变体的基因组DNA为模板，用SpO和LAD-4进行第一轮扩增，用Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；1-5 :以第一个突变体的基因组DNA 为模板，用SpO和LAD-5-RMD227进行第一轮扩增，用Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；2-1 :以第二个突变体的基因组DNA为模板，用SpO和LAD-I进行第一轮扩增，用 Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物'2-2 以第二个突变体的基因组DNA为模板，用 SpO和LAD-2进行第一轮扩增，用Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；2_3 以第二个突变体的基因组DNA为模板，用SpO和LAD-3进行第一轮扩增，用Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；2-4 :以第二个突变体的基因组DNA为模板，用SpO和LAD-4进行第一轮扩增，用Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；2-5 :以第二个突变体的基因组DNA 为模板，用SpO和LAD-5-RMD227进行第一轮扩增，用Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；3-1 以第三个突变体的基因组DNA为模板，用SpO和LAD-I进行第一轮扩增，用 Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；3-2 以第三个突变体的基因组DNA为模板，用 SpO和LAD-2进行第一轮扩增，用Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；3_3 以第三个突变体的基因组DNA为模板，用SpO和LAD-3进行第一轮扩增，用Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；3-4 :以第三个突变体的基因组DNA为模板，用SpO和LAD-4进行第一轮扩增，用Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；3-5 :以第三个突变体的基因组DNA 为模板，用SpO和LAD-5-RMD227进行第一轮扩增，用Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；CC400-1 以莱茵衣藻藻种CC400 (mt-)的基因组DNA为模板，用SpO和LAD-I进行第一轮扩增，用Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；CC400-2 :以莱茵衣藻藻种 CC400 (mt-)的基因组DNA为模板，用SpO和LAD-2进行第一轮扩增，用Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；CC400-3 以莱茵衣藻藻种CC400 (mt-)的基因组DNA为模板，用 SpO和LAD-3进行第一轮扩增，用Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；CC400_4 以莱茵衣藻藻种CC400 (mt-)的基因组DNA为模板，用SpO和LAD-4进行第一轮扩增，用Spl和 ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；CC400-5 以莱茵衣藻藻种CC400 (mt-)的基因组DNA 为模板，用SpO和LAD-5-RMD227进行第一轮扩增，用Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)藻种 CC400 (mt_),从美国杜克大学 (Chlamy center, http://www. chlamy. org/)购买。PSI103 质粒购自美国杜克大学(Chlamy center, http://www. chlamy. org/)； PSI103质粒中含有巴龙霉素抗性基因。正常TAP 培养液=NH4Cl 0. 4g/L ；MgS04 7H20 0. lg/L ；CaCl2 2H20 0. 05g/L ；K2HP040. 108g/L ；KH2P04 0 . 0 56g/L ;Trisbase 2. 423g/L ;亨特微量元素(Hunter，s traceelements) lml/L,冰乙酸 lml/L,其余为水。固体TAP培养基在正常TAP培养液中加I. 5%的琼脂粉。实施例I、各种突变体的获得各种突变体均是将藻种CC400采用PSI103随机插入方法获得(Kindle，Journal ofApplied Phycology, Volume 6, Number 2, 231-238,1990)的，具体步骤如下(I)用限制性内切酶KpnI酶切PSI103质粒，得到线性化的质粒；(2)用玻璃珠法将线性化的质粒转化莱茵衣藻藻种CC400(mt_)，在含有巴龙霉素的TAP培养基中进行筛选，得到若干抗巴龙霉素的突变株，即为突变体库。(3)通过IMAGING-PAM在突变体库中筛选Fv/Fm小于0. 5的突变株系，取其中的6 株突变体株系作为实施例3的实验材料。FO :初始荧光，初始荧光是光系统II (PS II)反应中心处于完全开放时的荧光产量，它与叶片叶绿素浓度有关。Fm :最大突光产量(maximalfluorescence),是PS II反应中心处于完全关闭时的荧光产量，可反映经过PS II的电子传递情况，通常叶片经暗适应 20min后测得。Fv = Fm-FO :为可变荧光，反映了 QA的还原情况。Fv/Fm :是PS II最大光化学量子产量反映PS II反应中心内荧光能转换效率或称最大PS II的光能转换效率，叶暗适应20min后测得；非胁迫条件下该参数的变化极小，不受物种和生长条件的影响，胁迫条件下该参数明显下降。实施例2、TAIL-PCR引物设计在巴龙霉素基因的3’序列端设计特异性引物SpO和Spl，设计针对于莱茵衣藻的兼并引物LAD-5-RMD227，兼并引物中去除NotI酶切位点，降低引物合成成本。合成表I所示的各引物。其中LAD1、LAD2、LAD3、LAD4和LAD-5-RMD227均为兼并引物。表IPCR扩增所用弓I物序列
权利要求
1.序列表的序列I所示DNA、序列表的序列2所示DNA、兼并引物和序列表的序列8所示DNA组成的引物组合物；所述兼并引物为针对莱茵衣藻的基因组DNA的兼并引物。
2.如权利要求I所述的引物组合物，其特征在于所述兼并引物为序列表的序列7所示DNA、序列表的序列3所示DNA、序列表的序列4所示DNA、序列表的序列5所示DNA或序列表的序列6所示DNA。
3.一种获得莱茵衣藻突变体的基因组DNA中巴龙霉素编码基因的插入位点的方法，包括如下步骤(1)提取莱茵衣藻突变体的基因组DNA；(2)以基因组DNA为模板，用序列表的序列I所示DNA和所述兼并引物作为引物进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物；(3)以第一轮PCR扩增产物为模板，用序列表的序列2所示DNA和序列表的序列8所示 DNA作为引物进行第二轮PCR扩增，得到第二轮PCR扩增产物；(4)将第二轮PCR扩增产物进行测序，通过与野生型莱茵衣藻的基因组序列进行比对， 得到莱茵衣藻突变体的基因组DNA中巴龙霉素编码基因的插入位点；所述莱茵衣藻突变体是在莱茵衣藻中导入PSI103质粒得到的突变体。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述第一轮PCR扩增的反应条件如下(1)93。。2分钟；(2)95 0C I 分钟；(3)940C 30 #, 680C I 分钟，72°C 3 分钟，11 个循环；(4)940C 30秒，25 0C 2分钟，以0. 5度/秒的速度升温至72 °C，72°C 3分钟；(5)94。。20#,68°C I 分钟，72°C 3 分钟，26 个循环；(6)72 0C 5 分钟。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述第二轮PCR扩增的反应条件如下(1)94。。20#, 670C I 分钟，72°C 3 分钟，2 个循环；(2)940C 20 #, 680C I 分钟，72°C 3 分钟，94°C 20 秒，68°C I 分钟，72°C 3 分钟，94°C 20 秒，50 0C I分钟，72 0C 3分钟，14个循环；(3)72 0C 5 分钟。
6.权利要求I或2所述引物组合物在获得莱茵衣藻突变体的基因组DNA中巴龙霉素编码基因的插入位点中的应用。
7.权利要求I或2所述的引物组合物在辅助鉴定莱茵衣藻的基因组DNA中各基因功能中的应用。
8.权利要求3或4或5所述方法在辅助鉴定莱茵衣藻的基因组DNA中各基因功能中的应用。
9.一种辅助鉴定莱茵衣藻的基因组DNA中各基因功能的试剂盒，包括PSI103质粒和权利要求I或2所述引物组合物。
全文摘要
本发明公开了一种用于扩增产氢微藻莱茵衣藻插入突变基因侧翼序列的引物及方法。本发明提供了序列表的序列1、序列2所示DNA、兼并引物和序列表的序列8所示DNA组成的引物组合物；所述兼并引物为针对莱茵衣藻的基因组DNA的兼并引物。应用本发明提供的引物组合物可以获得莱茵衣藻突变体的基因组DNA中巴龙霉素编码基因的插入位点。本发明提供的方法，将设计的两条特异性引物与TAIL-PCR所用的简并引物进行组合，在优化的PCR反应条件下，可高效特异的扩增插入突变基因侧翼序列。本发明对高通量克隆莱茵衣藻基因、研究基因功能具有重要意义。
文档编号C12Q1/68GK102604937SQ20111002660
公开日2012年7月25日 申请日期2011年1月25日 优先权日2011年1月25日
发明者杨浩萌, 赵磊, 陈梅, 黄芳 申请人:中国科学院植物研究所